专利摘要
本发明公开了种基于SERS技术检测鱼肉中组胺的方法。其技术方案包括：1)利用油酸钠与十六烷基三甲基溴化铵双表面活性剂法制备金纳米棒，在其表面修饰上4‑巯基苯胺连接银离子，以抗坏血酸为还原剂，在其表面上还原出银层。2)将鱼肉粉碎成泥，等量分成若干份，加入不同浓度组胺的标准溶液混合均匀。加入无水乙醇与正己烷去除鱼肉样品中的油脂等物质，再加入磁珠富集样品中的组胺；3）将合成的棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子修饰上NTA，加入到富集了组胺的磁珠中，形成磁珠/组胺/Au@Ag纳米粒子的三明治模型。利用激光拉曼光谱仪采集数据图谱，实现对鱼肉中组胺含量的超灵敏检测，本方法适用范围为0.2‑20ug/kg。
权利要求
1.一种基于SERS技术检测鱼肉中组胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)改性棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子制备：将100μL带内标4-巯基苯胺的棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子与100μL浓度为10
2)功能化磁纳米粒子的制备：带羧基的磁纳米粒子用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐处理，得功能化磁纳米粒子；
3)鱼肉样品的处理：分别去取3-7份质量均为2-10g的新鲜鱼肉泥，接着往鱼肉样品中加入组胺标准液，再先后加入4-8mL乙醇和6-10mL正己烷混匀，提取3-5次样品中的组胺，去下层清液作为待测样品；将步骤1)制备的改性棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子与步骤2)制备的功能化磁纳米粒子各取100μL加入鱼肉样品中，形成磁珠/组胺/Au@Ag纳米粒子的三明治模型；将混合好后的磁纳米粒子/组胺/Au@Ag核壳结构纳米粒子样品滴在盖玻片上；利用激光拉曼光谱仪采集数据图谱，以内标的特征峰强度与组胺浓度建立工作曲线，并利用该工作曲线实现对鱼肉中组胺含量的检测；
所述棒状Au@Ag核壳纳米粒子制备方法如下：取5-30mL的制备好的金棒溶液，离心洗涤后，加入30μL 0.2-20mM的4-巯基苯胺乙醇溶液，反应30min后，离心洗涤，用十六烷基三甲基氯化铵重分散至5-30mL得内标金棒溶液，取3-5mL内标金棒溶液，加入9mL 20mM的十六烷基三甲基氯化铵和35-75μL 100mM的硝酸银溶液，接着再加入140-300μL 100mM抗坏血酸溶液；静置70℃条件下反应3h后离心洗涤，重分散在3mL蒸馏水中，得棒状Au@Ag核壳纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的一种基于SERS技术检测鱼肉中组胺的方法，其特征在于，金棒溶液的制备方法如下：向0.025mL 10mM氯金酸中依次加入1mL 0.1M的十六烷基三甲基溴化铵溶液和1mL 10mM的硼氢化钠溶液，反应30min，得到的金种子溶液；取0.8mL的金种子溶液与500mL生长液混合，接着加入1.25mL 64mM的抗坏血酸，30℃，不搅拌反应48h，得纳米金棒溶液。
3.根据权利要求2所述的一种基于SERS技术检测鱼肉中组胺的方法，其特征在于，生长液的制备方法如下：取7.0gCTAB和1.234g油酸钠加入250mL温度为50℃的蒸馏水中，反应至水温为30℃时停止；接着依次加入18mL 4mM硝酸银溶液不搅拌反应15min和1mM 250mL的氯金酸溶液，搅拌，反应90min，最后加入2.1mL 37％wt的盐酸溶液反应15min制得生长液。
4.根据权利要求3所述的一种基于SERS技术检测鱼肉中组胺的方法，其特征在于，步骤2)的具体步骤为：取100μL羧基化的磁纳米粒子，用PBS缓冲液洗涤两次后，加入100μL 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐活化1h。
5.根据权利要求3所述一种基于SERS技术检测鱼肉中组胺的方法，其特征在于：所述硝酸银溶液和抗坏血酸溶液的体积比为1:4。
6.根据权利要求1所述一种基于SERS技术检测鱼肉中组胺的方法，其特征在于：步骤3)中所述的组胺标准液的浓度范围为10
7.根据权利要求1所述的一种基于SERS技术检测鱼肉中组胺的方法，其特征在于：步骤3)的工作曲线为y＝-4004.58x+33030.91。
8.根据权利要求1所述的一种基于SERS技术检测鱼肉中组胺的方法，其特征在于：鱼肉中组胺检测范围为0.2-20μg/kg。
说明书
技术领域
本发明属于检测的技术领域，具体涉及一种基于磁纳米粒子分离与棒状Au@Ag核壳纳米粒子的SERS技术检测鱼肉中组胺的方法。
背景技术
组胺是一种重要的生物胺，是由组氨酸脱羧酶催化脱羧组氨酸得到的，主要存储于人体中的肥大细胞和嗜碱性粒细胞中。它参与免疫系统，当人体受到过敏原刺激时，会释放组胺，作用于皮肤、肠道、大脑、脊髓等，引起血管扩张，导致水肿、血压降低，产生各种相应的症状，损害身体健康。中国国家食品安全标准规定，新鲜鱼中允许使用高达400毫克/千克的组胺。当鱼肉不新鲜或者存储不当易造成组胺含量急剧增加，摄入富含组胺的食物被认为是一种潜在的风险，可能导致组胺中毒。作为速发型超敏反应的炎性介质，当血液中的组胺达到一定水平时，将产生过敏性休克甚至死亡。因此，开发一种快速、灵敏、可靠的鱼类组胺检测方法迫在眉睫。
表面增强拉曼光谱技术（SERS）是指在金、银等金属纳米粒子粗糙表面吸附待测分子，会使的其拉曼信号增强106-14，甚至实现单分子检测。因表面增强拉曼光谱技术具有灵敏度高，快速便捷，样品的需求量少，对样品损伤等优点，现被广泛应用于环境，食品，生物样品中的恒量物质检测。
传统的组胺检测方法有：荧光法、高效液相色谱法、气相色谱、毛细管电泳法、酶联免疫法等，虽然有些方法灵敏度高，但是因其预处理繁琐，设备昂贵，试剂盒不可重复利用，且对检测环境要求高等缺点，使得这些方法的应用受到了一定程度的限制。
专利一种表面增强拉曼光谱定性定量分析米鱼肌肉中组胺的方法（CN 107345911A），具体公开了一种利用简单金、银纳米粒子做SERS基底来直接检测组胺的方法，得到的SERS谱图结合DFT中B3LYP杂化泛函，B3LYP为Becke3型参数密度泛函模型对组胺进行理论拉曼光谱计算，根据官能团特征振动频率来解析组胺的拉曼特征谱峰，上述方法虽然在一定程度上简化了SERS基底的制备过程，但是利用该基底检测组胺的灵敏度不够高，只利用单纯的官能团振动峰来定量检测组胺，无法确保得到的峰强完全来源于组胺，易受鱼肉样品中其他杂质的影响。且单纯的金、银纳米粒子增强效果不够好，能够检测的组胺浓度范围更小，只能达到1mg/L，这将不适用于对微量组胺进行检测。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种基于磁纳米粒子分离与棒状Au@Ag核壳纳米粒子的SERS技术检测鱼肉中组胺的方法。本方法依赖于棒状Au@Ag纳米粒子的组胺SERS检测基底的双金属核壳结构来实现等离子体共振，从而形成SERS活性热点，使中间包裹的内标物质4-巯基苯胺既增强了特征SERS信号，又能免受检测环境的干扰。同时利用磁纳米粒子快速分离的作用，免于离心洗涤等繁琐的处理工作，使得本发明具有易于操作，灵敏度高，特异性强，不受环境因素影响与节约经济和时间成本的优点。该发明中涉及到的棒状双金属纳米核壳结构，其中纳米金核长90-110nm，宽18-23nm，纳米银壳为5-15nm，中间为4-巯基苯胺，其中以2×10-4 mol/L的浓度修饰最佳。适用的组胺检测范围为10-3-10-8mol/L，鱼肉中能检测的最低检测限为0.2ug/kg，远远超出国家规定检测标准。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
1、Au@Ag核壳结构纳米粒子制备
1）合成金种子溶液：取0.025mL 10mM的氯金酸加入1mL 0.1M的CTAB，再加入1mL 10mM的硼氢化钠，室温下反应30min，得金种子溶液；
2）制备生长液：取7.0gCTAB 和1.234g 油酸钠加入250mL温水（50℃）反应至水温为30℃ 时停止；加入18mL 4mM硝酸银溶液不搅拌反应15min；加入1mM 250mL的氯金酸溶液，搅拌，反应90min，最后加入2.1mL 37%wt的盐酸溶液反应15min制得生长液；
3）合成纳米金棒：取0.8mL的金种子溶液加入到步骤2）制备的500mL生长液中，再加入1.25mL 64mM的抗坏血酸，30℃，不搅拌反应48h，得纳米金棒溶液；
4）修饰内标：取5-30mL 纳米金棒溶液，用水离心洗涤两遍（14000rpm，15min）；取30μL0.2-20mM的4-巯基苯胺乙醇溶液（4-ATP乙醇溶液）加入到离心过后的纳米金棒中搅拌反应30min；用CTAC离心洗涤两遍（8000rpm，10min），重分散在5-30mL 20mM的CTAC中；
5）包裹银壳：取步骤4配置的溶液3mL，加入9mL 20mM的CTAC和一定体积V1 100mM的硝酸银溶液，再加入一定体积V2 100mM抗坏血酸（加入量为硝酸银的4倍mol，不搅拌，70℃反应3h，离心洗涤一遍（8000rpm，10min），重分散在3mL水中备用；
2、改性棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子制备
6）取合成的棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子外修饰上不同浓度（10-3-10-8mol/L）的N，N-双（羧甲基）-L-赖氨酸，反应1h，以此来结合组胺的咪唑环；
3、工作曲线
7）鱼肉样品制备：将相同质量的2-10g搅碎的鱼肉样品加入不同浓度（10-3-10-8mol/L）的组胺至不同含量（0.20-20μg），并旋转30 s以完全混合。然后向混合物中加入乙醇（4-8mL），然后再加入30 s涡流进行萃取。样品以10000转/分的速度离心2min，过滤以收集上清液。用己烷（6-10mL）经30s旋涡离心（10000rpm，2min）脱脂。丢弃己烷层，取底层进行分析；
8）磁珠活化：取100uL带羧基的磁纳米粒子，用PBS缓冲液洗涤两次后，分别加入100uL1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐活化1h，制得功能化磁纳米粒子。
9）浆制备好的100uL功能化磁纳米粒子和100uL改性棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子迅速加入鱼肉样品中反应30min，富集鱼肉中的组胺；将混合好后的磁纳米粒子/组胺/Au@Ag核壳结构纳米粒子样品滴在盖玻片上，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，得到对应浓度的SERS谱图。采集的拉曼图谱是以核壳结构纳米粒子中内标物质4-巯基苯胺的特征峰强度来间接对组胺浓度进行定性定量检测，即磁纳米粒子所富集的组胺越多，那么分离下来的带内标的核壳结构纳米粒子也就越多，从而内边物质的SERS信号也就越强。其内标特征峰为1077，1138，1189，1388，1428，1572cm-1；
10）选取1138cm-1处的峰强度与组胺浓度做工作曲线，工作曲线为y=-4004.58x+33030.91，发现线性很好（R2=0.9907），说明本检测方法受鱼肉中复杂物质的干扰较小，可见该发明的组胺SERS基底具有灵敏度高，特异性好，快速检测等特点；鱼肉中组胺检测范围为0.2-20ug/kg。
本发明的有益效果：
1、本发明采用核壳结构纳米粒子作为SERS基底，核壳之间形成间隙，产生“热点”，从而对内标信号起到增强效果，同时因为银壳的包裹，使得内标不会受到外界杂质的干扰。
2、本发明利用纳米磁珠分离鱼肉中的组胺，既能实现快速分离，又能减少繁琐的操作过程。
3、本发明中采集的拉曼图谱是以核壳结构纳米粒子中内标物质4-巯基苯胺的特征峰强度来间接对组胺浓度进行定性定量检测，即磁纳米粒子所富集的组胺越多，那么分离下来的带内标的核壳结构纳米粒子也就越多，从而内边物质的SERS信号也就越强。其内标特征峰为1077，1138，1189，1388，1428，1572cm-1，选取1138cm-1处的峰强度与组胺浓度做工作曲线y=-4004.58x+33030.91，发现线性最好（R2=0.9907）。
4、本发明带羧基的磁纳米粒子用1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐处理，使所带的羧基活化组胺的氨基结合，起到富集组胺的作用，得功能化磁纳米粒子。
附图说明
图1为基于磁纳米粒子与棒状Au@Ag纳米核壳结构的组胺SERS检测基底的制备过程。
图2为实施例3中金棒与棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子的透射电镜图。
图3为实施例3中金棒与棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子的紫外表征图。
图4为实施例3中金棒与棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子的拉曼表征图。
图5为利用实施例3制备的棒状Au@Ag纳米核壳结构的组胺SERS检测基底检测不同浓度的组胺标准溶液的SERS光谱。
图6为利用图5的SERS光谱所做出的1138cm-1处的波峰强度随组胺浓度变化的工作曲线图。
图7利用实施例3制备的棒状Au@Ag纳米核壳结构的组胺SERS检测基底检测鱼肉样品中不同浓度的组胺标准溶液的SERS光谱。
图8为利用图7的SERS光谱所做出的1138cm-1处的波峰强度随组胺浓度变化的工作曲线图。
图9为利用实施例5的SERS光谱所做出的1388cm-1处的波峰强度随组胺浓度变化的工作曲线图。
图10为利用实施例6的SERS光谱所做出的1572cm-1处的波峰强度随组胺浓度变化的工作曲线图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明进进一步说明，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1（参见图1））
1）取0.025mL，10mM的氯金酸加入1mL，0.1M的CTAB溶液，再加入1mL，10mM的硼氢化钠溶液，室温下反应30min；
2）取7.0gCTAB 和1.234g 油酸钠加入250mL温水（50℃）反应至30℃ 时停止。加入18mL，4mM硝酸银溶液不搅拌反应15min。加入1mM，250mL的氯金酸溶液，搅拌，反应90min，最后加入2.1mL，37%wt的盐酸溶液反应15min；
3）取0.8mL的金种加入到500mL生长液中，再加入1.25mL，64mM的抗坏血酸，30℃，不搅拌反应48h；
4）取30mL 纳米金棒，用水离心洗涤两遍（14000rpm，15min）。取30uL，0.2mM的4-ATP乙醇溶液加入到30mL的纳米金棒中搅拌反应30min。用CTAC离心洗涤两遍（8000rpm，10min），重分散在30mL，20mM的CTAC中；
5）取前面配置好的溶液3mL，加入9mL，20mM的CTAC和35uL，100mM的硝酸银溶液，再加入140uL，100mM抗坏血酸，不搅拌，70℃反应3h，离心洗涤一遍（8000rpm，10min），重分散在3mL水中备用；
6）取合成的棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子外修饰上不同浓度（10-3-10-8mol/L）的N，N-双（羧甲基）-L-赖氨酸，反应1h，以此来结合组胺的咪唑环；
7）将搅碎的鱼肉样品加入不同浓度（10-3-10-8mol/L）的组胺至不同含量（0.20-20ug），并旋转30 s以完全混合。然后向混合物中加入乙醇（4ml），然后再加入30 s涡流进行萃取。样品以10000转/分的速度离心2min，过滤以收集上清液。用己烷（8ml）经30s旋涡离心（10000rpm，2min）脱脂。丢弃己烷层，取底层进行分析；
8）取100uL羧基化的磁纳米粒子，用PBS缓冲液洗涤两次后，分别加入100uL 1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐活化1h，再迅速加入鱼肉样品中反应30min，富集鱼肉中的组胺；
9）将混合好后的磁纳米粒子/组胺/Au@Ag核壳结构纳米粒子样品滴在盖玻片上，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，得到对应浓度的SERS谱图。采集的拉曼图谱是以核壳结构纳米粒子中内标物质4-巯基苯胺的特征峰强度来间接对组胺浓度进行定性定量检测，即磁纳米粒子所富集的组胺越多，那么分离下来的带内标的核壳结构纳米粒子也就越多，从而内边物质的SERS信号也就越强。其内标特征峰为1077，1138，1189，1388，1428，1572cm-1，选取1138cm-1处的峰强度与组胺浓度做工作曲线；工作曲线为y=-4004.58x+33030.91。
实施例2
1）取0.025mL，10mM的氯金酸加入1mL，0.1M的CTAB，再加入1mL，10mM的硼氢化钠，室温下反应30min；
2）取7.0gCTAB 和1.234g 油酸钠加入250mL温水（50℃）反应至30℃ 时停止。加入18mL，4mM硝酸银溶液不搅拌反应15min。加入1mM，250mL的氯金酸溶液，搅拌，反应90min，最后加入2.1mL，37%wt的盐酸溶液反应15min；
3）取0.8mL的金种加入到500mL生长液中，再加入1.25mL，64mM的抗坏血酸，30℃，不搅拌反应48h；
4）取30mL 纳米金棒，用水离心洗涤两遍（14000rpm，15min）。取30uL，0.2mM的4-ATP乙醇溶液加入到30mL的纳米金棒中搅拌反应30min。用CTAC离心洗涤两遍（8000rpm，10min），重分散在30mL，20mM的CTAC中；
5）取前面配置好的溶液3mL，加入9mL，20mM的CTAC和55uL，100mM的硝酸银溶液，再加入220uL，100mM抗坏血酸，不搅拌，70℃反应3h，离心洗涤一遍（8000rpm，10min），重分散在3mL水中备用；
6）取合成的棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子外修饰上不同浓度（10-3-10-8mol/L）的N，N-双（羧甲基）-L-赖氨酸，反应1h，以此来结合组胺的咪唑环；
7）将搅碎的鱼肉样品加入不同浓度（10-3-10-8mol/L）的组胺至不同含量（0.20-20ug），并旋转30 s以完全混合。然后向混合物中加入乙醇（4ml），然后再加入30 s涡流进行萃取。样品以10000转/分的速度离心2min，过滤以收集上清液。用己烷（8ml）经30s旋涡离心（10000rpm，2min）脱脂。丢弃己烷层，取底层进行分析；
8）取100uL羧基化的磁纳米粒子，用PBS缓冲液洗涤两次后，分别加入100uL 1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐活化1h，再迅速加入鱼肉样品中反应30min，富集鱼肉中的组胺；
9）将混合好后的磁纳米粒子/组胺/Au@Ag核壳结构纳米粒子样品滴在盖玻片上，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，得到对应浓度的SERS谱图。采集的拉曼图谱是以核壳结构纳米粒子中内标物质4-巯基苯胺的特征峰强度来间接对组胺浓度进行定性定量检测，即磁纳米粒子所富集的组胺越多，那么分离下来的带内标的核壳结构纳米粒子也就越多，从而内边物质的SERS信号也就越强。其内标特征峰为1077，1138，1189，1388，1428，1572cm-1，选取1138cm-1处的峰强度与组胺浓度做工作曲线；工作曲线为y=-4004.58x+33030.91。
实施例3
1）取0.025mL，10mM的氯金酸加入1mL，0.1M的CTAB，再加入1mL，10mM的硼氢化钠，室温下反应30min；
2）取7.0gCTAB 和1.234g 油酸钠加入250mL温水（50℃）反应至30℃ 时停止。加入18mL，4mM硝酸银溶液不搅拌反应15min。加入1mM，250mL的氯金酸溶液，搅拌，反应90min，最后加入2.1mL，37%wt的盐酸溶液反应15min；
3）取0.8mL的金种加入到500mL生长液中，再加入1.25mL，64mM的抗坏血酸，30℃，不搅拌反应48h；
4）取30mL 纳米金棒，用水离心洗涤两遍（14000rpm，15min）。取30uL，0.2mM的4-ATP乙醇溶液加入到30mL的纳米金棒中搅拌反应30min。用CTAC离心洗涤两遍（8000rpm，10min），重分散在30mL，20mM的CTAC中；
5）取前面配置好的溶液3mL，加入9mL，20mM的CTAC和75uL 100mM的硝酸银溶液，再加入300uL 100mM抗坏血酸，不搅拌，70℃反应3h，离心洗涤一遍（8000rpm，10min），重分散在3mL水中备用；
6）取合成的棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子外修饰上不同浓度（10-3-10-8mol/L）的N，N-双（羧甲基）-L-赖氨酸，反应1h，以此来结合组胺的咪唑环；
7）将搅碎的鱼肉样品加入不同浓度（10-3-10-8mol/L）的组胺至不同含量（0.20-20ug），并旋转30 s以完全混合。然后向混合物中加入乙醇（4ml），然后再加入30 s涡流进行萃取。样品以10000转/分的速度离心2min，过滤以收集上清液。用己烷（8ml）经30s旋涡离心（10000rpm，2min）脱脂。丢弃己烷层，取底层进行分析；
8）取100uL羧基化的磁纳米粒子，用PBS缓冲液洗涤两次后，分别加入100uL 1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐活化1h，再迅速加入鱼肉样品中反应30min，富集鱼肉中的组胺；
9）将混合好后的磁纳米粒子/组胺/Au@Ag核壳结构纳米粒子样品滴在盖玻片上，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，得到对应浓度的SERS谱图。采集的拉曼图谱是以核壳结构纳米粒子中内标物质4-巯基苯胺的特征峰强度来间接对组胺浓度进行定性定量检测，即磁纳米粒子所富集的组胺越多，那么分离下来的带内标的核壳结构纳米粒子也就越多，从而内边物质的SERS信号也就越强。其内标特征峰为1077，1138，1189，1388，1428，1572cm-1，选取1138cm-1处的峰强度与组胺浓度做工作曲线；工作曲线为y=-4004.58x+33030.91。
实施例4
1）取0.025mL，10mM的氯金酸加入1mL，0.1M的CTAB，再加入1mL，10mM的硼氢化钠，室温下反应30min；
2）取7.0gCTAB 和1.234g 油酸钠加入250mL温水（50℃）反应至30℃ 时停止。加入18mL，4mM硝酸银溶液不搅拌反应15min。加入1mM，250mL的氯金酸溶液，搅拌，反应90min，最后加入2.1mL，37%wt的盐酸溶液反应15min；
3）取0.8mL的金种加入到500mL生长液中，再加入1.25mL，64mM的抗坏血酸，30℃，不搅拌反应48h；
4）取30mL 纳米金棒，用水离心洗涤两遍（14000rpm，15min）。取30uL，0.2mM的4-ATP乙醇溶液加入到30mL的纳米金棒中搅拌反应30min。用CTAC离心洗涤两遍（8000rpm，10min），重分散在30mL，20mM的CTAC中；
5）取前面配置好的溶液3mL，加入9mL，20mM的CTAC和150uL，100mM的硝酸银溶液，再加入600uL，100mM抗坏血酸，不搅拌，70℃反应3h，离心洗涤一遍（8000rpm，10min），重分散在3mL水中备用；
6）取合成的棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子外修饰上不同浓度（10-3-10-8mol/L）的N，N-双（羧甲基）-L-赖氨酸，反应1h，以此来结合组胺的咪唑环；
7）将搅碎的鱼肉样品加入不同浓度（10-3-10-8mol/L）的组胺至不同含量（0.20-20ug），并旋转30 s以完全混合。然后向混合物中加入乙醇（4ml），然后再加入30 s涡流进行萃取。样品以10000转/分的速度离心2min，过滤以收集上清液。用己烷（8ml）经30s旋涡离心（10000rpm，2min）脱脂。丢弃己烷层，取底层进行分析；
8）取100uL羧基化的磁纳米粒子，用PBS缓冲液洗涤两次后，分别加入100uL 1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐活化1h，再迅速加入鱼肉样品中反应30min，富集鱼肉中的组胺；
9）将混合好后的磁纳米粒子/组胺/Au@Ag核壳结构纳米粒子样品滴在盖玻片上，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，得到对应浓度的SERS谱图。采集的拉曼图谱是以核壳结构纳米粒子中内标物质4-巯基苯胺的特征峰强度来间接对组胺浓度进行定性定量检测，即磁纳米粒子所富集的组胺越多，那么分离下来的带内标的核壳结构纳米粒子也就越多，从而内边物质的SERS信号也就越强。其内标特征峰为1077，1138，1189，1388，1428，1572cm-1，选取1138cm-1处的峰强度与组胺浓度做工作曲线；工作曲线为y=-4004.58x+33030.91。
实施例5
1）取0.025mL，10mM的氯金酸加入1mL，0.1M的CTAB，再加入1mL，10mM的硼氢化钠，室温下反应30min；
2）取7.0gCTAB 和1.234g 油酸钠加入250mL温水（50℃）反应至30℃ 时停止。加入18mL，4mM硝酸银溶液不搅拌反应15min。加入1mM，250mL的氯金酸溶液，搅拌，反应90min，最后加入2.1mL，37%wt的盐酸溶液反应15min；
3）取0.8mL的金种加入到500mL生长液中，再加入1.25mL，64mM的抗坏血酸，30℃，不搅拌反应48h；
4）取30mL 纳米金棒，用水离心洗涤两遍（14000rpm，15min）。取30uL，0.2mM的4-ATP乙醇溶液加入到30mL的纳米金棒中搅拌反应30min。用CTAC离心洗涤两遍（8000rpm，10min），重分散在30mL，20mM的CTAC中；
5）取前面配置好的溶液3mL，加入9mL，20mM的CTAC和75uL，100mM的硝酸银溶液，再加入300uL，100mM抗坏血酸，不搅拌，70℃反应3h，离心洗涤一遍（8000rpm，10min），重分散在3mL水中备用；
6）取合成的棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子外修饰上不同浓度（10-3-10-8mol/L）的N，N-双（羧甲基）-L-赖氨酸，反应1h，以此来结合组胺的咪唑环；
7）将搅碎的鱼肉样品加入不同浓度（10-3-10-8mol/L）的组胺至不同含量（0.20-20ug），并旋转30 s以完全混合。然后向混合物中加入乙醇（4ml），然后再加入30 s涡流进行萃取。样品以10000转/分的速度离心2min，过滤以收集上清液。用己烷（8ml）经30s旋涡离心（10000rpm，2min）脱脂。丢弃己烷层，取底层进行分析；
8）取100uL羧基化的磁纳米粒子，用PBS缓冲液洗涤两次后，分别加入100uL 1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐活化1h，再迅速加入鱼肉样品中反应30min，富集鱼肉中的组胺；
9）将混合好后的磁纳米粒子/组胺/Au@Ag核壳结构纳米粒子样品滴在盖玻片上，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，得到对应浓度的SERS谱图。采集的拉曼图谱是以核壳结构纳米粒子中内标物质4-巯基苯胺的特征峰强度来间接对组胺浓度进行定性定量检测，即磁纳米粒子所富集的组胺越多，那么分离下来的带内标的核壳结构纳米粒子也就越多，从而内边物质的SERS信号也就越强。其内标特征峰为1077，1138，1189，1388，1428，1572cm-1，选取1388cm-1处的峰强度与组胺浓度做工作曲线；工作曲线为y=-2294.11x+19104.69。
实施例6
1）取0.025mL，10mM的氯金酸加入1mL，0.1M的CTAB，再加入1mL，10mM的硼氢化钠，室温下反应30min；
2）取7.0gCTAB 和1.234g 油酸钠加入250mL温水（50℃）反应至30℃ 时停止。加入18mL，4mM硝酸银溶液不搅拌反应15min。加入1mM，250mL的氯金酸溶液，搅拌，反应90min，最后加入2.1mL，37%wt的盐酸溶液反应15min；
3）取0.8mL的金种加入到500mL生长液中，再加入1.25mL，64mM的抗坏血酸，30℃，不搅拌反应48h；
4）取30mL 纳米金棒，用水离心洗涤两遍（14000rpm，15min）。取30uL，0.2mM的4-ATP乙醇溶液加入到30mL的纳米金棒中搅拌反应30min。用CTAC离心洗涤两遍（8000rpm，10min），重分散在30mL，20mM的CTAC中；
5）取前面配置好的溶液3mL，加入9mL，20mM的CTAC和75uL，100mM的硝酸银溶液，再加入300uL，100mM抗坏血酸，不搅拌，70℃反应3h，离心洗涤一遍（8000rpm，10min），重分散在3mL水中备用；
6）取合成的棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子外修饰上不同浓度（10-3-10-8mol/L）的N，N-双（羧甲基）-L-赖氨酸，反应1h，以此来结合组胺的咪唑环；
7）将搅碎的鱼肉样品加入不同浓度（10-3-10-8mol/L）的组胺至不同含量（0.20-20ug），并旋转30 s以完全混合。然后向混合物中加入乙醇（4ml），然后再加入30 s涡流进行萃取。样品以10000转/分的速度离心2min，过滤以收集上清液。用己烷（8ml）经30s旋涡离心（10000rpm，2min）脱脂。丢弃己烷层，取底层进行分析；
8）取100uL羧基化的磁纳米粒子，用PBS缓冲液洗涤两次后，分别加入100uL 1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐活化1h，再迅速加入鱼肉样品中反应30min，富集鱼肉中的组胺；
9）将混合好后的磁纳米粒子/组胺/Au@Ag核壳结构纳米粒子样品滴在盖玻片上，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，得到对应浓度的SERS谱图。采集的拉曼图谱是以核壳结构纳米粒子中内标物质4-巯基苯胺的特征峰强度来间接对组胺浓度进行定性定量检测，即磁纳米粒子所富集的组胺越多，那么分离下来的带内标的核壳结构纳米粒子也就越多，从而内边物质的SERS信号也就越强。其内标特征峰为1077，1138，1189，1388，1428，1572cm-1，选取1572cm-1处的峰强度与组胺浓度做工作曲线，工作曲线为y=-572.93x+5036.43。
补充实验数据：
1、图2测试步骤:取20uL实施例3制备的棒状Au@Ag核壳结构纳米粒子滴在碳涂层铜网格上，并在室温下干燥。用透射电子显微镜（JEM-2100, JEOL, Akishima, Tokyo, Japan）对核壳纳米结构进行了形貌表征。
由图2我们可以知道采用种子生长法在二元表面活性剂（CTAB+NaOL）溶液环境中制备得到的纳米金棒表面形貌较为平滑，分散较好，金棒的形状和大小比较均一。纳米金棒颗粒测量得该纳米金棒长度为87.3 nm，直径为27.3 nm。大部分金棒颗粒长度在85-100 nm之间，直径在20-30 nm之间。可以看出银包金纳米棒的形貌，能明显地区分出金核和银壳，银壳层均匀地包裹在金棒的表面，其中间隙为2-4nm银壳层为8-10nm左右，厚度均一。
2、图3测试步骤：实施例3制备的纳米金棒、实施例3制备的金棒@巯基苯胺、实施例3制备的Au@Ag核壳结构各移取600μL置于石英皿中，在室温下用UV1902 （中国上海冷光科技有限公司）记录紫外-可见吸收光谱。扫描范围350-1000 nm，步长2nm。
由图3我们可以看出金棒的特征峰出现在514和794nm处，修饰上4-巯基苯胺后其紫外吸收峰偏移2nm。形成银壳后，紫外出现偏移至434，650nm，同时有新峰394nm出现，证明成功包裹银壳。
3、图4测试步骤：取实施例3离心后的棒状Au@Ag核壳结构胶体2uL，滴在铝片上，使用雷尼绍拉曼光谱仪（Renishaw, Sheffield, England）进行拉曼信号的检测，得到对应的SERS谱图。
由图4我们可以知道，纳米金棒在显微共焦激光拉曼仪下无明显的信号峰。修饰了4-巯基苯胺后，出现了4-巯基苯胺的信号峰，位于1077，1138，1189，1388，1428，1572cm-1处。相比较于单金属修饰4-巯基苯胺，银壳金核的SERS基底显示出的4-巯基苯胺信号峰更强。Au@Ag核壳结构在1077，1138，1189，1388，1428，1572cm-1处具有内部标准4-PATP的增强拉曼信号，也就是说，所有这些结果表明，银包金棒纳米结构内部形成了“热点”，对内标物质巯基苯胺产生拉曼增强，证明银壳包裹成功。
4、图5-6测试步骤：取实施例3混合好后的磁纳米粒子/组胺/Au@Ag核壳结构纳米粒子样品滴在盖玻片上，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，得到对应浓度的SERS谱图。再选取1138cm-1处的特征峰强度做对应浓度的工作曲线。
图5-6可以看出，随着组胺浓度的增加，Au@Ag核壳结构纳米粒子吸附的量就越多，内标的信号就越强，且1138cm-1特征峰处的强度与组胺浓度的负对数（-lg）有很好的线性，R2=0.9907，工作曲线为y=-4004.58x+33030.91。
5、图7-8测试步骤：取实施例3混合好鱼肉样品后的磁纳米粒子/组胺/Au@Ag核壳结构纳米粒子样品滴在盖玻片上，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，得到对应浓度的SERS谱图。再选取1138cm-1处的特征峰强度做对应浓度的工作曲线。
图7-8可以看出，随着鱼肉样品中组胺浓度的增加，Au@Ag核壳结构纳米粒子吸附的量就越多，内标的信号就越强，且1138cm-1特征峰处的强度与组胺浓度的负对数（-lg）有很好的线性，R2=0.9907，工作曲线为y=-4004.58x+33030.91。
6、图9测试步骤：取实施例5取混合好鱼肉样品后的磁纳米粒子/组胺/Au@Ag核壳结构纳米粒子样品滴在盖玻片上，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，得到对应浓度的SERS谱图。选取1388、1572cm-1处的特征峰强度做对应浓度的工作曲线。
图9可以看出，随着鱼肉样品中组胺浓度的增加，Au@Ag核壳结构纳米粒子吸附的量就越多，内标的信号就越强，取1388cm-1特征峰处的强度与组胺浓度的负对数（-lg）做工作曲线y=-2294.11x+19104.69，线性为R2=0.9879。
7、图10测试步骤：取实施例6取混合好鱼肉样品后的磁纳米粒子/组胺/Au@Ag核壳结构纳米粒子样品滴在盖玻片上，使用雷尼绍拉曼光谱仪进行拉曼信号的检测，得到对应浓度的SERS谱图。选取1572cm-1处的特征峰强度做对应浓度的工作曲线。
图10可以看出，随着鱼肉样品中组胺浓度的增加，Au@Ag核壳结构纳米粒子吸附的量就越多，内标的信号就越强，取1572cm-1特征峰处的强度与组胺浓度的负对数（-lg）做工作曲线y=-572.93x+5036.43，线性为R2=0.9410。对比图10和图9的工作曲线可知，采用1388cm-1特征峰做的工作曲线较1572cm-1特征峰做的工作曲线线性好。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
一种基于SERS技术检测鱼肉中组胺的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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