专利摘要

本发明提供了莲心总生物碱在制备治疗病毒性心肌炎的药物中的用途。本发明药物用于治疗病毒性心肌炎，不论是急性期还是慢性期均有较好的疗效，并且中医药有疗效巩固、持久、毒副作用较少、价格便宜。

权利要求

1.莲心总生物碱在制备治疗病毒性心肌炎的药物中的用途。

2.莲心总生物碱在制备抗柯萨奇病毒的药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的柯萨奇病毒是柯萨奇病毒B型。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的柯萨奇病毒是柯萨奇病毒B3m。

5.根据权利要求1-3任意一项所述的用途，其特征在于：所述的莲心总生物碱来源于睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的成熟种子中干燥幼叶及胚根。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的莲心总生物碱中总生物碱的重量百分含量在70%以上。

7.根据权利要求1-4任意一项所述的用途，其特征在于：所述的药物是以莲心总生物碱为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述的制剂是片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的滴丸中甲基莲心碱的重量百分含量不低于40%，异莲心碱的重量百分含量不低于12%，莲心碱的重量百分含量为低于12%。

说明书

技术领域

本发明涉及莲心总生物碱的新用途。属于药物领域。

背景技术

病毒性心肌炎是指由柯萨奇病毒、埃可(ECHO)、脊髓灰质炎、流感病毒感染引起的心肌局限性或弥漫性的急性或慢性炎症病变，属于感染性心肌疾病。由柯萨奇病毒感染引起者约占40%。其它病毒有：埃可(ECHO)，脊髓灰质炎，流感、副流感病毒，麻疹，腮腺炎，乙型脑炎、肝炎病毒，带状疱疹病毒、巨细胞病毒、艾滋病毒、传染性单核细胞增多症等。病毒作用于心肌的方式是直接侵犯心肌以及心肌内小血管损伤。由免疫机制产生心肌损害在心肌炎的发病中起着重要作用。病毒的直接侵害和免疫反应介导致使心肌细胞损害，使心脏舒缩功能障碍；病变若累及窦房结、房室结、束支等起搏或传导系统，则可引发各种类型的心律失常。临床主要表现为病人常先有发热、全身酸痛、咽痛、倦怠、恶心、呕吐、腹泻等症状，然后出现心悸、胸闷、胸痛或心前区隐痛、头晕、呼吸困难、浮肿，甚至Adams-Stokes综合征；极少数患者出现心力衰竭或心源性休克。

莲心来源为睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）的成熟种子中干燥幼叶及胚根。主产地福建、湖南等。莲子心化学成分主要有：莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱外，还含荷叶碱、前荷叶碱及水溶性生物碱莲心季铵碱，S-N-甲基乌药碱(S-N-methyIisococlaurine)及dl-杏黄罂粟碱(dl-armepavine)。莲子心中除含生物碱外,还含黄酮类成分：芦丁、金丝桃苷、木犀草素等化合物；近年来又从莲子心的弱极性部位分离得到棕榈酸、β-谷甾醇、β-谷甾醇-3-o-β-D-葡萄糖甙、β-谷甾醇正辛烷酸酯及β-谷甾醇棕榈酸等7个化合物。其中β-谷甾醇正辛烷酸酯及β-谷甾醇棕榈酸系首次自该植物中分得。从莲子心胚芽中分离得到多种挥发油成分：透明质酸、十五烷酸、软脂酸、十七烷酸、亚油酸、硬脂酸、花生酸、二十一烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸、角鲨烯等。此外莲子心中还含有叶绿素、水溶性多糖及锌、铜、铁、钙、镁钠、钾、镍、锰、镉等微量元素。目前报道的莲心总生物碱文献较多，如：柳伟，等，莲子心总生物碱滴丸的制备工艺及含量测定，中国中药杂志，2007年4月第32卷第7期，报道了莲子心总生物碱主要成分为甲基莲心碱、异莲心碱及莲心碱等3种双苄基异喹啉类生物碱,可用于治疗由心肌缺血、冠心病等多种心脏疾病引发的心律失常症状。李娟，等，莲心生物碱保健功能研究进展，粮食与油脂，2010年第1期，报道了莲心生物碱具有降压、抗氧化、保护心肌等多种药用及保健功能。

发明内容

本发明的技术方案是提供了莲心总生物的新用途。

本发明提供了莲心总生物碱在制备治疗病毒性心肌炎的药物中的用途。

本发明还提供了莲心总生物碱在制备抗柯萨奇病毒的药物中的用途。其中，所述的柯萨奇病毒是柯萨奇病毒B型。进一步优选地，所述的柯萨奇病毒是柯萨奇病毒B3m。

其中，所述的莲心总生物碱来源于睡莲科植物莲（Nelumbo nucifera Gaertn.）的成熟种子中干燥幼叶及胚根。

其中，所述的莲心总生物碱中总生物碱的重量百分含量在70%以上。

其中，所述的药物是以莲心总生物碱为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

其中，所述的制剂是片剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸。

其中，所述的滴丸中甲基莲心碱的重量百分含量不低于40%，异莲心碱的重量百分含量不低于12%，莲心碱的重量百分含量为低于12%。

本发明药物用于治疗病毒性心肌炎，不论是急性期还是慢性期均有较好的疗效，并且中医药有疗效巩固、持久、毒副作用较少、价格便宜。

具体实施方式

实施例1本发明莲心总生物碱的提取工艺

莲子心2kg，粉碎后用80%乙醇(8倍量)冷浸12h，以电动搅拌机搅拌提取3次，每次2h。合并乙醇液，减压回收溶剂至适当体积，抽滤。滤液用1%盐酸调pH至2-3，过滤，滤液再用氨水调pH至9-10，氯仿萃取数次，合并氯仿液，蒸去溶剂，减压干燥24h至恒重得黄色固体物总碱20g。得莲心总生物碱。

实施例2本发明莲心总生物碱的提取

莲子心药材，粉碎，加入0.2%HCL/30%乙醇为溶剂，6倍溶剂量，提取3次，每次1h。选择D101-A大孔吸附树脂纯化莲子心总生物碱，先以蒸馏水、15%乙醇洗脱4倍树脂体积去除水溶性杂质后，用70%乙醇洗脱4倍树脂体积富集总生物碱，减压蒸去溶剂，干燥至恒重。莲子心总碱提取液经大孔树脂纯化处理后，精制得率最高，且总生物碱含量在70%以上，得莲心总生物碱。

实施例3本发明莲心总生物碱滴丸的制备

莲心总生物碱提取物（实施例1或实施例2制备）与含70％PEG4000基质比例为1：5，药液温度85℃，冷却液为二甲基硅油，冷却温度10℃，冷却柱长为80cm，滴距3.5cm，滴速25滴/min。应用高效液相色谱法测定，甲基莲心碱平均含量为不得低于40%，异莲心碱平均含量为不得低于12%，莲心碱平均含量不得低于12%。

本制剂可为片剂，胶囊剂，软胶囊剂（胶丸剂），丸剂等药学可供给药的形式。

除了实施例1和实施例2制备的莲心总生物碱外，还包括采用目前文献报道的方法制备的莲心总生物碱。

以下通过具体临床试验和药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1本发明药物治疗病毒性心肌炎临床疗效观察

1资料与方法

1.1临床资料选择在福建中医药大学附属人民医院住院病毒性心肌炎（VMC）患者60例，男27例、女33例，年龄8～39(21.3±3.5)岁，病程1个月～2.5a、平均0.55a。均符合1999年全国心肌炎心肌病专题研讨会修订的VMC诊断标准，病前1～3周有急性病毒感染史，主要临床表现为发热、心悸、胸闷痛、气短、乏力及心律不齐；心电图示窦性心动过速、非特异性复极及室内传导阻滞；超声心动图示心脏扩大和心肌收缩功能不全；心肌酶谱增高，心肌活检有特征性炎症改变。参照《中药新药治疗病毒性心肌炎临床研究指导原则》标准诊断为VMC，且符合中医辩证的邪伤气阴、气阴两虚、阴阳两虚证候。排除甲亢、β受体功能亢进及其他心脏疾病，妊娠及哺乳期妇女，有药物过敏史或过敏体质者。将患者随机分为治疗组、对照组各30例，两组临床资料有可比性。

1.2治疗方法对照组静滴极化液(10％葡萄糖液500ml+胰岛素8U+10％氯化钾10m1)，1次/d；口服辅酶Q₁₀10mg、维生素C0.2g，3次/d；酌情使用一般抗心律失常药，疗程为4周。治疗组口服药物组（实施例3）4粒/次、4次/d；酌情使用一般抗心律失常药，疗程为4周。治疗期间，观察两组临床表现、24h动态心电图、心肌酶学及心功能变化。参照《中药新药治疗病毒性心肌炎临床研究指导原则》的疗效标准判定疗效。

1.3检测方法①24h动态心电图检查：采用Holter检测两组24h动态心电图。②心肌酶学检测：采用全自动生化分析仪检测两组乳酸脱氢酶(LDH)及肌酸激酶同工酶(CK．MB)。③病毒抗体检测：采用ELISA法、IgM酶联免疫检测试剂盒检测两组柯萨奇B病毒抗体。④心功能检测：采用彩色多普勒超声心动检测两组左心射血分数(LVEF)及心排血指数(CI)。

1.4统计学方法采用SPSS11.0统计软件，数据用 表示，计量资料比较用t检验，计数资料比较用检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1临床疗效治疗组明显好转或好转28例，无效2例，有效率93．3％；对照组分别为20、10例，有效率66.7％。治疗组有效率明显优于对照组(P<0.05)。

2.224h动态心电图表现治疗组早搏好转或恢复14例，ST-T改变恢复11例，房室传导阻滞改善8例；对照组分别为7、4、5例。两组比较均有统计学差异(P<0.05或<0.01)。

2.3实验室检查转阴情况，治疗组治疗前柯萨奇B抗体阳性23例，治疗后转阴19例；对照组分别为21、l0例。两组比较有统计学差异(P<0.05)。两组治疗前后心肌酶变化见表1。

表1两组治疗前后心肌酶变化(U／L， )

注：与对照组治疗后比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4心功能变化治疗组治疗前后LVEF、CI分别为(43.97±6.95)％、2.5±0.8，(57.98±6.81)％、3.5±0.7；对照组分别为(44.15±5.84)％、2.6±0.8，(53.11±8.15)％、3.2±0.5。两组治疗前比较均无统计学差异(P均>0．05)，治疗后比较均有统计学差异(P<0．05)。

试验例2本发明药物对柯萨奇病毒B3m感染Balb/c小鼠心肌炎治疗作用

材料

1．动物清洁级雄性Balb/c小鼠240只，4-6周龄，体质量（14±2）g。

2．病毒CVB3m（Nancy株），由美国ATCC引入。

3．仪器计算机图像分析仪（三高CMISA系列由北京航空大学图像中心和北京中山生物技术有限公司联合开发）；CO2培养箱（美国Nuaire-4950E）；酶标仪（Bio-RAD，Bench mark）；倒置显微镜（德国LECIA）；超低温冰箱（MDF382E，日本SONY）。

4．试剂DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Media）购自美国Gibco公司；胎牛血清（TBD0032HYP），购自美国Gibco公司。

方法

1．药物制备上述莲心总生物碱（实施例2）。

2．分组与造模将288只Balb/c小鼠随机分为6组，即药物组高中低三种剂量组、阳性组，病毒性心肌炎的模型组和正常对照组。每组均为48只。模型组和药物治疗组均腹腔注射0.1mL半数组织感染量（tissue culture infective dose，TCID50）的CVB3m病毒液，正常组予等量不含病毒的培养液腹腔注射。

3．给药造模同时治疗组按（以原生药材计10g莲心药材/kg）给予药物灌胃，阳性组给药剂量为50mg/kg（病毒唑）；模型组和正常组分别予以等量蒸馏水灌胃，连续灌胃14d。

4．实验指标

4.1观察一般状态每天观察各组小鼠的皮毛、大便、精神状态，定期测量体质量。

4.2计算存活率小鼠14d存活率=各组存活小鼠数/各组小鼠总数×100%。

4.3取材造模第3、5、7、10、14d每组随机取6只，称重；取心脏，用滤纸吸去心脏组织的残余血液和组织液，进行精密称重，计算心脏/体质量(%)=心脏质量（g）/体质量（g）×100％。沿左心室轴纵向切开，心脏右半部放入EP管中，迅速置于冰壶中保存备用；其余部分用4%多聚甲醛固定用于病理组织学检测。

4.4心肌组织CVB3m病毒滴度测定取心脏右半部分用眼科剪刀剪碎，研磨，4℃2000r/min离心10min，取上清夜，用蛋白-核酸分析仪测定蛋白浓度，取0.2mL从10^-1至10^-8倍比稀释，接种于长成单层Hela细胞的微量细胞培养板上，37℃培养48h，观察细胞病变，采用Reed-Muench法测定心肌组织中病毒的TCID50，计算心肌匀浆液的病毒滴度。

4.5心肌病理组织学检测将心肌组织制成病理切片，置显微镜下观察。采用图像分析系统，分别测心肌总面积和病变总面积及病灶总数，计算病理积分=病变总面积/所测心肌总面积×100。

5血清心肌酶测定

各组小鼠摘眼球取血，轻轻摇匀，于4℃,3000r/min离心10min，分离血浆，用酶标仪测定血清中天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等的含量，按照试剂盒说明书操作。

6．统计学方法采用SPSS11.5医学统计软件进行分析，计量资料以 表示，3组的计量资料采用单因素的方差分析，两两比较采用LSD分析方法。

计数资料的率分析采用χ²检验。

结果

1．对小鼠一般状态的影响模型组第3d小鼠活动减少，食量减少，皮毛污秽，部分小鼠出现腹泻。第5-7d小鼠精神萎靡，少动蜷卧，体质量明显减轻，小鼠死亡数明显增多。第10-14d存活小鼠状态逐渐好转，未再见有小鼠死亡。各给药组小鼠皮毛、活动、饮食情况明显优于模型组。

2．对小鼠体质量的影响见表2。造模前，各组小鼠体质量无显著性差异。模型组小鼠感染病毒后体质量呈现下降趋势；各治疗组体质量在感染后也出现不同程度下降，但下降幅度低于模型组（P＜0.05），但低剂量组与模型组相比无显著性。3组间各时间点的体质量差异不显著。

表2各组小鼠体质量变化情况（ n=6，g）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3．对小鼠存活率的影响见表3。3个不同剂量给药组的小鼠存活数明显多于模型组。第14d模型组的存活率为68.75%，高剂量组为87.5%，中剂量组为89.58%，低剂量组为79.17%，3个治疗组的存活百分率均高于模型组，具有显著性差异(P＜0.05＝；3组间的存活率差异不显著。

表3各组小鼠14d内存活率（n=48，%）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

4．对小鼠心肌内病毒滴度的影响见表4。3个剂量组药物在感染后的病毒滴度明显均不同程度低于病毒组（P＜0.05，P＜0.01）。

表4各3组小鼠心肌内病毒滴度比较（LogTCID50）（ n=6）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；

5．对小鼠心脏质量的影响见表5。模型组的心脏质量/体质量比值与正常组比较极显著增高（P＜0.01）。3个治疗组的心脏质量/体质量的比值与模型组相比，极显著降低（P＜0.01），3个治疗组间的心脏质量/体质量的比值差异不显著（P＞0.05）

表5各组小鼠心脏质量（ n=30）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

6．对小鼠心肌病理改变的影响见表6。正常组心肌细胞排列整齐，无炎性细胞浸润。病毒模型组可见心肌细胞肿胀，炎性细胞浸润，严重可见病变范围增大，或呈多灶性分布，出现心肌细胞坏死，甚则可累及心外膜。3个治疗组的心肌病理积分显著低于模型组（P＜0.05，P＜0.01）。中剂量组和高剂量组病变比值显著低于低剂量组（P＜0.05）。

表6各组小鼠心肌病理积分比较（ n=30）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；

7.血清心肌酶测定结果感染病毒后，小鼠血清中AST、CK、LDH、CK-MB含量均升高。与M组比较，各给药组的上述指标活性明显下降。从两次的检测结果显示各种药物的疗效从优到次的顺序为：SM>SH>SL组，其中SM、SH组降低LDH、CK、CK-MB水平疗效显著，与M组比较有差异P＜0.05（见表7）表7莲心提取物对急性病毒性心肌炎小鼠血清心肌酶的影响(n=10，U/L， )

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

综上所述，通过临床试验证明，本发明药物用于治疗病毒性心肌炎（VMC），药效明显，有效率达93.3％；通过动物试验证明，本发明药物可提高小鼠存活率，心脏质量，对柯萨奇病毒B3m感染Balb/c小鼠心肌炎治疗效果显著，为临床提供了一种的新的用药选择。

莲心总生物碱在制备治疗病毒性心肌炎的药物中的用途专利购买费用说明

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A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

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Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

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