专利摘要
本发明公开了一种纳米硒化铜(CuSe)作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢和L‑半胱氨酸的应用。纳米硒化铜作为过氧化物模拟酶，具有过氧化物酶的活性。本发明首次发现纳米硒化铜具有过氧化物模拟酶的功能，可用于检测过氧化氢的含量；本发明发现L‑半胱氨酸可以抑制纳米硒化铜对于TMB和H2O2的催化氧化反应，可用于检测L‑半胱氨酸的浓度；本发明制备的纳米硒化铜作为催化剂相比于HRP，具有稳定性高，可重复使用，以及高效的过氧化物模拟酶催化活性；本发明发现在无过氧化氢存在下，纳米硒化铜同样可以催化显色剂，作为模拟酶使用；本发明中的制备方法工艺简单，可操作性强，能进一步满足生产和应用。
权利要求
1. 一种纳米硒化铜作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢及L-半胱氨酸浓度的应用，其特征在于：所述纳米硒化铜的化学式为CuSe，所述纳米硒化铜作为过氧化物模拟酶，具有过氧化物酶的活性；其中，所述纳米硒化铜作为过氧化物模拟酶检测过氧化氢浓度包括以下步骤：在一系列的5mL比色管中，分别依次加入0.2mL 1mmol/L的TMB溶液、0.2mL 1mg/L 的CuSe溶液、及不同量的过氧化氢溶液，充分混合均匀；用pH＝4.5的0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液定容，用紫外可见分光光度计测定吸光度，绘制吸光度-过氧化氢浓度标准曲线，根据溶液吸光度值推断H2O2的浓度；
所述纳米硒化铜作为过氧化物模拟酶检测L-半胱氨酸的浓度包括以下步骤：将200μL浓度为 1mM的TMB、200μLCuSe浑浊液、200μLH2O2加入到1400μL PBS缓冲液中，然后利用紫外可见分光光度计测定吸光度；将不同浓度的L-半胱氨酸加入到上述CuSe反应体系中，反应5min，测定溶液的吸光度；以不含L-半胱氨酸的溶液的吸光度与含不同浓度的 L-半胱氨酸溶液的吸光度之差为纵坐标，以L-半胱氨酸溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线推断L-半胱氨酸的浓度；
其中，所述TMB为3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
说明书
技术领域
本发明涉及一种纳米硒化铜(CuSe)作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢和L-半胱氨酸的应用。本发明属于纳米生物化学检测领域。
背景技术
生物酶是高效催化剂，其催化效率高、专一性强、反应条件温和。但是，天然酶的催化作用对环境条件要求严苛，凡是能使蛋白质变性或结构破坏的因素如强酸、强碱、高温等条件都能损坏酶分子而使其失去活性，而且天然酶价格昂贵，提纯困难，储藏和使用成本高，为此模拟酶的研究具有十分重要的意义。自2007年首次发现磁性四氧化三铁纳米粒子(Fe3O4NPs)具备过氧化物酶的催化活性，即Fe3O4NPs能够催化H2O2与辣根过氧化物酶的底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)、重氮胺基苯(DAB)等反应，表现出与HRP相类似的催化作用。此后，各种具有过氧化物模拟酶特性的纳米颗粒纷纷被合成和表征，包括以石墨烯为主的碳材料、以贵金属为主的金属单质、以金属氧化物为主的金属化合物，以及金属有机框架(MOF)等。相比于天然酶，模拟酶作为催化剂具有稳定性高，可重复使用，高效的催化活性等优点。
本发明提供了一种纳米硒化铜颗粒作为过氧化物模拟酶检测过氧化氢和L-半胱氨酸的方法。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明目的在于提供一种纳米硒化铜过氧化物模拟酶用于检测过氧化氢和L-半胱氨酸的新方法。该纳米硒化铜可以催化过氧化氢产生强氧化性的羟基自由基，高效催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)产生显色反应，而L-半胱氨酸的加入可以有效抑制氧化反应的进行。具有反应时间短，显色快，催化效果和适用性好的优点。
一种纳米硒化铜作为过氧化物模拟酶测定过氧化氢和L-半胱氨酸浓度的应用，其特征在于：纳米硒化铜作为过氧化物模拟酶，具有过氧化物酶的活性。
可以检测过氧化氢浓度的方法，检测限为2.9×10-6M。
可以检测L-半胱氨酸浓度的方法，检测限为0.2×10-6M。
催化过氧化氢氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)，由无色变为蓝色。
其缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。
纳米硒化铜具有在无过氧化氢存在下，仍具有催化氧化酚类物质的能力，除是优良的过氧化物模拟酶外，还是废水处理的优良催化剂。
1.纳米硒化铜的合成
将硒粉和氢氧化钠(NaOH)溶液混合，搅拌至硒粉完全溶解，将硒的氢氧化钠溶液加入到硫酸铜(CuSO4)溶液和乙二胺四乙酸(EDTA)溶液的混合溶液中，搅拌均匀，用NaOH溶液调节混合后的溶液的pH为12，然后将混合物溶液放入高压釜中，180℃水热反应。离心，洗涤，真空干燥，即可得到纳米硒化铜。
2.TMB作为显色剂，测定H2O2浓度
向比色管中加入一定浓度的硒化铜和TMB溶液，然后加入不同量的H2O2，使得H2O2形成浓度梯度。最后用磷酸盐缓冲溶液定容，用紫外可见分光光度计测定吸光度，绘制吸光度-过氧化氢浓度标准曲线，可以根据溶液吸光度值推断H2O2的浓度，检测限为2.9×10-6M。
3.TMB作为显色剂，在H2O2存在下，测定L-半胱氨酸浓度
向比色管中加入一定浓度的硒化铜，TMB溶液和过氧化氢溶液，然后加入不同浓度的L-半胱氨酸，反应后，用紫外可见分光光度计测定吸光度，以吸光度值的减少为纵坐标，以L-半胱氨酸的浓度为横坐标绘制标准曲线，可以根据标准曲线推断L-半胱氨酸的浓度，检测限为0.2×10-6M。
由上述技术方案可知，本发明所述的纳米硒化铜具有过氧化物酶的功能，可催化过氧化氢氧化过氧化物酶底物，是一种新型的过氧化物模拟酶，可用于过氧化氢的检测。而L-半胱氨酸的加入可以有效抑制氧化反应的进行，抑制作用与L-半胱氨酸的浓度有关，因而也可以检测L-半胱氨酸的浓度。
本发明的优点在于：
(1)本发明首次发现纳米硒化铜具有过氧化物模拟酶功能，可用于检测过氧化氢的含量；
(2)本发明发现L-半胱氨酸可以抑制纳米硒化铜对于TMB和H2O2的催化氧化；
(3)本发明制备的纳米硒化铜作为催化剂相比于HRP，具有稳定性高，可重复使用，以及高效的过氧化物酶催化活性；
(4)本发明发现在无过氧化氢存在下，纳米硒化铜同样可以催化显色剂，作为模拟酶使用；
(5)本发明中的制备方法工艺简单，可操作性强，能进一步满足生产和应用。
附图说明
图1为本发明制备的纳米硒化铜的扫描电镜图。
图2为本发明制备的纳米硒化铜的XRD表征图。
图3为实施例2以TMB为显色剂，纳米硒化铜检测过氧化氢的标准曲线。
图4为实施例3以TMB为显色剂，在过氧化氢存在时，纳米硒化铜检测L-半胱氨酸的标准曲线。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。
实施例1；
纳米硒化铜的合成。
将0.01mol硒粉和10mL NaOH(13mol/L)溶液混合，搅拌直至硒粉完全溶解。将10mL0.05mol/LCuSO4溶液10mL0.05mol/L的EDTA溶液混合，搅拌，然后加入硒-NaOH溶液并搅拌均匀，然后用NaOH溶液调节混合反应物的pH为12，然后将混合物溶液放入100mL的不锈钢高压釜中，180℃水热反应36h。当反应混合物冷却到室温时，将沉淀物离心，用无水乙醇洗涤几次。然后样品在60℃真空干燥6h，即可得到纳米硒化铜。
图1为本发明制备的纳米硒化铜的扫描电镜图。
图2为本发明制备的纳米硒化铜的XRD表征图。
实施例2；
纳米硒化铜作为过氧化物模拟酶检测过氧化氢含量。
在一系列的5mL比色管中，分别依次加入0.2mL 1mmol/L的TMB溶液、0.2mL 1mg/L的CuSe溶液、及不同量的过氧化氢溶液，充分混合均匀。用0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝4.5)定容。用紫外可见分光光度计测定吸光度，绘制吸光度-过氧化氢浓度标准曲线，可以根据溶液吸光度值推断H2O2的浓度。
图3为以TMB为显色剂，纳米硒化铜检测过氧化氢的标准曲线。
实施例3；
纳米硒化铜作为过氧化物模拟酶检测L-半胱氨酸的含量。
将200μL TMB(1mM)、200μLCuSe浑浊液、200μLH2O2加入到1400μL PBS缓冲液中然后利用紫外可见分光光度计测定吸光度。将不同浓度的L-半胱氨酸加入到上述CuSe反应体系中，反应5min，测定溶液的吸光度。以不含L-半胱氨酸的溶液的吸光度与含不同浓度的L-半胱氨酸溶液的吸光度之差为纵坐标，以L-半胱氨酸溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线，可以根据标准曲线推断L-半胱氨酸的浓度。
图4为以TMB为显色剂，在过氧化氢存在时，纳米硒化铜检测L-半胱氨酸的标准曲线。
纳米硒化铜作为过氧化物模拟酶检测过氧化氢和L-半胱氨酸的应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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