IPC分类号 : A61K9/08,A61K47/38,A61K47/26,A61K31/702,A61K31/722,A61P3/04
专利摘要
本发明涉及口服液技术领域，提供了一种壳寡糖口服液及其在制备减肥药物中的应用，所述口服液包括以下重量份数计的原料：壳寡糖30～45份、防腐剂1～2份、缓冲剂0.5～1.5份、矫味剂1～3份和稳定剂5～8份。本发明制备的壳寡糖口服液吸收快，奏效迅速，安全有效，制剂稳定，质量和疗效稳定，适用于工业化生产。
权利要求
1.一种壳寡糖口服液，其特征在于，所述口服液包括以下重量份数计的原料：壳寡糖30～45份、防腐剂1～2份、缓冲剂0.5～1.5份、矫味剂1～3份和稳定剂5～8份；所述稳定剂由L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠组成，所述L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠的质量比为4:1；
所述的壳寡糖口服液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取纯化水适量，按照处方量加入壳寡糖、防腐剂和稳定剂，在恒温空气浴中振摇至溶解包合完全，再加入矫味剂，最后加入缓冲剂调节pH至4.5～8.5，即可；
所述缓冲剂调节口服液的pH值6.5。
2.根据权利要求1所述的壳寡糖口服液，其特征在于，所述防腐剂为苯甲酸钠和山梨酸钾中的一种或两种。
3.根据权利要求1所述的壳寡糖口服液，其特征在于，所述缓冲剂为柠檬酸-柠檬酸钠、冰醋酸中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的壳寡糖口服液，其特征在于，所述矫味剂为阿司帕坦和木糖醇中的一种或两种。
5.根据权利要求1～4任一所述的壳寡糖口服液在制备减肥药物中的应用。
说明书
技术领域
本发明涉及口服液技术领域，尤其是涉及一种壳寡糖口服液及其在制备减肥药物中的应用。
背景技术
肥胖是指一定程度的明显超重与脂肪层过厚，是体内脂肪，尤其是甘油三酯积聚过多而导致的一种状态。由于食物摄入过多或机体代谢的改变而导致体内脂肪积聚过多造成体重过度增长并引起人体病理、生理改变或潜伏。在过去的50年里，肥胖的患病率在世界范围内呈上升趋势，达到大流行程度。肥胖是一个重大的健康挑战，因为它大大增加了2型糖尿病、脂肪肝、高血压、心肌梗塞、中风、痴呆、骨关节炎、阻塞性睡眠呼吸暂停和一些癌症的风险，因此导致生活质量和预期寿命下降，从而成为全球普遍关注的公共健康问题。
由于肥胖可以导致严重的健康问题，因此肥胖症的防治也就成为医药学界进行研究的重要课题，虽然医学界普遍认为改善生活方式、合理饮食，加强运动是减肥的主要措施，但也认为对于过度肥胖患者经合理饮食、运动治疗未能达到满意控制者，可首选药物治疗。
自19世纪末开始使用药物治疗肥胖至今，已经有较多的减肥药物陆续上市，但普遍存在着疗效不稳定，功效成份不明，难以在国际市场销售等问题。临床使用的各种化学减肥药，虽然有一定的疗效，但大多数有一定的副作用。
壳寡糖(COS)是自然界中唯一带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖，是动物性纤维素,其分子结构式为： 壳寡糖是由来源于虾蟹壳的壳聚糖降解成的带有氨基的小分子寡糖，是聚合度2-20的糖链。由于分子机构上含有数量极多的氨基、乙酰氨基以及羟基等活性化学基团，COS具备良好的可塑性和众多生理活性，COS具备各种有益的生物活性，如抗细菌，抗炎症，抗氧化，降脂，抗糖尿病，加速体内钙和铁的吸收、降低血糖以及促进关节组织的修复等功能，壳寡糖已成为国际上新兴的一种功能性低聚糖。
壳寡糖由甲壳素降解而来，其水溶性好，低粘度，分子量小，容易吸收利用及可降解，但是在壳寡糖制剂生产中，容易出现分层、浑浊、沉淀等现象，使得壳寡糖制剂稳定性不佳，因此，研制出一种新的壳寡糖剂型，解决制剂不稳定的技术问题，以充分发挥减肥功效，具有重大意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的第一目的在于提供一种壳寡糖口服液，吸收快，奏效迅速，安全有效，制剂稳定，质量和疗效稳定，适用于工业化生产，且制备工艺严格。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种壳寡糖口服液，所述口服液包括以下重量份数的原料：壳寡糖30～45份、防腐剂1～2份、缓冲剂0.5～1.5份、矫味剂1～3份和稳定剂5～8份。
优选地，所述稳定剂为L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠中的至少一种。
更优选地，所述稳定剂由L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠组成，所述L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠的质量比为4:1。
优选地，所述防腐剂为苯甲酸钠和山梨酸钾中的一种或两种。
优选地，所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠、冰醋酸中的一种或两种。
优选地，所述缓冲液调节口服液的pH值为4.5～8.5。
优选地，所述矫味剂为阿司帕坦和木糖醇中的一种或两种。
本发明的第二目的是提供了一种壳寡糖口服液的制备方法，包括以下步骤：取纯化水适量，按照处方量加入壳寡糖、防腐剂和稳定剂，在恒温空气浴中振摇至溶解包合完全，再加入矫味剂，最后加入缓冲剂调节pH至4.5～8.5，即可。
优选地，所述pH值调节至6.5。
本发明的第三目的是一种壳寡糖口服液在制备减肥药物中的应用。
羧甲基纤维素钠是纤维素的羧甲基化衍生物，具有吸湿性，乳化稳定性，易于分散在水中形成透明的胶体溶液，是一种优秀的乳化剂。在壳寡糖制剂生产过程中，由于口服液在长时间放置过程中容易出现分层、浑浊、沉淀等现象，本发明人尝试将羧甲基纤维素钠添加至壳寡糖口服液中，发现短时间内壳寡糖口服液的稳定性大大增强，口服液不发生分层、浑浊和沉淀等现象，但是经过长时间放置观察，壳寡糖口服液出现了原料挂壁现象，可能是因为羧甲基纤维素钠形成胶体溶液的粘度太大，使得壳寡糖出现了挂壁现象，导致壳寡糖的质量下降。
本发明经过大量的研究探索，发现将L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠复配，可使得壳寡糖口服液不出现挂壁现象，其还能增强其稳定性，本发明人进行了加速试验表明，本发明壳寡糖口服液在形状、鉴别、pH值、相对密度、装量差异、含量测定、微生物限度检查等方面都无明显变化。
在本发明中，将数均分子量不大于3000的壳寡糖命名为COSM，将数均分子量不大于1000的壳寡糖为COST，以示区分，用COSM制备的口服液为COSM口服液，COST制备的口服液为COST口服液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的壳寡糖口服液，吸收快，奏效迅速，安全有效，制剂稳定，质量和疗效稳定，适用于工业化生产。
2.本发明提供的壳寡糖口服液，将其应用于减肥药物当中，可以显著降低高脂饲料饮食性诱导肥胖C57BL/6小鼠体重增重，显著降低了高脂饮食导致的高脂肪含量和脂/体比；
3.本发明提供的壳寡糖口服液大大提高了患者用药的顺应性，增加了该药物的使用人群。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明作进一步详细说明。
实施例1、本发明壳寡糖口服液
配方：
制备方法：包括以下步骤：取纯化水适量，按照处方量加入壳寡糖、防腐剂、缓冲剂和稳定剂，在恒温空气浴中振摇至溶解包合完全，再加入矫味剂，最后调节pH至4.5，即可。
实施例2、本发明壳寡糖口服液
配方：
制备方法：包括以下步骤：取纯化水适量，按照处方量加入壳寡糖、防腐剂、缓冲剂和稳定剂，在恒温空气浴中振摇至溶解包合完全，再加入矫味剂，最后调节pH至5.5，即可。
实施例3、本发明壳寡糖口服液
配方：
制备方法：包括以下步骤：取纯化水适量，按照处方量加入壳寡糖、防腐剂、缓冲剂和稳定剂，在恒温空气浴中振摇至溶解包合完全，再加入矫味剂，最后调节pH至6.5，即可。
实施例4、本发明壳寡糖口服液
配方：
制备方法：包括以下步骤：取纯化水适量，按照处方量加入壳寡糖、防腐剂、缓冲剂和稳定剂，在恒温空气浴中振摇至溶解包合完全，再加入矫味剂，最后调节pH至8.5，即可。
实施例5、本发明壳寡糖口服液
配方：
制备方法：包括以下步骤：取纯化水适量，按照处方量加入壳寡糖、防腐剂、缓冲剂和稳定剂，在恒温空气浴中振摇至溶解包合完全，再加入矫味剂，最后调节pH至6.5，即可。
对比例1、本发明壳寡糖口服液
对比例1与实施例5相比，区别仅在于，配方中不含有羧甲基纤维素钠和L-岩藻糖，其他参数与实施例5相同。
对比例2、本发明壳寡糖口服液
对比例2与实施例5相比，区别仅在于，配方中不含有L-岩藻糖，其他参数与实施例5相同。
对比例3、本发明壳寡糖口服液
对比例3与实施例5相比，区别仅在于，配方中不含有羧甲基纤维素钠，其他参数与实施例5相同。
试验例一、稳定性试验
将实施例1～5及对比例1～3制备的壳寡糖口服液，置于常温(40±2℃)，常湿(75±5％)条件下放置3个月，在第0天、第30天、第60天和第180天，观察口服液是否出现挂壁现象和沉淀现象。结果见表1：
表1
根据表1可知，实施例1～5制备的壳寡糖口服液，180天后仍然不出现挂壁现象，同时壳寡糖口服液也没有出现分层、浑浊和沉淀等现象，对比例1制备的壳寡糖口服液在第0天便出现出现分层、浑浊和沉淀等现象，沉淀较为严重；对比例2(未添加L-岩藻糖)制备的壳寡糖口服液在一个月后出现挂壁等现象，但是不容易出现分层、浑浊和沉淀等现象；对比例3(未添加羧甲基纤维素钠)制备的壳寡糖口服液在第0天便出现出现分层、浑浊和沉淀等现象，分层、浑浊和沉淀现象严重，说明L-岩藻糖和羧甲基纤维素钠的复配，可以改善加入羧甲基纤维素钠至壳寡糖口服液出现挂壁现象的技术问题，且加入羧甲基纤维素钠的壳寡糖口服液不出现分层、浑浊和沉淀等现象，增强了壳寡糖口服液的稳定性。
试验例二、COST口服液和COSM口服液的含量测定
根据《中国药典》(2015)测定多糖的方法，选用苯酚-硫酸法测定COST口服液和COSM口服液中的主药含量。
1.1吸收曲线和氨基葡萄糖绘制：溶液制备：80％苯酚储备液：使用电子天平称取8.00g苯酚，加热熔融，用双蒸水定容于10mL的容量瓶中，即得80％的Phenol溶液，避光保存于4℃中，备用。
5％苯酚溶液：用移液器精密吸取80％苯酚储备液625ul，用双蒸水定容于10ml的容量瓶中，即得到5％苯酚储备液，现配现用。
10mg/mlGLC(盐酸氨基葡萄糖)标准溶液：用万分之一电子天平精密称取0.1049g盐酸氨基葡萄糖，用双蒸水溶解到10ml容量瓶中，定容即得到10mg/mlGLC标准溶液。
COST口服液和COSM口服液操作液：直接使用上述制备的口服液即可。
精密吸取0.4mL的10mg/mL的GLC标准液定容于10mL容量瓶中，得A溶液；取10mL试管，分别依次加入5％的苯酚溶液1.0mL、浓硫酸5.0mL，标准管加入A溶液2mL，空白管加入双蒸水2mL，以空白管为参比，扫描标准管溶液的吸收曲线，测得最大吸收波长，以空白试剂为参比时，COS在浓硫酸作用下脱水形成糠醛，接而与苯酚发生缩合反应生成的化合物的最大吸收峰在490nm波长处，因此，在后续的实验中选择测定波长为490nm。
精密吸取0mL，0.1mL，0.2mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL，0.8mL的10mg/mL的GLC标准液，用双蒸水分别定容于10mL容量瓶中，即得一系列梯度的标准液；接而从中精密吸取2.0mL于10mL的试管中，分别依次加入5％的苯酚溶液1.0mL，浓硫酸5.0mL，摇匀，沸水浴30-45min，静置冷却；待反应完全后与490nm波长下测定其吸光度，并绘制标准曲线。
1.2精密度试验
精密吸取适量同一份样品溶液，连续测定含量6次，计算RSD值，其RSD应不大于2.0％。
根据表2-1和表2-2，COST口服液样品溶液的平均含量为93.25％，RSD为1.59％，COSM口服液样品溶液的平均含量为96.41％，RSD为1.20％，说明该方法的精密度好。
表2-1 COST口服液精密度试验结果
表2-2 COSM口服液精密度试验结果
2.3稳定性试验
精密吸取同一份样品溶液，分别于0,、2、4、6、8、10、12h小时内测定含量，计算RSD值，其RSD应不大于2.0％。
根据表2-3和表2-4，COST口服液样品溶液的平均含量为93.40％，RSD为1.11％，COSM口服液样品溶液的平均含量为96.36％，RSD为1.70％，说明该方法比较稳定。
表2-3 COST口服液稳定性试验结果
表2-4 COSM口服液稳定性试验结果
2.4重复性试验
精密吸取同一批样品溶液6份，平行测定含量，其RSD应不大于2.0％。
根据表2-5和表2-6，COST口服液样品溶液的平均含量为93.46％，RSD为1.76％，COSM口服液样品溶液的平均含量为96.28％，RSD为1.65％，说明该方法重复性好。
表2-5 COST口服液重复性试验结果
表2-6 COSM口服液重复性试验结果
2.5加标回收率试验
精密吸取已知含量的COS样品溶液6份，加入定量的标准物质，测定总含量后计算加标回收率，其RSD应不大于2.0％。
根据表2-7和表2-8，COST口服液样品溶液加标回收率的平均值为100.01％，RSD为1.15％，COSM口服液样品溶液加标回收率的平均值为100.65％，RSD为1.66％，说明该方法的正确度高。
表2-7 COST口服液加标回收率试验结果
表2-8 COSM口服液加标回收率试验结果
2.6 COST口服液和COSM口服液的质量检查
2.6.1明度检查
光源用20W的日光灯，采用散棚式装置。背景用不反光的黑色物，底部用不反光的白色物。取灭菌后口服液置检查装置下，距光源20cm处，先与黑色背景对照，后与白色背景对照。用肉眼检视，不得有可见的不溶物或浑浊现象出现。
通过肉眼检视，COST口服液和COSM口服液未发现有不溶物或浑浊现象出现。
2.6.2微生物限度检查
除另有规定外，照非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)和控制菌检査法(通则1106)及非无菌药品微生物限度标准(通则1107)检查，应符合规定。
COST口服液和COSM口服液的需氧菌总数＜1(cfu/ml),符合指标；霉菌和酵母菌总数＜1(cfu/ml)，符合指标；未检出大肠埃希菌，符合指标；未检出沙门菌，符合指标；耐胆盐革兰阴性菌＜10(cfu/ml)符合指标。
表2-9 COST口服液微生物限度
表2-10 COSM口服液微生物限度
2.6.3含量检测
采用苯酚硫酸法，精密吸取样品溶液6份，平行测定含量，其RSD应不大于2.0％。
从表2-11和表2-12，COST口服液平均含量为93.37％，RSD为1.72％。COSM口服液平均含量为96.55％，RSD为1.45％。
表2-11 COST口服液含量检测结果
表2-12 COSM口服液含量检测结果
试验例三、壳寡糖口服液减肥降脂试验研究
1.材料和方法
1.1实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠(单位许可证号：SYXK(粤)2017-00125)，定购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，3-4周龄，出售单位许可证号：SCXK(湘)2016-0002。奥利司他胶囊(购买于重庆植恩药业有限公司)；D12492高脂饲料(购买于美国Research Diet公司)；饲料配方成分：酪蛋白，L-胱氨酸，玉米淀粉，麦芽糊精，蔗糖，纤维素，豆油，猪油，复合矿物质，磷酸氢钙，碳酸钙，柠檬酸钾，复合维生素，重酒石酸氢胆碱，蓝色染料。
1.2试验仪器
YB-6LF生物组织石蜡包埋机、YGQ-3126F生物组织切片机(孝感市亚光医用电子技术有限公司)；Spectra Max i3x型多功能酶标仪(美谷分子仪器(上海)有限公司)；总胆固醇(T-CHO)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、游离脂肪酸(FFA)试剂盒、葡萄糖(GLU)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；Bio-Radbiorad电泳仪(山东博科科学仪器有限公司)。
1.3动物造模
在温度为24±2℃，相对湿度为50％-60％，光照节律为12小时的实验动物中心SPF级环境下，用普通饲料适应性喂养C57BL/6小鼠2周后，随机分成两组，其中C57BL/6小鼠喂养普通饲料作为正常饮食组，剩下的C57BL/6小鼠喂养D12492高脂饲料(HFD，High fatdiet)。喂养2周后，按体重增重由高到低的顺序给D12492高脂饲料喂养小鼠排序，将体重增重较少肥胖抵抗的小鼠淘汰。剩下的C57BL/6小鼠维持高脂饲料喂养6周，同时，正常饮食组给予普通饲料喂养。高脂饲料喂养小鼠的体重超出正常饮食组小鼠的体重20％，即可判断为饮食性诱导肥胖模型造模成功。
1.4动物分组
正常饮食10只小鼠为空白组(Control)，将造模成功的肥胖小鼠随机挑选70只，随机分成七组(每组10只)：高脂模型组(Model)、奥利司他阳性对照组(Orlistat)、实施例1～5组，一共8组。
1.5给药方法
造模成功后，各给药组给予不同剂量的受试样品，空白组和模型组给与等量生理盐水进行灌胃。分别按照实施例1～5(1700mg/Kg)和Orlistat主药剂量(35mg/Kg)给每只C57BL/6小鼠进行灌胃，每只C57BL/6小鼠按照每10g体重给予0.lml的量进行灌胃。每周定时称量各组C57BL/6体重；每日定时观察C57BL/6精神状态、外表体征和生理状态有无异常。结果见表2。
表2 壳寡糖口服液对饮食性诱导肥胖小鼠体重的影响
注：与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Model组相比，#P<0.05，##P<0.01。
表3 壳寡糖口服液对C57BL/6肥胖小鼠脂肪的影响
注：与Control组相比，*P<0.05，**P<0.01；与Model组相比，#P<0.05，##P<0.01。
由表2可知，造模完成后，测得Control组的平均体重为24.29g，给予高脂饲料的C57BL/6小鼠体重均超过31.18g，大于20％，表明造模成功。在给药第8周时，Orlistat组、实施例1～5组均显著低于Model组，表明各给药组均能显著降低饮食性诱导的体重。相比于Model组，Orlistat组、实施例1～5的体重增长趋势均有所减缓。
由表3可知，Control组的脂肪垫和脂/体比均显著低于Model组；Orlistat组的脂肪垫和脂/体比显著低于Model组；与Model组相比，实施例1～5组的脂肪垫和脂/体比显著降低，表明实施例1～5组均显著降低了高脂饮食导致的高脂肪含量和脂/体比。
对内脏脂肪组织进行HE切片冰染色，对其进行观察。Control组的脂肪细胞结构正常，排列紧密，大小均一，数目较多，细胞体积较小，而Model组的白色脂肪组织细胞大小不均一，体积较大。给药之后，实施例1～5组较Model组脂肪细胞明显减小，大小均一，体积较小，病变的情况得到了较好的改善，说明了实施例1～5能够抑制因高脂饮食诱导的脂肪细胞肥大，改善脂肪细胞的生长以及扩增，减少脂肪积累，改善肥胖等症状。
对肝脏组织进行HE染色切片，对其进行观察。Control组小鼠的肝脏脂质积累很少，Model组小鼠的肝脏脂滴较多，脂质积累严重。实施例1～5组小鼠的肝脏脂滴含量和脂滴大小与Model组相比明显减少，脂质积累得到改善。
对小肠组织进行HE染色切片，对其进行观察。Control组小鼠的小肠绒毛高整，Model组小鼠的绒毛杂乱无章，肠道屏障受损严重，肠道通透性增加。实施例1～5组小鼠的肠道绒毛与Model组相比明显整齐，肠道受损得到改善。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：
凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
壳寡糖口服液及其在制备减肥药物中的应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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