专利摘要

本发明涉及一种文昌鱼繁殖季节多次重复排精排卵的人工调控方法。所述的是：分别选取4～5龄雄性和雌性佛罗里达文昌鱼，按照10～18尾雄性亲鱼比10尾雌性亲鱼的比例，置于孵化缸中强化培育，直至观察亲鱼开始第一次排精排卵；将第一次排精排卵后的亲鱼转移至复壮培育池中进行产后复壮培育，直至观察亲鱼出现第二次排精排卵；不断重复上述方法和培育条件，直至观察亲鱼开始第四次、第五次、第六次、第七次、第八次、第九次、第十次排精排卵。采用本发明所述的方法，文昌鱼排精排卵频次高，受精率达到55～67%，10～12h的孵化出苗率达90～93%，5天成活率达到70～75%，为文昌鱼规模化人工繁殖提供充足的鱼苗。

权利要求

1.一种文昌鱼繁殖季节多次重复排精排卵的人工调控方法,其特征在于：

1）亲鱼选择

分别选取部分4～5龄雄性和雌性的佛罗里达文昌鱼(Branc jiosttoma. floridae)作为亲鱼备用；

2）第一次排精排卵

按照10～18尾雄性亲鱼比10尾雌性亲鱼的比例，置于盛满海水、底部铺垫5～10cm厚细沙的孵化缸中，采用微水流循环和人工控光进行产前鱼体强化培育，强化培育过程每天2次等量投喂强化单细胞藻混合藻，每次投喂的强化单细胞藻混合藻量为每立方海水0.5～0.6万个强化单细胞藻混合藻，待亲鱼性腺饱满发育在Ⅴ期，每天下午16：00观察亲鱼是否有排精排卵行为，直至观察亲鱼开始第一次排精排卵；

3）复壮培育与第二次排精排卵

将第一次排精排卵后的亲鱼转移至盛满海水的复壮培育池中采用微水流循环和人工控光进行产后鱼体复壮和性腺成熟培育，复壮培育过程每天2次定时投喂等量的复壮单细胞藻混和藻，每次投喂复壮单细胞藻混合藻量为每立方海水0.5～0.6万个复壮单细胞藻混合藻；复壮培育过程中所述的定时投喂、人工控光、海水水温、海水盐度与海水pH值与步骤2)相同，待亲鱼性腺饱满发育在Ⅴ期，每天16：00观察亲鱼是否有排精排卵行为，直至观察亲鱼出现第二次排精排卵；

第二次排精排卵结束，将亲鱼转移至下一个复壮培育池中进行重复的复壮培育；不断重复步骤3）的方法和培育条件，直至观察亲鱼开始第四次、第五次、第六次、第七次、第八次、第九次、第十次排精排卵；

所述的强化单细胞藻混合藻，按以下藻种重量份比例混合得到：

亚心形扁藻40～60

湛江等鞭金藻15～20

小球藻5～10

牟氏角毛藻10～15

塔胞藻10～15；

所述的强化单细胞藻混合藻为亚心形扁藻（Platymonas subcordiformis）、湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)、小球藻(Chlorella vulgaris)、牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）和塔胞藻（Pyramimonas sp.）组成，均来自福建师范大学生命科学学院藻类研究室以人工培养单细胞藻方式进行品质改良得到；

所述的复壮单细胞藻混合藻，按以下藻种重量份比例混合得到：

亚心形扁藻20～25

湛江等鞭金藻25～30

牟氏角毛藻10～15

小球藻30～35；

所述的步骤2）孵化缸中海水，海水水温在24℃～27℃之间，海水盐度在28～33‰，海水pH控制在8～9之间；

所述的步骤2）中每天2次等量投喂，第一次在每天上午8:00-9:00点定时投喂强化单细胞藻混合藻，第二次在每天下午16:00-17:00点定时投喂强化单细胞藻混合藻；

所述的人工控光，其光照量08:30-18:30之间为10Dark ，18:30- 08:30为14Light；

所述微水流循环是加强微水流循环流动，微水流循环流速为1L/h，其过程是：高位蓄水池依靠水位差将海水通过橡皮管流入中位的孵化缸或复壮培育池的进水口,海水经孵化缸或复壮培育池的出水口流入低位蓄水池，低位蓄水池中海水由微型水泵抽回高位蓄水池进行循环使用。

2.根据权利要求1 所述的一种文昌鱼繁殖季节多次重复排精排卵的人工调控方法，其特征在于所述的人工培养单细胞藻进行品质改良，是通过采用自行配制的改良培养基培养得到；

所述的改良培养基，配方如下:

（NH4）2SO4 200mg

海泥抽出液 20ml

过磷酸钙[Ca(H2PO4)2·H2O+2(CaSO4·H2O)] 30mg

FeC6H5O7(1%溶液)0.5ml

维生素溶液 20ml

海水 1000ml。

3.根据权利要求2所述的一种文昌鱼繁殖季节多次重复排精排卵的人工调控方法，其特征在于所述的海泥抽出液:取海滩上砂质较少，有机质较多而又不是过分淤黑的上层软泥，清除其中的小树枝和小石块杂物，以容量计算1份泥加2份水，充分搅拌均匀，静置l～2min，待粗砂、小石下沉，把上层泥浆倾人铝锅中，弃去底部粗砂、小石杂物，按每1000ml泥浆加入NaOH 1g的量加入NaOH，煮沸20～30min，煮时需不断搅拌，煮后静置24h，吸取上清液使用。

4.根据权利要求2所述的一种文昌鱼繁殖季节多次重复排精排卵的人工调控方法，其特征在于所述的维生素溶液: 维生素B1 0.1g 、维生素B12 0.5g 、生物素 0.5g 、海水1L配成维生素溶液。

5.根据权利要求2所述的一种文昌鱼繁殖季节多次重复排精排卵的人工调控方法，其特征在于所述的海水，是指取自近海的普通海水经0.4m孔径滤膜过滤后得到的海水。

说明书

技术领域

本发明涉及文昌鱼人工繁育的技术领域，具体是一种文昌鱼繁殖季节多次 重复排精排卵的人工调控方法。

背景技术

1937年，童第周等率先在中国突破了文昌鱼室内繁殖技术,并于1952年通过 人工受精获得正常发育的卵子。后来，国内外许多学者陆续开展了文昌鱼的实 验室饲养与繁殖方面的研究工作,对文昌鱼人工养殖比较有影响力的推动性成 果是：Yasui等通过构建循环水培育系统完成了日本文昌鱼的室内饲养与繁殖， 并培育出子代文昌鱼；Wu等曾报道过实验室成功繁殖文昌鱼子一代，并在户外 容器中饲养达2a以上；王义权、Zhang等获得了文昌鱼的子二代，初步实现了 文昌鱼在实验室内的全人工养殖。

不同种或同种不同地理种群的文昌鱼繁殖季节有差异，北半球的文昌鱼自 然繁殖季节在5～6月，南半球的自然文昌鱼繁殖季节在11～12月，一般文昌鱼 一年只有1次排精或排卵。而热带地区的文昌鱼一年可以有2次或多次自然产卵。 我国地处温带、亚热带地区，一般一年只有1次能够实现文昌鱼自然产卵。我们 针对文昌鱼不同发育时期，采取改变饵料配方和不同的饲养管理方法，结合人 工调控的综合措施进行文昌鱼排精排卵后的复壮培育到性腺发育成熟的调控， 实现文昌鱼自然繁殖季节内多次重复排精排卵。

发明内容

本发明以佛罗里达文昌鱼(Brancjiosttoma.floridae)为材料,通过饵料改 良培养，海水水质控制，光照与温度调控及文昌鱼产后复壮等综合技术方案， 促使文昌鱼性腺自然繁殖季节内多次发育成熟，实现单一个体文昌鱼的一年多 次重复排精排卵的人工调控方法。该技术为文昌鱼规模化人工繁殖打下良好基 础。

为实现本发明的目的而采用的技术方案如下:

1、亲鱼选择

分别选取部分4～5龄雄性和雌性的佛罗里达文昌鱼(Brancjiosttoma.floridae)作为亲鱼备用。

2、第一次排精排卵

挑选个体健康、肝盲囊发育良好、性腺饱满发育水平较好的佛罗里达文昌 鱼亲鱼，按照10～18尾雄性亲鱼比10尾雌性亲鱼的比例，置于盛满海水、底部 铺垫5～10cm厚细沙的孵化缸中，采用微水流循环和人工控光进行产前鱼体强化 培育，强化培育过程每天2次等量投喂强化单细胞藻混合藻，每次投喂强化单细 胞藻混合藻量为每立方海水0.5～0.6万个强化单细胞藻混合藻，待亲鱼性腺饱 满发育在Ⅴ期，每天下午16：00观察亲鱼是否有排精排卵行为，直至观察亲鱼 开始第一次排精排卵。

所述的孵化缸中海水，海水水温在24℃～27℃之间，海水盐度在28～33‰， 海水pH控制在8～9之间。

所述的每天2次等量投喂，第一次在每天8:00-9:00点定时投喂强化单细胞 混合藻，第二次在每天16:00-17:00点定时投喂强化单细胞混合藻。

所述的人工控光，其光照量08:30-18:30之间为10Dark，18:30-08:30为 14Light。

所述微水流循环是加强微水流循环流动，微水流循环流速为1L/h。其过程 是：高位蓄水池依靠水位差将海水通过橡皮管流入中位的孵化缸或复壮培育池 的进水口,海水经孵化缸或复壮培育池的出水口流入低位蓄水池，低位蓄水池中 海水由微型水泵抽回高位蓄水池进行循环使用。

所述的4～5龄佛罗里达文昌鱼(Branc jiosttoma.floridae)种 源来自“台湾地区研究院”。

所述的强化单细胞藻混合藻，按以下藻种重量份比例混合得到：

上述强化单细胞藻混合藻为亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、 湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)、小球藻(Chlorella vulgaris)、 牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)和塔胞藻(Pyramimonas sp.)组成，均 来自福建师范大学生命科学学院藻类研究室以人工培养单细胞藻方式进行品质 改良得到。

所述的人工培养单细胞藻进行品质改良，是通过采用自行配制的改良培养 基培养得到。

所述的改良培养基，配方如下:

所述的海泥抽出液:取海滩上砂质较少，有机质较多而又不是过分淤黑的上 层软泥，清除其中的小树枝和小石块等杂物，以容量计算1份泥加2份水，充分 搅拌均匀，静置l～2min，待粗砂、小石下沉，把上层泥浆倾人铝锅中，弃去底 部粗砂、小石等杂物，按每1000ml泥浆加入NaOH 1g的量加入NaOH，煮沸20～30min， 煮时需不断搅拌，煮后静置24h，吸取上清液使用。

所述的维生素溶液:维生素B1 0.1g、维生素B12 0.5g、生物素0.5g、 海水1L配成维生素溶液。

所述的海水，是指取自近海的普通海水经0.4m孔径滤膜过滤后得到的海水。

3、复壮培育与第二次排精排卵

将第一次排精排卵后的亲鱼转移至盛海水的复壮培育池中采用微水流循 环和人工控光进行产后鱼体复壮和性腺成熟进行复壮培育，复壮培育过程每天2 次定时投喂等量的复壮单细胞藻混和藻，每次投喂复壮单细胞藻混合藻量为每 立方海水0.5～0.6万个复壮单细胞藻混合藻。复壮培育过程中所述的定时投喂、 人工控光、海水水温、海水盐度与海水pH值与步骤2相同。待亲鱼性腺饱满发育 在Ⅴ期，每天16：00观察亲鱼是否有排精排卵行为，直至观察亲鱼出现第二次 排精排卵。第二次排精排卵结束，将所有排精排卵后的亲鱼转移至下一个复壮 培育池中重复进行复壮培育。

所述的复壮单细胞藻混合藻，按以下藻种重量份比例混合得到：

上述复壮单细胞藻混合藻为亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、 湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)、小球藻(Chlorella vulgaris)、 牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)组成，均来自福建师范大学生命科学学 院藻类研究室以人工培养单细胞藻方式进行品质改良得到。

4、重复复壮培育与第三次排精排卵

将第二次排精排卵后的亲鱼置于的复壮培育池中，重复步骤3的方法和培育 条件，直至观察亲鱼开始第四次排精排卵。

不断重复步骤3的方法和培育条件，可实现繁殖季节内多次重复排精排卵。 为了保持孵化缸或复壮培育池的清洁，孵化缸或复壮培育池中的细沙每两周清 洗一次。提供充足饵料和及时微水流循环充氧。

采用本发明所述的人工调控方法，文昌鱼在4-11月份的排精排卵频次高， 大部分文昌鱼的排精排卵频次为8次或9次，最高可达到10次，受精率达到55～ 67％，且受精卵10～12h的孵化出苗率达90～93％，5天成活率达到70～75％，为文 昌鱼规模化人工繁殖提供充足的鱼苗。

具体实施方式

实施例1

1、亲鱼选择：2016年3月21日，在产卵季节来临之际，将满5龄(2011年孵 化)的佛罗里达文昌鱼(Branchiostoma floridae)从沙中筛出，此时仔细挑 选雌、雄鱼性腺发育饱满的健康个体，然后以随机挑取的16尾(10♀6♂)作为 亲鱼备用。根据挑选的文昌鱼的性别、体长、左右性腺数、臀前鳍鳍室形态特 征对不同亲鱼个体进行标记并编号，如下表：

表1实验文昌鱼初始数据(2016年3月21日)

在文昌鱼的孵化缸内放入事先洗净晾干并用海水漂洗过的细沙铺垫10cm厚， 再放入新鲜洁净的海水，海水约高出沙面5～10cm，将挑选出的16尾性腺饱满的 文昌鱼放置于孵化缸内。

2、第一次排精排卵

采用微水流循环和人工控光进行产前鱼体强化培育，强化培育过程每天2次 等量投喂强化单细胞藻混合藻，每次投喂强化单细胞藻混合藻量为每立方海水 0.5～0.6万个强化单细胞藻混合藻，待亲鱼性腺饱满发育在Ⅴ期，每天下午16： 00观察亲鱼是否有排精排卵行为，直至观察亲鱼开始第一次排精排卵。

所述的孵化缸中海水，海水水温控制在27℃，海水盐度在28‰，海水pH控 制在8～9之间。

所述的每天2次等量投喂，第一次在每天上午8:00-9:00点定时投喂强化单 细胞藻混合藻，第二次在每天下午16:00-17:00点定时投喂强化单细胞藻混合藻。

所述的人工控光，其光照量08:30-18:30之间为10Dark，18:30-08:30为 14Light。

所述的强化单细胞藻混合藻，通过如下方式获得：

分别选取实验室人工培养强化单细胞藻混合藻为亚心形扁藻(Platymonassubcordiformis)、湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)、小球藻 (Chlorellavulgaris)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)和塔胞藻 (Pyramimonas sp.)组成,按以下重量份比例：

混合后得到强化单细胞藻混合藻。

所述微水流循环是加强微水流循环流动，微水流循环流速为1L/h。其过程 是：高位蓄水池依靠水位差将海水通过橡皮管流入中位的孵化缸或复壮培育池 的进水口,海水经孵化缸或复壮培育池的出水口流入低位蓄水池，低位蓄水池中 海水由微型水泵抽回高位蓄水池进行循环使用。

所述的5龄佛罗里达文昌鱼(Branc jiosttoma.floridae)种源来自台湾“中 央研究院”细胞与个体生物学研究所游智凯博士实验室。

3、复壮培育与第二次排精排卵

将第一次排精排卵后的亲鱼转移至盛满海水的复壮培育池中进行复壮培育， 每天2次定时投喂等量的复壮单细胞藻混和藻，每次投喂复壮单细胞藻混合藻量 为每立方海水0.5～0.6万个复壮单细胞藻混合藻，复壮培育过程中投喂时间、 光照条件、海水水温、海水盐度和与海水pH值与步骤2相同。并采用微水流循环 和人工控光进行产后鱼体复壮和性腺成熟培育，待亲鱼性腺饱满发育在Ⅴ期， 每天下午16：00观察亲鱼是否有排精排卵行为，直至观察亲鱼出现第二次排精 排卵。第二次排精排卵结束，将所有排精排卵后的亲鱼转移至下一个复壮培育 池中进行重复的复壮培育。

实验室人工培养复壮单细胞藻混合藻，按照以下不同藻种搭配组成：

4、重复复壮培育与第三次排精排卵

将第二次排精排卵后的亲鱼置于的复壮培育池中，重复步骤3的方法和培育 条件，直至观察亲鱼开始第四次排精排卵。

不断重复步骤3的方法和培育条件，可实现繁殖季节内多次重复排精排卵。 为了保持孵化缸或复壮培育池的清洁，孵化缸或复壮培育池中的细沙每两周清 洗一次。提供充足饵料和及时微水流循环充氧。

实验室人工培养复壮单细胞藻混合藻，按照以下不同藻种搭配组成：

实验结果：2016年，这16尾文昌鱼中，第9号文昌鱼在排精5次后，中途出 现死亡现象，其它15尾(10♀5♂)文昌鱼在4～11月份的排卵排精频次集中在7～ 10次，其中大部分文昌鱼的产卵次数为8次或9次，见下表：

表2龄佛罗里达文昌鱼的排卵排精频次

孵化情况：本试验获得45000个受精卵，受精卵在海水温度为24.5～26.0℃、 盐度为28～33‰条件下，于孵化箱中经约10～12h的胚胎发育过程孵化,孵化出 苗率达91.8％。

一种文昌鱼繁殖季节多次重复排精排卵的人工调控方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。