专利摘要

本发明涉及一种文昌鱼人工催产鱼卵的方法，其特征在于：在文昌鱼产卵期间，采集雌、雄鱼有性腺发育的佛罗里达文昌鱼活体备用；将文昌鱼亲鱼移入装有催产海水1的微水流循环系统池进行催产养殖；此后依次更换催产海水为催产海水2、催产海水3、催产海水4、催产海水5，连续进行五个阶段的微水流循环催产养殖，催产养殖水温、养殖时间、微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同。文昌鱼经上述催产养殖后开始3～4d产卵、排精以及授精孵化过程。本发明采用不同藻类吸附不同激素喂养偶联微水流循环催产方法，结合改变光照条件，成功进行文昌鱼的人工催产、孵卵受精。与文昌鱼的自然状态产卵相比，提高了产卵率和受精卵率。

权利要求

1.一种文昌鱼人工催产鱼卵的方法，其特征在于：

1）亲鱼采集

在文昌鱼产卵期间，采集雌、雄鱼有性腺发育的佛罗里达文昌鱼(B .floridae)活体备用；

2）催产饵料藻液培养

（1）催产饵料藻液A的培养

按80～160重量份（克）：100体积份（毫升）：800体积份（毫升）的比例，将混合激素A、混合藻液A和海水混合进行吸附培养，经过6～10h吸附培养后，得到催产饵料藻液A；

（2）催产饵料藻液B的培养

按40～70重量份（克）：100体积份（毫升）：800体积份（毫升）的比例，将混合激素B、混合藻液和海水混合进行吸附培养，经过6～10h吸附培养后，得到催产饵料藻液B；

3）催产海水配制：

催产海水1配制:

将1重量份的催产饵料藻液A和10重量份盐度为27～29‰海水混合配制成催产海水1；

催产海水2配制:

将3重量份的催产饵料藻液A和10重量份盐度为27～29‰海水混合配制成催产海水2；

催产海水3配制:

将2重量份的催产饵料藻液B和10重量份盐度为27～29‰海水混合配制成催产海水3；

催产海水4配制:

将2重量份的催产饵料藻液B和15重量份盐度为27～29‰海水混合配制成催产海水4；

催产海水5配制:

将2重量份的催产饵料藻液B和20重量份盐度为27～29‰海水混合成催产海水5；

4）文昌鱼催产养殖：

（1）第一阶段：将文昌鱼亲鱼移入装有催产海水1的微水流循环系统池进行催产养殖，催产养殖中水温控制在30～31℃，催产养殖时间10～12h，微水流循环的流速为1L /h；

（2）第二阶段：将第一阶段催产海水1调换成催产海水2进行第二阶段的微水流循环催产养殖；催产养殖水温、养殖时间、微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同；

（3）第三阶段：将第二阶段的催产海水2调换成催产海水3进行第三阶段的微水流循环催产养殖，催产养殖水温、养殖、微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同；

（4）第四阶段：将第三阶段的催产海水3调换成催产海水4进行第四阶段的微水流循环催产养殖，催产养殖水温、养殖、微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同；

（5）第五阶段：将第四阶段的催产海水4调换成催产海水5进行第五阶段的微水流循环催产养殖，催产养殖水温、养殖时间、微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同；

催产分段养殖期间,人工控制每天光照时间15～16小时，黑夜时间8～9小时；

文昌鱼经上述催产养殖后,从第三阶段开始不断间隔检查性腺成熟及临产状态文昌鱼及时移入产卵缸并开始产卵与排精, 产卵与排精期持续3～4d，并授精孵化，完成了文昌鱼人工催产鱼卵的过程。

2.根据权利要求1所述的一种文昌鱼人工催产鱼卵的方法，其特征是所述的混合激素A按照如下重量份比例配制：

促黄体素释放激素类似物A220～30

促黄体素释放激素类似物A320～30

人绒毛膜促性腺激素40～60。

3.根据权利要求1所述的一种文昌鱼人工催产鱼卵的方法，其特征是所述的混合藻液A中各种藻类按照如下体积份比例配制：

青岛大扁藻液100

牟氏角毛藻液50

湛江叉鞭金藻液30

塔胞藻液20。

4.根据权利要求1所述的一种文昌鱼人工催产鱼卵的方法，其特征是所述的混合激素B按照如下重量份比例配制：

鲑鱼腺激素释放激素类似物 30～50

多潘立酮 10～20。

5.根据权利要求1所述的一种文昌鱼人工催产鱼卵的方法，其特征是所述的所述的混合藻液B中各种藻类按照如下体积份比例配制：

牟氏角毛藻液50

湛江叉鞭金藻液30

绿色巴夫藻液20。

6.根据权利要求1所述的一种文昌鱼人工催产鱼卵的方法，其特征是所述的微水流循环系统池由高位蓄水池、低位蓄水池、中位的催产养殖池构成，中位的催产养殖池的高于池底8-10cm池壁处，相对角设置一个进水口和一个出水口,池底铺有5-6cm厚海沙层；进水口与高位蓄水池相连，出水口与低位蓄水池相连。

说明书

技术领域

本发明涉及文昌鱼人工繁育的技术领域，具体是一种文昌鱼人工催产鱼卵的方法。

背景技术

文昌鱼是仅有的一类现存生活的头索动物,素有“活化石”之称,是进化发育生物学研究的经典实验模型动物, 同时也是一种营养美味、售价很高的海珍品。厦门刘五店沿岸浅海曾经是厦门文昌鱼的主要渔场。由于高(崎)-集(美)海堤的建设, 大规模的围垦、挖沙、环境污染以及过度捕捞等原因, 厦门文昌鱼的生存环境遭到严重破坏, 资源严重衰竭.

对文昌鱼繁殖生物学与人工育苗技术的持续性研究是恢复文昌鱼的渔业资源的首要问题。 早在上世纪30年代,童第周等就已使青岛文昌鱼(B ranch iostoma belcheri tsing taunese)在室内成功产卵, 并于1958年发表了“文昌鱼卵子分裂球的发育能力的研究”一文；1964年, 金德祥观察了厦门文昌鱼的早期胚胎发育； 1985年福建师范大学张健等对文昌鱼催产，雌体排卵，受精卵发育良好并形成幼体；1989年方永强等报道用促性腺激素释放激素类似物(GnRH-A)诱导厦门文昌鱼在室内产卵获得成功；1990年杜琦等报道人工培育获得1 536尾体长4.2～5.5mm的厦门文昌鱼浮游苗；1994年吴贤汉等报道在实验室里培育获得少量青岛文昌鱼苗且有若干鱼苗被成功养殖至性成熟；2005年周仁杰等成功培育获得体长0.55～1.30cm 的厦门文昌鱼潜沙苗23.2万尾, 育苗成活率达20.7%；王义权等获得了文昌鱼的子二代, 初步实现了文昌鱼在实验室内的全人工养殖。

攻克文昌鱼人工繁育批量生产技术难关，文昌鱼产卵孵化是关键环节。一般认为不同种或同种不同地理种群的文昌鱼繁殖季节有差异, 北半球的文昌鱼在5～6 月产卵, 南半球的在11～12 月产卵, 而热带地区的文昌鱼一年有2 次或多次产卵。目前有采用激素、日照、微流水综合人工催产技术，其中鱼类催产激素有鲑鱼腺激素释放激素类似物（S-GnRHa）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）、促黄体素释放激素A2（LHRH-A2）、促黄体素释放激素A3（LHRH-A3）、多潘立酮（DOM）。

人工催产技术改变文昌鱼产卵习性和生理，人为控制文昌鱼的产卵，达到调控文昌鱼的产卵节奏，达到同步产卵的目的,并有较高的孵化率和受精率,以达到为科学实验提供大量标准化的文昌鱼,有力推动文昌鱼人工养殖业的发展。

发明内容

本发明以性腺发育良好的佛罗里达文昌鱼(B .floridae)为活体亲鱼，以藻类吸附激素制成催产藻类饵料，再稀释成不同浓度的催产海水,分时段偶联微水流循环法, 人为控制文昌鱼的产卵，达到调控文昌鱼的产卵节奏，实现文昌鱼人工催产与孵化，有较高的受精率和孵化率的效果。

为实现本发明的目的而采用技术方案如下：

1、亲鱼采集

在文昌鱼产卵期间，采集雌、雄鱼有性腺发育的佛罗里达文昌鱼活体备用。

2、催产饵料藻液培养

1）催产饵料藻液A的培养

按80～160重量份（克）：100体积份（毫升）：800体积份（毫升）的比例，将混合激素A、混合藻液A和海水混合进行富集培养，经过6～10h富集培养后，得到催产饵料藻液A。催产饵料藻液A中的藻类吸附有混合激素A。

所述的混合激素A按照如下重量份比例配制：

促黄体素释放激素类似物A2（LHRH-A2）20～30

促黄体素释放激素类似物A3 （LHRH-A3） 20～30

人绒毛膜促性腺激素（HCG）40～60

所述的混合藻液A中各种藻类按照如下体积份比例配制：

青岛大扁藻液 100

牟氏角毛藻液 50

湛江叉鞭金藻液 30

塔胞藻液 20

2）催产饵料藻液B的培养

按40～70重量份（克）：100体积份（毫升）：800体积份（毫升）的比例，将混合激素B、混合藻液和海水混合进行富集培养，经过6～10h吸附培养后，得到催产饵料藻液B。催产饵料藻液B中的藻类吸附有混合激素。

所述的混合激素B按照如下重量份比例配制：

鲑鱼腺激素释放激素类似物（S-GnRHa） 30～50

多潘立酮（DOM） 10～20

所述的混合藻液B中各种藻类按照如下体积份比例配制：

牟氏角毛藻液50

湛江叉鞭金藻液30

绿色巴夫藻液20

3、催产海水配制：

催产海水1配制:

将1重量份的催产饵料藻液A和10重量份盐度为27～29‰海水混合配制成催产海水1。

催产海水2配制:

将3重量份的催产饵料藻液A和10重量份盐度为27～29‰海水混合配制成催产海水2。

催产海水3配制:

将2重量份的催产饵料藻液B和10重量份盐度为27～29‰海水混合配制成催产海水3。

催产海水4配制:

将2重量份的催产饵料藻液B和15重量份盐度为27～29‰海水混合配制成催产海水4。

催产海水5配制:

将2重量份的催产饵料藻液B和20重量份盐度为27～29‰海水混合成催产海水5。

4、文昌鱼催产养殖：

1）第一阶段：将文昌鱼亲鱼移入装有催产海水1的微水流循环系统池进行催产养殖。催产养殖中水温控制在30～31℃，催产养殖时间10～12h，微水流循环的流速为1L /h。

所述的微水流循环系统池由高位蓄水池、低位蓄水池、中位的催产养殖池构成，中位的催产养殖池的高于池底8-10cm池壁处，相对角设置一个进水口和一个出水口,池底铺有5-6cm厚海沙层。进水口与高位蓄水池相连，出水口与低位蓄水池相连。

微水流循环过程是高位蓄水池依靠水位差将催产海水1连续通过橡皮管从进水口流入催产养殖池,同时催产养殖池中的催产海水1不断经出水口流入低位蓄水池，低位蓄水池中催产海水1由微型水泵抽回高位水池进行循环使用。

2）第二阶段：将第一阶段催产海水1调换成催产海水2进行第二阶段的微水流循环催产养殖。催产养殖水温、养殖时间、微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同。

3）第三阶段：将第二阶段的催产海水2调换成催产海水3进行第三阶段的微水流循环催产养殖。催产养殖水温、养殖、微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同。

4）第四阶段：将第三阶段的催产海水3调换成催产海水4进行第四阶段的微水流循环催产养殖。催产养殖水温、养殖、微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同。

5）第五阶段：将第四阶段的催产海水4调换成催产海水5进行第五阶段的微水流循环催产养殖。催产养殖水温、养殖时间、微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同。

催产养殖期间,人工控制每天光照时间15～16小时，黑夜时间8～9小时。

上述催产养殖是连续进行的，不断间隔时间检查亲鱼的催产情况，有临产现状亲鱼移入产卵缸中产卵。

文昌鱼经上述催产养殖后,性腺成熟移入产卵缸并开始产卵与排精, 产卵与排精期持续3～4d，并授精孵化，完成了本发明所述的文昌鱼人工催产鱼卵的过程。

产卵与排精结束后, 从产卵缸中的不同部位各取10 mL水样, 混合均匀后, 取1 mL水样在低倍显微镜或解剖镜下计数受精卵, 重复3 次, 取其平均值,最后乘以池中水体总量,作为估算受精卵的依据。受精率的确定是随机取100 个受精卵, 观察每个卵的受精膜是否举起和卵周腔是否出现作为判断受精率的依据, 进行计数结果。

本发明采用不同藻类吸附不同激素喂养偶联微水流循环催产方法，结合改变光照条件，成功进行文昌鱼的人工催产、孵卵受精。与文昌鱼的自然状态产卵相比，提高了产卵率和受精卵率。

以上各种藻类: 青岛大扁藻(Platymonas helgolondica var.tsingta- oensis)、牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）、塔胞藻（Pyramimonas Schmarda.）、湛江叉鞭金藻（Dicrateria zhanjiangensis Hu. Var. sp）、绿色巴夫藻(Pavlova viridis)系实验室长期传代培养。

具体实施方式

实施例1

1、亲鱼采集

在文昌鱼产卵期间，采集雌、雄鱼有性腺发育的佛罗里达文昌鱼活体备用。

2、催产饵料藻液培养

1）催产饵料藻液A的培养

将160kg混合激素A与100升混合藻液A以及800升海水混合进行富集培养，经过10h富集培养后，得到催产饵料藻液A。催产饵料藻液A中的藻类吸附有混合激素A。

所述的混合激素A按照如下重量份比例配制：

促黄体素释放激素类似物A2（LHRH-A2）30

促黄体素释放激素类似物A3 （LHRH-A3） 30

人绒毛膜促性腺激素（HCG）60

所述的混合藻液A中各种藻类按照如下体积份比例配制：

青岛大扁藻液100

牟氏角毛藻液50

湛江叉鞭金藻液30

塔胞藻液20

2）催产饵料藻液B的培养

将70kg混合激素B与100升混合藻液以及800升海水混合进行富集培养，经过10h吸附培养后，得到催产饵料藻液B。混合藻液中的藻类吸附有混合激素。

所述的混合激素B按照如下重量份比例配制：

鲑鱼腺激素释放激素类似物（S-GnRHa）50

多潘立酮（DOM）20

所述的混合藻液B中各种藻类按照如下体积份比例配制：

牟氏角毛藻液 50

湛江叉鞭金藻液 30

绿色巴夫藻液 20

3、催产海水配制：

催产海水1、催产海水2、催产海水3、催产海水4、催产海水5按照上述技术方案配制备用。

4、文昌鱼催产养殖：

1）第一阶段：将60尾文昌鱼亲鱼移入装有催产海水1的微水流循环系统池进行催产养殖。催产养殖中水温控制在30～31℃，催产养殖时间10h，微水流循环的流速为1L/h。

微水流循环过程是高位蓄水池依靠水位差将催产海水1通过橡皮管流入中位的催产养殖池进水口, 催产海水1经出水口流入低位蓄水池，低位蓄水池中催产海水1由微型水泵抽回高位蓄水池进行循环使用。

2）第二阶段：将第一阶段催产海水1调换成催产海水2进行第二阶段的微水流循环催产养殖。催产养殖水温、养殖时间、微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同。

3）第三阶段：将第二阶段的催产海水2调换成催产海水3进行第三阶段的微水流循环催产养殖。催产养殖水温、养殖时间、微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同。

4）第四阶段：将第三阶段的催产海水3调换成催产海水4进行第四阶段的微水流循环催产养殖。催产养殖水温、养殖时间、微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同。

5）第五阶段：将第四阶段的催产海水4调换成催产海水5进行第五阶段的微水流循环催产养殖。催产养殖水温、养殖时间、微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同。

催产分段养殖期间,人工控制每天光照时间16小时，黑夜时间8小时。

上述催产分段养殖是连续进行的，不断间隔检查亲鱼的催产情况，有临产现状亲鱼移入产卵缸中产卵。

文昌鱼经上述催产分段养殖后,性腺成熟移入产卵缸并开始产卵与排精, 产卵与排精期持续3d，并授精孵化。

试验统计:文昌鱼亲鱼个体60尾,催产期间文昌鱼性腺发育不健全有13尾，个体产卵率78.33%，共有文昌鱼卵1.2万个，受精卵1.1万个，受精卵率91.67%。

实施例2

1、亲鱼采集

在文昌鱼产卵期间，采集雌、雄鱼有性腺发育的佛罗里达文昌鱼活体备用。

2、催产饵料藻液培养

1）催产饵料藻液A的培养

将90kg混合激素A与100升混合藻液A以及800毫升海水混合进行富集培养，经过8h富集培养后，得到催产饵料藻液A。混合藻液中的藻类吸附有混合激素A。

所述的混合激素A按照如下重量份比例配制：

促黄体素释放激素类似物A2（LHRH-A2） 20

促黄体素释放激素类似物A3 （LHRH-A3）20

人绒毛膜促性腺激素（HCG） 40

所述的混合藻液A中各种藻类按照如下体积份比例配制：

青岛大扁藻液100

牟氏角毛藻液50

湛江叉鞭金藻液30

塔胞藻液20

2）催产饵料藻液B的培养

将50kg混合激素B与100升混合藻液以及800升海水进行富集培养，经过8h吸附培养后，得到催产饵料藻液B。混合藻液中的藻类吸附有混合激素。

所述的混合激素B按照如下重量份比例配制：

鲑鱼腺激素释放激素类似物（S-GnRHa）30

多潘立酮（DOM）10

所述的混合藻液B中各种藻类按照如下体积份比例配制：

牟氏角毛藻液 50

湛江叉鞭金藻液 30

绿色巴夫藻液 20

3、催产海水配制：

催产海水1、催产海水2、催产海水3、催产海水4、催产海水5按照上述技术方案配制备用。

4、文昌鱼催产养殖：

1）第一阶段：将文昌鱼亲鱼移入装有催产海水1的微水流循环系统池进行催产养殖。催产养殖中水温控制在30～31℃，催产养殖时间12h，微水流循环的流速为1L/h。

微水流循环过程是高位蓄水池依靠水位差将催产海水1通过橡皮管流入中位的催产养殖池进水口, 催产海水1经出水口流入低位蓄水池，低位蓄水池中催产海水1由微型水泵抽回高位水池进行循环使用。

2）第二阶段：将第一阶段催产海水1调换成催产海水2进行第二阶段的微水流循环催产养殖。催产养殖水温、养殖时间12h，微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同。

3）第三阶段：将第二阶段的催产海水2调换成催产海水3进行第三阶段的微水流循环催产养殖。催产养殖水温、养殖时间12h，微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同。

4）第四阶段：将第三阶段的催产海水3调换成催产海水4进行第四阶段的微水流循环催产养殖。催产养殖水温、养殖时间12h，微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同。

5）第五阶段：将第四阶段的催产海水4调换成催产海水5进行第五阶段的微水流循环催产养殖。催产养殖水温、养殖时间12h，微水流循环的流速、微水流循环方式与第一阶段相同。

催产分段养殖期间,人工控制每天光照时间15小时，黑夜时间9小时。

上述催产分段养殖是连续进行的，不断间隔检查亲鱼的催产情况，有临产现状亲鱼移入产卵缸中产卵。

文昌鱼经上述催产分段养殖后,性腺成熟移入产卵缸并开始产卵与排精, 产卵与排精期持续4d，并授精孵化。

试验统计:文昌鱼亲鱼个体78尾,催产期间文昌鱼性腺发育不健全有11尾，个体产卵率85.90 %，共有文昌鱼卵1.7万个，受精卵1.6万个，受精卵率94.12%。

一种文昌鱼人工催产鱼卵的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。