专利摘要

本发明利用金纳米粒子作为金纳米笼的孔帽，提出一种新的具有生物控释作用的纳米荧光生物传感器及其制备方法和应用。该传感器的特点是：利用DNA杂交技术，将金纳米粒子组装到金纳米笼表面，形成孔帽开关，实现对金纳米笼内物质的封堵。本发明的纳米生物传感器具有结构简单，信号灵敏，可控性强等特性。采用本发明提出的纳米荧光生物传感器可在1.0×10‑9～1.0×10‑7M范围内实现对ATP的高灵敏检测，具有灵敏、经济、操作简单等优点，在生物医学、生命科学等领域具有较大的应用潜力和广阔的应用前景，为重大疾病的早期诊断及治疗，特别是对基于纳米载体控释技术的肿瘤靶向药物、光热治疗的研究和应用提供新的途径和方法。

权利要求

1.一种纳米荧光生物传感器，以金纳米粒子作为金纳米笼的孔帽，用于封堵金纳米笼内的物质，防止其外泄，其特征在于：所述的金纳米粒子是通过DNA杂交技术被组装到金纳米笼表面。

2.一种如权利要求1所述的纳米荧光生物传感器，其特征在于：所述的金纳米笼内的物质可以是荧光分子。

3.一种如权利要求1所述的纳米荧光生物传感器，其特征在于：

所述的金纳米粒子是通过单链DNAS2与单链DNAS1的杂交互补作用被组装到金纳米笼表面，其中，单链DNAS1通过Au-S键作用被修饰到金纳米笼表面。

4.一种如权利要求3所述的纳米荧光生物传感器，其特征在于：

单链DNAS1的序列为：5'-CAC TGG GTT GGG CGG GAT TTT TTT TTT-SH-3';

单链DNAS2的序列为：5'-SH-TTT TTT ATC CCG CCC AAC CCA GTG ATT GCG GAG G-3';

所述的金纳米粒子通过Au-S键的作用与DNAS2的5'端结合。

5.一种如权利要求1所述的纳米荧光生物传感器的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)在磁珠-金纳米笼的复合物中加入 DNAS1和 DTT溶液，室温振荡过夜，将S1修饰到金纳米笼表面；

(2)磁分离上述溶液，用PBS缓冲溶液清洗后加入罗丹明B溶液，室温振荡过夜；

(3)将金纳米粒子与DNA S2和 DTT的混合溶液置于室温振荡过夜；

(4)将(3)步所得溶液与(2)步所得溶液混合，发生DNAS2与DNAS1的杂交反应，使金纳米粒子被组装到金纳米笼表面，形成可将金纳米笼孔封堵的孔帽，防止罗丹明B的外泄，磁分离，移除上清液，用PBS清洗后重新分散，即制得纳米荧光生物传感器；

其中，所述的磁珠-金纳米笼的复合物按如下方法制备而成：将磁珠与金纳米笼的混合溶液置于室温振荡反应10 h，磁分离，用 PBS缓冲溶液清洗，移除上清液，即得。

6.一种如权利要求1-4中任一项所述的纳米荧光生物传感器的应用，其特征在于用于ATP的检测，方法如下：

(1)在ATP适体复合物中加入ATP样品溶液，37℃恒温振荡反应1 h，ATP与ATP适体特异性结合，将引物DNAS3竞争下来；

(2)磁分离上述溶液，取上清液加入到如权利要求1-4中任一项所述的纳米荧光生物传感器的PBS悬浮液中，使被竞争下来的引物S3发生杂交反应，再加入外切酶ExoⅢ，发生酶切反应，使孔帽不断被打开，释放出荧光分子；

(3)磁分离上述溶液，收集上清液，检测其荧光信号；

其中，所述的ATP适体复合物按如下方法制备而成：将羧基磁珠与氨基修饰的ATP适体溶液混合，室温振荡过夜，磁分离，移除上清液，加入引物DNAS3溶液，37℃恒温振荡反应1h，生成由引物S3和ATP适体杂交而成的双链结构，磁分离，即得；其中，引物DNAS3的序列为：5'-CCT CCG CAA T-3'。

说明书

技术领域

本发明属于生物化学及生命科学分析领域，具体涉及一种纳米荧光生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，纳米技术在生物医疗及生命科学领域得到广泛的研究和应用，其中，金纳米笼作为一种新兴的金纳米材料备受关注。该纳米材料是一种中空、多孔的笼状颗粒结构，光滑的笼壁表面上分布着小孔。与传统的球型金纳米颗粒相比，金纳米笼的局域表面等离子共振峰位于近红外区700～900nm，该波段对于生物医学意义重大，尤其是对于活体组织及细胞的研究。将金纳米笼与金纳米粒子孔帽和酶切放大技术相结合的生物活性分子的检测技术还未见文献报道。

ATP(三磷酸腺苷)是一种广泛存在于生物细胞内的辅酶，由腺苷和三个磷酸基所组成，化学式C10H16N5O13P3，分子量507.184，在细胞中的含量是1-10mM。ATP在细胞的新陈代谢及各种生化反应的能量供应中扮演着极其重要的角色，是体内组织细胞所需能量的主要来源。作为细胞内能量储存和传递的“分子通货”，它参与蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成，对细胞许多代谢过程均有重要的调节作用。

ATP含量的变化直接反映细胞的变异和损伤。当细胞受损或死亡后，细胞内的ATP含量明显降低。另外，作为活细胞最基本的能量来源，ATP水平与活细胞数值呈正相关的线性关系。因此，ATP作为重大疾病的标志物之一得到了广泛的的研究和报道。建立快速、灵敏而又准确的ATP检测方法不仅有助于癌症等重大疾病的早期诊断与治疗，同时，对于临床医学、生命科学、食品卫生、环境监测、医药及化妆品等诸多领域也具有重要的意义。

常规的ATP的检测方法除了高效液相色谱法以外，其它还有电泳法、分光光度法和生物发光法等。这些方法在灵敏度、准确性、选择性等方面还有待提高。为此，迫切需要开发一种高灵敏、高选择性的检测技术用于ATP的检测。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，针对检测ATP的基于金纳米粒子孔帽的纳米荧光生物传感器未见报道，因此，本发明的第一目的：构建并制备一种新型的可用于检测ATP的纳米荧光生物传感器，将具有金纳米粒子孔帽开关的金纳米笼材料与DNA外切酶循环放大技术相结合，使该纳米荧光生物传感器不但具有可控的纳米孔帽开关，而且经过DNA外切酶的循环放大作用，释放出大量荧光分子，通过对显著增强的荧光信号的检测实现对ATP的高灵敏检测；本发明的第二目的：提供一种该纳米荧光生物传感器的制备方法；本发明的第三目的：提供一种应用该纳米荧光生物传感器检测ATP的方法。将本发明提出的纳米荧光生物传感器用于ATP的荧光检测，能够显著提高ATP检测的灵敏度。

本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。本发明的纳米荧光生物传感器是以金纳米笼作为载体，利用其中空、多孔的结构特性，在其内部装载荧光分子，为了防止荧光分子的外泄，通过在其表面组装金纳米粒子，形成孔帽开关，将金纳米笼表面的孔封堵；所述的金纳米粒子孔帽开关的形成首先通过Au-S键作用将单链DNAS1修饰到金纳米笼表面，然后加入由单链DNAS2修饰的金纳米粒子，通过DNAS2与DNAS1的杂交互补，将金纳米粒子组装到金纳米笼表面，形成孔帽开关。

优选地，上述纳米荧光生物传感器，

所述的单链DNAS1的序列为：5'-CAC TGG GTT GGG CGG GATTTT TTT TTT-SH-3'；

所述的单链DNAS2的序列为：5'-SH-TTT TTTATC CCG CCCAAC CCA GTGATT GCGGAG G-3'；

所述的金纳米粒子通过Au-S键的作用与DNAS2的5'端结合；

其中，DNAS2中除了含有与DNAS1互补的序列以外，还含有与引物链DNAS3互补的序列；

所述的引物链DNAS3的序列为：5'-CCT CCG CAAT-3'；

优选地，上述纳米荧光生物传感器，所述的荧光分子是罗丹明B。

一种制备上述纳米荧光生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)在磁珠-金纳米笼的复合物中加入DNAS1和DTT溶液，室温振荡过夜，将DNAS1修饰到金纳米笼表面；

(2)磁分离上述溶液，用PBS缓冲溶液清洗后加入罗丹明B溶液，室温振荡过夜；

(3)将金纳米粒子与DNA S2和DTT的混合溶液置于室温振荡过夜；

(4)将(3)步所得溶液与(2)步所得溶液混合，发生DNAS2与DNAS1的杂交反应，使金纳米粒子被组装到金纳米笼表面，形成可将金纳米笼孔封堵的孔帽，防止罗丹明B的外泄，磁分离，移除上清液，用PBS清洗后重新分散，即制得纳米荧光生物传感器；

其中，所述的磁珠-金纳米笼的复合物按如下方法制备而成：将磁珠与金纳米笼的混合溶液置于室温振荡反应10h，磁分离，用PBS缓冲溶液清洗，移除上清夜，即得。

一种利用本发明的纳米荧光生物传感器用于ATP的检测方法，包括如下步骤：

(1)在ATP适体复合物中加入ATP样品溶液，37℃恒温振荡反应1h，ATP与ATP适体特异性结合，通过竞争性置换反应，将引物DNAS3竞争下来；

(2)磁分离上述溶液，取上清液加入到本发明的纳米荧光生物传感器的PBS悬浮液中，使被竞争下来的引物S3与S2发生杂交反应，再加入外切酶ExoⅢ，发生酶切反应，使双链中的S2被剪切，孔帽不断被打开，释放出荧光分子；

(4)磁分离上述溶液，收集上清液，检测其荧光信号；

其中，所述的ATP适体复合物按如下方法制备而成：将羧基磁珠与氨基修饰的ATP适体溶液混合，室温振荡过夜，磁分离，移除上清液，加入引物DNAS3溶液，37℃恒温振荡反应1h，生成由引物S3和ATP适体杂交而成的双链结构，磁分离，即得；其中，ATP适体的序列为：5'-NH2-TTT TAAACC TGG GGGAGTATT GCG GAG GAA GGT-3'。

本发明的有益效果

本发明提出的纳米荧光生物传感器及其制备方法和应用将纳米孔帽与DNA杂交技术相结合，通过靶分子及其适体间特异性的分子识别反应及酶切放大技术，可实现对ATP高灵敏、高选择性的检测。与传统的适体生物传感器技术相比，无需对ATP适体进行结构上的修饰，避免了任何结构上的修饰而导致的适体特异性和结合性的降低以及由此产生的灵敏度的降低。利用该纳米荧光生物传感器检测ATP，通过引物链及外切酶引发DNA杂交及剪切的循环反应，使金纳米粒子孔帽开关不断被打开，释放出荧光分子，实现了荧光信号的放大，使ATP的检测灵敏度得到显著提高。

本发明的纳米荧光生物传感器结构简单，荧光信号灵敏，可控性强，具有优异的选择性，在生物医学、生命科学等领域具有较大的应用潜力和广阔的应用前景，可用于肿瘤标志物如ATP的高灵敏、特异性检测，为重大疾病的早期诊断及治疗，特别是肿瘤的靶向药物、光热治疗等基于纳米载体的控释技术的研究和应用提供新的途径和方法。

附图说明

图1本发明的纳米荧光生物传感器的制备及其用于ATP的检测原理图。

图2不同ATP浓度的荧光信号强度。

图3ATP浓度与荧光信号强度的线性关系。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下面通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。

实验仪器：F-4600荧光分光光度计(日立，日本)；磁性分离架(天津倍思乐色谱技术开发中心)；THZ-82A气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂)。

实验试剂：所用人工合成DNA序列均由北京赛百盛生物工程有限公司购得；3-4μm羧基修饰磁珠，巯基修饰磁珠(天津市倍思乐色谱技术开发中心)；罗丹明B(RhB，阿拉丁)；三磷酸腺苷(ATP，阿拉丁)；二硫苏糖醇(DTT，阿拉丁)；ExoⅢ核酸外切酶及其buffer(Thermo Scientific，美国)；PBS溶液为0.01M(pH 7.4,Na2HPO4-NaH2PO4)。

实施例1：

一种制备本发明纳米荧光生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)在磁珠-金纳米笼的复合物中加入10μL 1.0×10-5M DNAS1和10μL 1.0×10-3MDTT溶液，用PBS稀释至100μL，室温振荡过夜，将DNAS1修饰到金纳米笼表面；

(2)磁分离上述溶液，用PBS缓冲溶液清洗后加入100μL1.0×10-5M罗丹明B溶液，室温振荡过夜；

(3)将200μL金纳米粒子与10μL 1.0×10-5M DNA S2和10μL 1.0×10-3M DTT的混合溶液置于室温振荡过夜；

(4)将(3)步所得溶液与(2)步所得溶液混合，室温下反应2h，发生DNAS2与DNAS1的杂交反应，使金纳米粒子被组装到金纳米笼表面，形成可将金纳米笼孔封堵的孔帽，防止罗丹明B的外泄，磁分离，移除上清液，用PBS清洗后重新分散，即制得纳米荧光生物传感器；

其中，所述的磁珠-金纳米笼的复合物按如下方法制备而成：将20μL巯基磁珠与400μL金纳米笼均匀混合，室温振荡反应10h，磁分离，用PBS溶液清洗，移除上清液，即得；所述的巯基磁珠是购买的商品(天津市倍思乐色谱技术开发中心)；所述的金纳米粒子(AuNPs)按文献方法获得(L.Tang,I.S.Chun,Z.Wang，J.Li,X.Li,Y.Lu.Analytical Chemistry2013,85(20):9522-9527)；所述的金纳米笼按文献方法获得(G.D.Moon,S.W.Choi,X.Cai,W.Y.Li,E.C.Cho,U.Jeong,L.V.Wang and Y.N.Xia.J.Am.Chem.Soc.2011,133,4762-4765)。

实施例2:

一种利用本发明的纳米荧光生物传感器用于ATP的检测，方法如下：

(1)在ATP适体复合物中加入10μLATP样品溶液，用PBS稀释至100μL，37℃恒温振荡1h，ATP与其适体特异性结合，通过竞争性置换反应，将引物DNAS3竞争下来；

(2)磁分离上述溶液，取上清液加入到本发明的纳米荧光生物传感器的PBS悬浮液中，37℃反应2h，引物S3与S2发生杂交反应，再加入外切酶ExoⅢ，37℃反应2h，酶切反应将双链中的S2剪切，引物S3进入循环，孔帽开关不断被打开，释放出荧光分子；

(3)磁分离上述溶液，收集上清液，检测其荧光信号，荧光检测条件：激发波长和发射波长分别为530、573nm；

其中，所述的ATP适体复合物按如下方法制备而成：10μL羧基磁珠与10μL 1.0×10-5M氨基修饰的ATP适体链混合，用PBS稀释至100μL，室温振荡过夜，磁分离，移除上清液，加入100μL 1.0×10-6M引物DNAS3溶液，37℃恒温振荡反应1h，生成由引物S3和ATP适体组成的双链结构，磁分离，除去上清液，即得；其中，ATP适体的序列为：5'-NH2-TTT TAAACC TGGGGGAGTATT GCG GAG GAA GGT-3'。

图1为本发明的纳米荧光生物传感器的制备及其用于ATP的检测原理图。图2为不同ATP浓度的荧光信号强度，ATP的浓度分别为(0；1.0×10-9；5.0×10-9；1.0×10-8；2.0×10-8；5.0×10-8；8.0×10-8；1.0×10-7；2.5×10-7；5.0×10-7M)。图3为ATP浓度与荧光信号强度的线性关系。结果表明，ATP浓度在1.0×10-9～1.0×10-7M时，荧光信号△F与ATP的浓度呈现良好的线性关系，其线性方程为：△F＝64.1209+54.0283CATP(10-8M)，线性相关系数R＝0.9933。

本发明将金纳米粒子、DNA杂交技术、生物酶切循环信号放大技术与纳米载体相结合，提出一种新的基于金纳米粒子为孔帽开关的纳米荧光生物传感器，实现了ATP的高灵敏、高选择性的检测。本发明具体是通过生物分子的特异性识别反应，利用引物链及生物剪切酶的作用引发链杂交及链剪切的循环反应，使金纳米粒子孔帽开关不断被打开，释放出荧光分子，实现了荧光信号的倍增放大，显著提高ATP的检测灵敏度。

本发明的纳米荧光生物传感器结构简单，荧光信号灵敏，可控性强，具有优异的选择性，可应用于生物体系中ATP的荧光检测。实验结果表明，采用本发明提出的纳米荧光生物传感器可在1.0×10-9～1.0×10-7M浓度范围内实现对ATP的高灵敏检测，具有灵敏、经济、操作简单等优点，在生物医学、生命科学等领域具有较大的应用潜力和广阔的应用前景，为重大疾病的早期诊断及治疗，特别是肿瘤的靶向药物、光热治疗等基于纳米载体的控释技术的研究和应用提供新的途径和方法。

一种纳米荧光生物传感器及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。