专利摘要

本发明公开了一种小球藻蛋白肽低醇饮料的制备方法。本发明利用蛋白核小球藻预处理后，进行酶法破壁、采用两步酶解‑超滤法提取小球藻蛋白肽液、经纳滤浓缩、冷冻干燥制成小球藻蛋白肽，开发成以低分子量、易吸收的小球藻蛋白肽为蛋白源，含有多种具有保健功能的生物活性成分小球藻蛋白肽低醇饮料。小球藻蛋白肽低醇饮料口感、风味俱佳，低酒精度，营养丰富，且具有抗衰老、增强机体免疫、促进消化吸收等多种生理功能。

权利要求

1.一种小球藻蛋白肽低醇饮料的制备方法，其特征在于：

1）小球藻预处理：

以蛋白核小球藻粉为原料，按照小球藻粉和NaOH稀碱溶液质量比为1:5～6将小球藻粉加入到0.2～0.3 mol/L NaOH稀碱溶液中，65℃条件下，浸泡50 min，于30～60 MPa压力下高压均质2～4次，5000 rpm下离心20 min，获得的上清液A和小球藻蛋白沉淀物，上清液A暂置于4℃条件下保存；

2）小球藻蛋白粉制备：

（1）将小球藻蛋白沉淀物与小球藻细胞壁酶解液混合后酶解，酶解后于5000 rpm下离心20 min，获得上清液B；

（2）将上清液A和上清液B混合成上清液AB，放入90℃水浴锅中，保持20min钝化酶，然后将上清液AB降温至35℃，经过管式孔径10μm超滤膜超滤，操作压力为0.25MPa,过滤去掉灰分、有机物、胶体小分子物质，然后在常压条件下进行单效节能浓缩，直至浓缩前后体积比为6～10:1，浓缩液经-20℃真空冷冻干燥即可得小球藻蛋白粉；

（3）小球藻蛋白酶解

采用酶解-超滤两步法，取1份小球藻蛋白粉，加3倍质量份数去离子水溶解，并调整pH至7 .5～8.0，加入小球藻蛋白粉质量0.1～0.4％的复合风味蛋白酶，于40～60℃条件下进行蛋白酶解，酶解时间30～60 min，经过中空纤维式孔径0.01μm超滤膜0.25～0.35MPa进行超滤，获得超滤液；在超滤液中再加入小球藻蛋白粉质量0 .1～0 .2％的复合蛋白酶，调整温度40～60℃条件下进行复合蛋白酶液酶解，酶解时间30～60 min后；在100℃水浴中灭酶处理10 min，迅速冷却至室温；中空纤维式孔径中孔径0.01μm超滤膜0.25～0.35 MPa再次超滤,获得超滤液C；

（4）循环浓缩

采用截留分子量为500～2000的纳滤膜对超滤液C进行循环浓缩，控制循环流量在150～220L/min，膜进口压力为1.5～1.8MPa，浓缩过程料液温度为55～60℃，待系统压力降至1.0MPa以下时停止浓缩得到浓缩液，浓缩液经-20真空冷冻干燥即为具有功能活性的小球藻蛋白肽粉；

3）小球藻蛋白肽低醇饮料的制作：

（1）配方：按质量份数100 份计配比为：

干型发酵酒 20～30

小球藻蛋白肽 5

柠檬酸 0.2～0.5

蜂蜜 5～10

木糖醇 4～5

黄原胶 0.05～0.1

羧甲基纤维素钠 0.05～0.1

叶绿素铜钠 0.01～0.03

其余为去离子水；

所述的干型发酵酒是干型黄酒、干型葡萄酒或干型果酒，酒精度11～15%voL；

（2）制作步骤：

将黄原胶、羧甲基纤维素钠、木糖醇用部分去离子水溶解，用高速分散机混合得溶解液A；取小球藻蛋白肽、蜂蜜、柠檬酸、叶绿素铜钠加部分去离子水溶解得溶解液B；将上述溶解液A和溶解液B与干型发酵酒混合后，加入去离子水至配方质量份数总计为100 份的饮料混合液；饮料混合液在80℃，220kg/cm2压力下均质得到所述的小球藻蛋白肽低醇饮料；

小球藻蛋白肽低醇饮料灌装后，在121 ℃灭菌15 min杀菌，通过喷淋冷却至常温，即为可供运输与上架的小球藻蛋白肽低醇饮料产品；

所述的混合后酶解，其条件为：酶解温度40～60℃、酶解时间3～7 h、酶解时搅拌转速为150 rpm；

步骤2）小球藻蛋白粉制备中所述的小球藻细胞壁酶解液，其重量份数比为：

纤维素酶 3-5g

果胶酶 5-10g

β-葡聚糖酶 2-3g

去离子水 6000-7000g；

小球藻细胞壁酶解液配制后用质量分数36%的浓盐酸调节pH至3.0～5.0；

步骤2）小球藻蛋白粉制备中所述的复合蛋白酶液，由胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、水按1：1：20质量份比例配制。

2.根据如权利要求1所述的一种小球藻蛋白肽低醇饮料的制备方法，其特征在于步骤1）小球藻预处理中所述的蛋白核小球藻为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻。

3.根据如权利要求1所述的一种小球藻蛋白肽低醇饮料的制备方法，其特征在于步骤2）小球藻蛋白粉制备中所述的小球藻细胞壁酶解液加入到小球藻蛋白沉淀物，是按（1～1.8）：（2000～3600）重量份比例加入的。

4.根据如权利要求1所述的一种小球藻蛋白肽低醇饮料的制备方法，其特征在于所述的纤维素酶，酶活力为20000 u/g，所述的果胶酶酶，活力为50000 u/g，所述的β-葡聚糖酶，酶活力为20000 u/g。

5.根据如权利要求1所述的一种小球藻蛋白肽低醇饮料的制备方法，其特征在于复合风味蛋白酶的酶活力为50000 u/g；胰蛋白酶的酶活力为100000 u/g；木瓜蛋白酶的酶活力为100000 u/g。

说明书

技术领域

本发明属于功能性食品加工技术领域。具体涉及一种小球藻蛋白肽低醇饮料的制备方法。

背景技术

小球藻（Chlorella）小球藻是单细胞藻，小球藻营养极其丰富，其中粗蛋白含量高达50%以上，必需氨基酸组成基本平衡，同时还含有不饱和脂肪酸、生物活性多糖、核酸、维生素、微量元素、矿物质、叶绿素等，营养价值极高。

近年来小球藻保健品的生产方兴未艾，特别是高值化小球藻保健品的开发。如小球藻经破壁、浓缩和萃取得到小球藻干粉，可作为有效的功能性食品。小球藻中蛋白质含量高达干重的50%，利用现代生物技术对小球藻的优质微藻蛋白资源进行高值化开发，通过选用最适蛋白酶组合，优化酶解液配方及酶解工艺，获得小球藻蛋白肽，用于进一步开发小球藻蛋白肽相关的食品、保健和医药产品。

发明内容

本发明以蛋白核小球藻预处理后，进行酶法破壁、采用两步酶解-超滤法提取小球藻蛋白肽液、经纳滤浓缩、冷冻干燥制成小球藻蛋白肽，开发成以低分子量、易吸收的小球藻蛋白肽为蛋白源，含有多种具有保健功能的生物活性成分的小球藻蛋白肽低醇饮料。

为实施本发明的目的而制定技术方案如下：

1）小球藻预处理

以蛋白核小球藻粉为原料，按照小球藻粉和NaOH稀碱溶液质量比为1:5～6将小球藻粉加入到0.2～0.3 mol/L NaOH稀碱溶液中，65℃条件下，浸泡50 min，于30～60 MPa压力下高压均质2～4次，5000 rpm下离心20 min，获得的上清液A和小球藻蛋白沉淀物。上清液A暂置于4℃条件下保存。

2）小球藻蛋白粉制备

（1）将小球藻蛋白沉淀物与小球藻细胞壁酶解液混合后酶解，酶解后于5000 rpm下离心20 min，获得上清液B；

所述的小球藻细胞壁酶解液加入到小球藻蛋白沉淀物，是按（1-1.8）：（2000-3600）重量份比例加入的；

所述的混合后酶解，其条件为：酶解温度40～60℃、酶解时间3～7 h、酶解时搅拌转速为150 rpm；

（2）将上清液A和上清液B混合成上清液AB，放入90℃水浴锅中，保持20min钝化酶。然后将上清液AB降温至35℃，经过管式孔径10μm超滤膜超滤，操作压力为0.25MPa,过滤去掉灰分、有机物、胶体小分子物质，然后在常压条件下进行单效节能浓缩，直至浓缩前后体积比为6～10:1，浓缩液经-20℃真空冷冻干燥即可得小球藻蛋白粉；

所述的小球藻细胞壁酶解液，其重量份数比为：

纤维素酶 3-5g

果胶酶 5-10g

β-葡聚糖酶 2-3g

去离子水 6000-7000g；

小球藻细胞壁酶解液配制后用质量分数36%的浓盐酸调节pH至3.0～5.0；

（3）小球藻蛋白酶解

采用酶解-超滤两步法，取1份小球藻蛋白粉，加3倍质量份数去离子水溶解，并调整pH至7 .5～8.0，加入小球藻蛋白粉质量0.1～0.4％的复合风味蛋白酶，于40～60℃条件下进行蛋白酶解，酶解时间30～60 min，经过中空纤维式孔径0.01μm超滤膜0.25～0.35MPa进行超滤，获得超滤液；在超滤液中再加入小球藻蛋白粉质量0 .1～0 .2％的复合蛋白酶，调整温度40～60℃条件下进行复合蛋白酶液酶解，酶解时间30～60 min后；在100℃水浴中灭酶处理10 min，迅速冷却至室温；中空纤维式孔径中孔径0.01μm超滤膜0.25～0.35 MPa再次超滤,获得超滤液C；

所述的复合蛋白酶液，由胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、水按1：1：20质量份比例配制。

（4）循环浓缩

采用截留分子量为500～2000的纳滤膜对超滤液C进行循环浓缩，控制循环流量在150～220L/min，膜进口压力为1 .5～1 .8MPa，浓缩过程料液温度为55～60℃，待系统压力降至1 .0MPa以下时停止浓缩得到浓缩液，浓缩液经-20真空冷冻干燥即为具有功能活性的小球藻蛋白肽粉。

3）小球藻蛋白肽低醇饮料的制作

（A）配方：按质量份数总计为100 份计，原料质量份数配比为：

干型发酵酒（酒精度11～15%voL） 20～30

小球藻蛋白肽(粉状) 5

柠檬酸 0.2～0.5

蜂蜜 5～10

木糖醇 4～5

黄原胶 0.05～0.1

羧甲基纤维素钠 0.05～0.1

叶绿素铜钠 0.01～0.03

其余为去离子水。

（B）制作步骤：

将黄原胶、羧甲基纤维素钠、木糖醇用部分去离子水溶解，用高速分散机混合得溶解液A；取小球藻蛋白肽、蜂蜜、柠檬酸、叶绿素铜钠加部分去离子水溶解得溶解液B；将上述溶解液A和溶解液B与干型发酵酒混合后，加入去离子水至配方质量份数总计为100 份的饮料混合液。饮料混合液在80℃，220kg/cm²压力下均质得到本发明所述的小球藻蛋白肽低醇饮料。

小球藻蛋白肽低醇饮料灌装后，在121 ℃灭菌15 min杀菌，通过喷淋冷却至常温，即为可供运输与上架的小球藻蛋白肽低醇饮料产品。

该产品色泽亮绿，质地均匀，爽口柔和，无异杂味，酸甜可口，无论从口味还是保健养身均属上乘，具有很好的市场前景。

所述的干型发酵酒是干型黄酒；干型葡萄酒；干型果酒。

所述蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidesa)为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，绿安奇生物工程有限公司购买。

所述的纤维素酶（酶活力为20000 u/g）、果胶酶(酶活力为50000 u/g)、β-葡聚糖酶(20000 u/g)、复合风味蛋白酶（酶活力为50000 u/g）、胰蛋白酶（酶活力为100000 u/g）、木瓜蛋白酶（酶活力为100000 u/g）均外购。

具体实施方式

实施例1

1）小球藻预处理

以蛋白核小球藻粉为原料，按照小球藻粉和NaOH稀碱溶液质量比为1:5将小球藻粉加入到0.2 mol/L NaOH稀碱溶液中，65℃条件下，浸泡50 min，于35MPa压力下高压均质3次，5000 rpm下离心20 min，获得的上清液A和小球藻蛋白沉淀物。上清液A暂置于4℃条件下保存。

2）小球藻蛋白粉制备

（1）将小球藻蛋白沉淀物与小球藻细胞壁酶解液混合后酶解，酶解后于5000 rpm下离心20 min，获得上清液B；

所述的小球藻细胞壁酶解液加入到小球藻蛋白沉淀物，是按1.2： 2000重量份比例加入的；

所述的混合后酶解，其条件为：酶解温度45℃、酶解时间5 h、酶解时搅拌转速为150rpm；

（2）将上清液A和上清液B混合成上清液AB，放入90℃水浴锅中，保持20min钝化酶。然后将上清液AB降温至35℃，经过管式孔径10μm超滤膜超滤，操作压力为0.25MPa,过滤去掉灰分、有机物、胶体小分子物质，然后在常压条件下进行单效节能浓缩，直至浓缩前后体积比为8:1，浓缩液经-20℃真空冷冻干燥即可得小球藻蛋白粉；

所述的小球藻细胞壁酶解液，其重量份数比为：

纤维素酶 3g

果胶酶 8g

β-葡聚糖酶 2g

去离子水 6000g；

小球藻细胞壁酶解液配制后用质量分数36%的浓盐酸调节pH至4.5；

（3）小球藻蛋白酶解

采用酶解-超滤两步法，取1份小球藻蛋白粉，加3倍质量份数去离子水溶解，并调整pH至7 .5，加入小球藻蛋白粉质量0.2％的复合蛋白酶液，于45℃条件下进行蛋白酶解，酶解时间50 min；经过中空纤维式孔径0.01μm超滤膜0.25MPa进行超滤，获得超滤液；在超滤液中再加入小球藻蛋白粉质量0 .1％的复合蛋白酶液，调整温度45℃条件下进行复合蛋白酶液酶解，酶解时间50min后；在100℃水浴中灭酶处理10 min，迅速冷却至室温；中空纤维式孔径中孔径0.01μm超滤膜0.25MPa再次超滤,获得超滤液C；

所述的复合蛋白酶液，由胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、水按1：1：20质量份比例配制。

（4）循环浓缩

采用截留分子量为500～2000的纳滤膜对超滤液C进行循环浓缩，控制循环流量在150L/min，膜进口压力为1 .5MPa，浓缩过程料液温度为55℃，待系统压力降至1 .0MPa以下时停止浓缩得到浓缩液，浓缩液经-20真空冷冻干燥即为具有功能活性的小球藻蛋白肽粉。

3）小球藻蛋白肽低醇饮料的制作

（A）配方：按质量份数总计为100 份计，原料质量份数配比为：

干型发酵酒（酒精度11～15%voL） 25

小球藻蛋白肽(粉状) 5

柠檬酸 0.2

蜂蜜 6

木糖醇 4

黄原胶 0.05

羧甲基纤维素钠 0.05

叶绿素铜钠 0.01

其余为去离子水加到质量份数总计为100 份计。

（B）制作步骤：

将黄原胶、羧甲基纤维素钠、木糖醇用部分去离子水溶解，用高速分散机混合得溶解液A；取小球藻蛋白肽、蜂蜜、柠檬酸、叶绿素铜钠加部分去离子水溶解得溶解液B；将上述溶解液A和溶解液B与干型发酵酒混合后，加入去离子水至配方质量份数总计为100 份的饮料混合液。饮料混合液在80℃，220kg/cm²压力下均质得到本发明所述的小球藻蛋白肽低醇饮料。

小球藻蛋白肽低醇饮料灌装后，在121 ℃灭菌15 min杀菌，通过喷淋冷却至常温，即为可供运输与上架的小球藻蛋白肽低醇饮料产品。

该产品色泽亮绿，质地均匀，爽口柔和，无异杂味，酸甜可口，无论从口味还是保健养身均属上乘，具有很好的市场前景。

以上所述的蛋白核小球藻、所用各种酶和原辅助材料均与技术方案相同。

实施例2

1）小球藻预处理

以蛋白核小球藻粉为原料，按照小球藻粉和NaOH稀碱溶液质量比为1: 6将小球藻粉加入到0.3 mol/L NaOH稀碱溶液中，65℃条件下，浸泡50 min，于30MPa压力下高压均质4次，5000 rpm下离心20 min，获得的上清液A和小球藻蛋白沉淀物。上清液A暂置于4℃条件下保存。

2）小球藻蛋白粉制备

（1）将小球藻蛋白沉淀物与小球藻细胞壁酶解液混合后酶解，酶解后于5000 rpm下离心20 min，获得上清液B；

所述的小球藻细胞壁酶解液加入到小球藻蛋白沉淀物，是按1.6：3200重量份比例加入的；

所述的混合后酶解，其条件为：酶解温度50℃、酶解时间4 h、酶解时搅拌转速为150rpm；

（2）将上清液A和上清液B混合成上清液AB，放入90℃水浴锅中，保持20min钝化酶。然后将上清液AB降温至35℃，经过管式孔径10μm超滤膜超滤，操作压力为0.25MPa,过滤去掉灰分、有机物、胶体小分子物质，然后在常压条件下进行单效节能浓缩，直至浓缩前后体积比为10:1，浓缩液经-20℃真空冷冻干燥即可得小球藻蛋白粉；

所述的小球藻细胞壁酶解液，其重量份数比为：

纤维素酶 5g

果胶酶 6g

β-葡聚糖酶 3g

去离子水 7000g；

小球藻细胞壁酶解液配制后用质量分数36%的浓盐酸调节pH至5.0；

（3）小球藻蛋白酶解

采用酶解-超滤两步法，取1份小球藻蛋白粉，加3倍质量份数去离子水溶解，并调整pH至7 .5，加入小球藻蛋白粉质量0.3％的复合蛋白酶液，于50℃条件下进行蛋白酶解，酶解时间30min，经过中空纤维式孔径0.01μm超滤膜0.35MPa进行超滤，获得超滤液；在超滤液中再加入小球藻蛋白粉质量0 .2％的复合蛋白酶液，调整温度50℃条件下进行复合蛋白酶液酶解，酶解时间40 min后；在100℃水浴中灭酶处理10 min，迅速冷却至室温；中空纤维式孔径中孔径0.01μm超滤膜0.35MPa再次超滤,获得超滤液C；

所述的复合蛋白酶液，由胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、水按1：1：20质量份比例配制。

（4）循环浓缩

采用截留分子量为500～2000的纳滤膜对超滤液C进行循环浓缩，控制循环流量在160L/min，膜进口压力为1.8MPa，浓缩过程料液温度为55℃，待系统压力降至1.0MPa以下时停止浓缩得到浓缩液，浓缩液经-20真空冷冻干燥即为具有功能活性的小球藻蛋白肽粉。

3）小球藻蛋白肽低醇饮料的制作

（A）配方：按质量份数总计为100 份计，原料质量份数配比为：

干型发酵酒（酒精度11～15%voL） 25

小球藻蛋白肽(粉状) 5

柠檬酸 0.2

蜂蜜 8

木糖醇 4

黄原胶 0.06

羧甲基纤维素钠 0.1

叶绿素铜钠 0.01

其余为去离子水。按质量份数总计为100 份。

（B）制作步骤：

将黄原胶、羧甲基纤维素钠、木糖醇用部分去离子水溶解，用高速分散机混合得溶解液A；取小球藻蛋白肽、蜂蜜、柠檬酸、叶绿素铜钠加部分去离子水溶解得溶解液B；将上述溶解液A和溶解液B与干型发酵酒混合后，加入去离子水至配方质量份数总计为100 份的饮料混合液。饮料混合液在80℃，220kg/cm²压力下均质得到本发明所述的小球藻蛋白肽低醇饮料。

小球藻蛋白肽低醇饮料灌装后，在121℃灭菌15 min杀菌，通过喷淋冷却至常温，即为可供运输与上架的小球藻蛋白肽低醇饮料产品。

该产品色泽亮绿，质地均匀，爽口柔和，无异杂味，酸甜可口，无论从口味还是保健养身均属上乘，具有很好的市场前景。

以上所述的蛋白核小球藻、所用各种酶和原辅助材料均与技术方案相同。

一种小球藻蛋白肽低醇饮料的制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。