专利摘要

本发明公开了一种古代酒体多孔陶瓷材料残留物的提取方法,采用乳酸和乙酸作为黄酒的主要标定物，采用的模拟样品为粗泥或细泥捏制的杯子，未经烧制，在不同的酒中浸泡半年以上。先是根据文献中提供的有机酸提取方法和条件对模拟样品中的残留物进行提取，然后对提取样品进行定性分析，确定是否得到我们理想的标定物‑乳酸，证实提取方法可靠有效。探索到有效的提取方法之后，采用响应面法对提取方法进行优化，对模拟样品进行不同提取剂、温度、时间条件下的提取，完成一系列实验，然后加入苹果酸作为内标物,通过液相色谱检测得到的乳酸和苹果酸的峰面积比值来定性和定量，最后通过软件DesignExpert处理数据以得到提取的最佳条件。

权利要求

1.一种古代酒体多孔陶瓷材料残留物的提取方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)称取0.01g～0.1g陶罐碎片，在室温下风干，用玛瑙研钵将其研磨成粉末，加入到圆底烧瓶中；

(2)接着，将乙醇所占总体积的比例5％～20％的乙醇水溶液加入圆底烧瓶中，震荡使浸透充分，加上冷凝管，70～80℃超声水浴萃取，时间为30～60min；

(3)萃取结束后，冷却至室温，对萃取液进行离心处理10～16min，取上清液，在4-6℃下保存；

(4)将提取液注入液相色谱-质谱仪联用检测，通过液相色谱图看出有机酸基本在t＝0.51位置出峰，而质谱图在t＝0.52位置也有强烈的信号，由此得出提取到了有机酸，同时通过质谱中检测m/z＝89乳酸的特征峰信号强烈，证明提取液中有黄酒的主要标定物乳酸的存在；

(5)采用响应面法按BOX设计的因素水平来对提取过程的三个因素进行实验，设定三因素为乙醇/水溶液、温度、时间，具体实验设计17组，重复上述步骤；

(6)对上述步骤(5)中17组实验所得到的提取液依次注入液相色谱，通过注入的乳酸和乙酸的标准样品的保留时间判断确实提取到了乳酸和乙酸，然后加入内标物苹果酸，计算乳酸或者乙酸与苹果酸的峰面积比值；

(7)对步骤(6)所得到的峰面积比值用design expert按二次模型进行线性回归分析，其方差中p值小于0.05可判断出模型适用，得到模型方程，以简化后的回归方程为基础，通过design expert软件得到提取过程的最优提取条件，即在30％的乙醇水比例，45℃下提取90min。

2.根据权利要求1所述的一种古代酒体多孔陶瓷材料残留物的提取方法，其特征在于，所述三因素乙醇所占总体积比例0～30％的乙醇/水溶液、温度45℃～85℃、时间30min～90min。

说明书

技术领域

本发明涉及一种古代酒残留物的提取方法，具体为提供一种根据快速溶剂提取法所提取的多孔陶瓷材料中的有机酸来鉴别黄酒的方法，适用于分析古代酒器残留物以及鉴别黄酒。

背景技术

酒与人类的生活密切相关，酒的起源、发展和贸易，反映着古代社会政治、经济和科技等方面的丰富信息，因此人们常将酒文化视为古代文明的重要组成部分。但是，除了有文献记载证实为酒器的青铜器之外，其他盛器——尤其是新石器时代的陶器，并没有直接证据能够证明其确为酒器，这就给器物功能判断、酿酒起源研究带来了困难，对此存在不同看法。

国外的相关研究指出，陶器为多孔材料，对曾经装酒的陶器，往往能吸附难以挥发的酒石酸或酒石酸盐，如从陶片中萃取出来的有机物包含酒石酸，常可推测相应陶器和酿酒或盛酒相关。2005年山西省绛县西周倗国墓地发掘出土的两个酒器铜盉和铜觯中，我们发现器物内壁与填土的接触面有一黑色薄层，对此用快速溶剂萃取法提取有机残留物，进而再利用HPLC进行定性分析，发现其中含有酒石酸，说明它们下葬时有可能盛有酒。GuaschJane等人用LC/MS/MS(液质联用)分析图坦卡蒙墓中双耳细颈罐(amphorae)中的酒残留物，根据残留物颜色以及红葡萄酒的标志物为酒石酸和丁香酸，发现墓中白葡萄酒和红葡萄酒分开摆放，可能有特殊的目的。不难理解，随着水、酒精的自然蒸发和挥发，残留酒石酸有可能沉淀在内器壁表面。墓室崩塌、陶器积土后，直接接触内器壁的土壤也将吸附有酒石酸。由于古代液态酒出土的几率甚小，因此分析陶器内土壤的有机残留物，借以探索陶器与酒的关系，不失为理想的选择。

但是，很少有研究具体探索出一种完整的方法，用以提取和分析古代酒体多孔陶瓷材料中的残留物，也很少有研究致力于具体鉴别古代三大酒体(葡萄酒、黄酒、白酒)中的黄酒。这可能是由于以下原因导致的：一、陶瓷材料的组成和纹理不同，导致残留物的吸收和残留程度不同，同时由于考古样品的未知性，我们难以得知是否有残留物被吸收以及何种残留物被吸收，这就造成标定物的选择有一定的难度；二、考古样品历经千百年，环境的湿度、温度以及微生物的腐蚀都会影响残留物的分析；三、考古样品中残留物含量比较小，这就对残留物的检测有一定的精度要求。因此本提取分析方法在考古样品的研究和古代酒的分析中都有十分广阔的应用前景。

发明内容

为了克服上述现有技术不足，本发明提出一种古代酒体多孔陶瓷材料残留物的提取方法，整个过程简易可行，提取条件易于调控，提取剂廉价无毒害，检测条件不苛刻，可用于古代酒器残留物的分析以及黄酒的鉴别。

本发明的技术方案是这样解决的：

一种古代酒体多孔陶瓷材料残留物的提取方法，具体步骤如下：

(1)称取0.01g～0.1g陶罐碎片，在室温下风干，用玛瑙研钵将其研磨成粉末，加入到圆底烧瓶中；

(2)接着，将乙醇所占总体积的比例5％～20％的乙醇水溶液加入圆底烧瓶中，震荡使浸透充分，加上冷凝管，70～80℃超声水浴萃取，时间为30～60min；

(3)萃取结束后，冷却至室温，对萃取液进行离心处理10～16min，取上清液，在4-6℃下保存；

(4)将提取液注入液相色谱-质谱仪联用检测，通过液相色谱图看出有机酸基本在t＝0.51位置出峰，而质谱图在t＝0.52位置也有强烈的信号，由此得出提取到了有机酸，同时通过质谱中检测m/z＝89乳酸的特征峰信号强烈，证明提取液中有黄酒的主要标定物乳酸的存在；

(5)采用响应面法按BOX设计的因素水平来对提取过程的三个因素进行实验，设定三因素乙醇所占总体积比例0～30％的乙醇/水溶液、温度45℃～85℃、时间30min～90min，具体实验设计17组，重复上述步骤；

(6)对上述步骤(5)中17组实验所得到的提取液依次注入液相色谱，通过注入的乳酸和乙酸的标准样品的保留时间判断确实提取到了乳酸和乙酸，然后加入内标物苹果酸，计算乳酸或者乙酸与苹果酸的峰面积比值；

(7)对步骤(6)所得到的峰面积比值用design expert按二次模型进行线性回归分析，其方差中p值小于0.05可判断出模型适用，得到模型方程，以简化后的回归方程为基础，通过design expert软件得到提取过程的最优提取条件，即在30％的乙醇水比例，45℃下提取90min。

本发明与现有技术相比具有显著的特点与进步：

本发明提出的提取分析古代酒体多孔陶瓷材料中的残留物的方法完整可行，提取条件易于控制，适用于提取酒类中所含有的大部分有机酸，同时本发明探索出了最佳提取条件，鉴于考古样品稀少珍贵，这对于考古样品的提取来说是十分必要的。同时，本发明也致力于探索出利用液相色谱检测有机酸的最佳条件，通过更换流动相、调节流动相pH、检测温度、检测波长、流速得到比较有利的检测条件，这为有机酸的检测也具有一定的指导意义。

附图说明

图1是本发明实施案例提供的提取液的超高效液相色谱图；

图2是本发明实施案例提供的提取液在全扫描状态下的质谱信号图；

图3是本发明实施案例提供的提取液在m/z为89(乳酸)的质谱信号图；

图4是本发明实施案例提供的有机酸混合标准样品的液相色谱检测图(依次对应为酒石酸、草酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸)；

图5是本发明实施案例提供的提取液的液相色谱检测图(两个尖锐的峰分别对应乳酸和乙酸)；

图6是本发明实施案例提供的温度-组成对乳酸提取量的影响；

图7是本发明实施案例提供的提取时间-组成对乳酸提取量的影响；

图8是本发明实施案例提供的二次模型预测值与实际值分析图；

图9是本发明实施案例提供的有机酸混合标准样品的超高效液相色谱图；

图10是本发明实施案例提供的有机酸混合标准样品的超高效液相色谱图；

图11是本发明实施案例提供的有机酸混合标准样品的超高效液相色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例进一步描述多孔陶瓷材料中有机酸的提取和检测方法。

而本发明中采用乳酸和乙酸作为黄酒的主要标定物，采用的样品均为模拟考古样品，这些模拟样品为粗泥或细泥捏制的杯子，未经烧制，在不同的酒中浸泡半年以上。大致的思路为：先是根据文献中提供的有机酸提取方法和条件对模拟样品中的残留物进行提取，然后对提取样品进行定性分析，确定提取到了理想的标定物-乳酸，以证实提取方法可靠有效。探索到有效的提取方法之后，采用响应面法对提取方法进行优化，对模拟样品进行不同提取剂、温度、时间条件下的提取，完成一系列实验，然后通过液相色谱进行检测来定性和定量，最后通过软件Design Expert处理数据以得到提取的最佳条件。

发明的技术方案具体如下：

(1)称取0.01g～0.1g陶罐碎片，在室温下风干，用玛瑙研钵将其研磨成粉末，加入到圆底烧瓶中；

(2)接着，将5％～20％(乙醇所占总体积的比例)乙醇水溶液加入圆底烧瓶中，震荡使浸透充分，加上冷凝管，70～80℃超声水浴萃取，时间为30～60min；

(3)萃取结束后，冷却至室温，对萃取液进行离心处理10～16min，取上清液，在4-6℃下保存；

(4)将提取液注入液相色谱-质谱仪联用检测，通过液相色谱图可以看出有机酸基本在t＝0.51位置出峰，而质谱图在t＝0.52位置也有强烈的信号，由此可以得出提取到了有机酸，同时通过质谱中检测m/z＝89(乳酸)的特征峰信号强烈，证明提取液中有黄酒的主要标定物乳酸的存在；

(5)采用响应面法按BOX设计所得的因素水平来对提取剂(0～30％乙醇/水溶液)、温度(45℃～85℃)、时间(30min～90min)三个因素安排实验，具体实验结构设计如表1所示，只改变这三个条件，其他实验步骤同上；

(6)对步骤(5)中得到的提取液注入液相色谱，通过注入乳酸和乙酸的标准样品可以通过保留时间判断出确实提取到了乳酸和乙酸，然后加入内标物苹果酸，计算乳酸(或者乙酸)与苹果酸的峰面积比值，如表1所示；

(7)对步骤(6)所得到的数据用design expert按二次模型进行线性回归分析，通过p值小于0.05判断出模型适用，得到模型方程，如表2所示。以简化后的回归方程为基础，通过design expert软件得到其建议最优的提取条件，即在30％的乙醇水比例，45℃下提取90min。

表1响应面法及各个实验条件下提取乳酸和乙酸量

本发明技术方案步骤(4)中对提取的样品进行初次定性通过液相色谱-质谱联用，具体的检测条件为：色谱柱温25～40℃，整体程序运行时间10～20min，色谱检测波长210nm到400nm。流动相由两个部分组成，组分A为含有0.1％甲酸的纯水溶液，组分B为乙腈。(水溶液中0.1％的甲酸是为了杀菌保存好色谱中而加入的，对实验结果不会有影响。)

表2响应面法对乳酸量二次模型的方差分析

本发明技术方案步骤(6)中对提取的样品定性和定量通过液相色谱实现，具体的检测条件为：流动相为pH＝2.0～2.9的KH2PO4-磷酸缓冲液，流速为0.5～1mL/min，色谱柱温25～40℃，色谱检测波长210～219nm。

本发明技术方案中对提取条件的优化以及最终数据的处理采用design expert软件进行。

本发明提出的方法的关键步骤在于提取条件的优化和检测条件的优化。通过控制提取剂的组成、温度和时间来提取最多的乳酸和乙酸，这一点对于考古样品来说是十分重要的，毕竟考古样品中的残留物是十分微量的。有机酸的检测过程中，流动相的选取，流动相的pH值会直接影响有机酸是否被检测得到。

提取阶段的实施例1

(1)称取0.01g陶罐碎片，在室温下风干。用玛瑙研钵将其研磨成粉末，加入到圆底烧瓶中；

(2)接着，将配置好的乙醇水(体积比15:85)溶液加入圆底烧瓶中，震荡使浸透充分。加上冷凝管，85℃超声水浴萃取，时间为90min；

(3)萃取结束后，冷却至室温，对萃取液进行离心处理10～16min。取上清液，在4-6℃下保存；

(4)对提取液注入超高效液相色谱-质谱联用仪进行检测。

提取阶段的实施例2

(1)称取0.01g陶罐碎片，在室温下风干。用玛瑙研钵将其研磨成粉末，加入到圆底烧瓶中；

(2)接着，将配置好的乙醇水(体积比10:90)溶液加入圆底烧瓶中，震荡使浸透充分。加上冷凝管，45℃超声水浴萃取，时间为90min；

(3)萃取结束后，冷却至室温，对萃取液进行离心处理离心10～16min。取上清液，在4-6℃下保存；

(4)对提取液采用超高效液相色谱-质谱联用仪进行检测。

采用提取阶段的实施案例1和实施案例2得到不同提取条件下的多孔陶瓷材料中的酒液残留物，通过超高效液相色谱-质谱联用仪进行检测均得到如图1、图2、图3所示结果，通过强烈的乳酸(m/z＝89)峰信号可以证明提取方法可靠有效。通过对不同提取条件的探索试验，综合处理试验数据得到图6、图7、图8所示结果，反映出提取剂中乙醇比例、温度、时间对乳酸提取量的影响，通过响应面法二次模型的方差分析，可以看出溶剂组成对乳酸的提取量影响比较显著，而温度和提取时间对乳酸的提取影响不显著，溶剂组成和时间相互影响乳酸的提取量也比较显著。由此模型在design expert软件中建议的提取乳酸的最佳条件是在30％的乙醇水比例，在45℃下提取90min。

检测阶段的实施案例1：

液相色谱检测条件：流动相为pH＝2.85的KH2PO4-磷酸缓冲液，流速为0.8mL/min，柱温30℃；

检测阶段的实施案例2：

液相色谱检测条件：流动相为pH＝2.7的KH2PO4-磷酸缓冲液，流速为0.8mL/min，柱温40℃；

检测阶段的实施案例3：

液相色谱检测条件：流动相为pH＝2.9的KH2PO4-磷酸缓冲液，流速为1mL/min，柱温30℃；

图9、图10显示，流速为0.8mL/min，30℃或者40℃下检测均不能得到有效的液相色谱图，有部分峰型过宽，个别峰与峰之间没有得到有效的分离，拖尾严重，效果并显著。后调整为pH＝2.9的KH2PO4-磷酸缓冲液，流速为1mL/min，柱温21℃；便得到如图11所示的有机酸分离图，有机酸峰型尖锐，且有效分离，效果相对来说比较好。

一种古代酒体多孔陶瓷材料中黄酒残留物的鉴定方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。