一种长波长检测肼的荧光探针及其合成方法与应用

IPC分类号 : C07D307/68,C09K11/06,G01N21/64

申请号

CN201611007152.X

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专利摘要

本发明公开了一种长波长检测肼的荧光探针及其合成方法和应用，属于化学分析检测技术领域。本发明探针由三氰呋喃大π体系与乙酰基缩合得到，具有如下结构：其中R1、R2选自具有1至18个碳原子的烷基链中的任一种；n1为具为1、2或3；n2为取自0–17的任一整数。此探针的荧光团为三氰呋喃大π体系骨架结构，对肼的响应基团为脂肪酸单元。该探针分子对肼有高的选择性和灵敏度，检测范围为1.0–50μmol·L‑1，检测限为0.13μmol·L‑1。该探针可用于水体、土壤以及细胞内肼的检测。

权利要求

1.一种检测肼的荧光分子探针，其特征在于，结构通式如下：

其中R₁、R₂选自具有1至18个碳原子的烷基链中的任一种；n₁为1、2或3；n₂为取自0–17的任一整数。

2.如权利要求1所述的检测肼的荧光分子探针，其特征在于，R₁、R₂选自具有1至6个碳原子的烷基链中的任一种；n₁为1或2；n₂为取自0–8的任一整数。

3.如权利要求1所述的检测肼的荧光分子探针，其特征在于，R₁、R₂选自具有1至4个碳原子的直连烷基链中的任一种；n₁为1；n₂为取自0–4的任一整数。

4.如权利要求3所述的检测肼的荧光分子探针，其特征在于，荧光分子探针为：

。

5.合成如权利要求1所述的检测肼的荧光分子探针的合成方法，其特征在于，通过如下方法实现：

（1）有机溶剂中，将三氰呋喃化合物3与末端对羟基苯基取代的共轭醛加热回流，缩合反应得到探针分子的前体化合物2；

（2）有机溶剂中，加入催化剂，将得到的化合物2与脂肪酸衍生物在室温下进行缩合反应，分离纯化后得到目标产物；

其中R₁、R₂选自具有1至18个碳原子的烷基链中的任一种；n₁为1、2或3；n₂取自0–17的任一整数；n₃为0、1或2；X为OH、Cl或Br。

步骤（1）所述有机溶剂选乙醇或甲苯；步骤（2）所述有机溶剂选二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮其中的一种；催化剂为三乙胺、4-二甲氨基吡啶，二环己基碳二亚胺，N,N-二异丙基碳二亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺其中一种。

6.合成如权利要求4所述的检测肼的荧光分子探针的方法，其特征在于，通过如下方法实现：

将化合物3与对羟基苯甲醛在乙醇溶液中回流，得到化合物2；将化合物2与乙酰氯加入含有三乙胺的无水二氯甲烷中，室温下反应过夜，减压蒸馏除去溶剂后分离纯化得到探针分子化合物。

7.如权利要求1-4其中之一所述的检测肼的荧光分子探针的应用，其特征在于，利用该分子探针对水体、土壤或生物体系中肼进行定性或定量测定。

8.如权利要求7所述的检测肼的荧光分子探针的应用，其特征在于，采用比色法或荧光检测时，将所述分子探针溶解于含水与二甲基亚砜的混合溶液缓冲体系中，对水体、土壤中肼进行定量检测。

9.如权利要求7所述的检测肼的荧光分子探针的应用，其特征在于，将探针与细胞培养，定性检测细胞中的肼。

说明书

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种长波长trun-on型检测肼的荧光探针及其合方法和在检测肼方面的应用。

背景技术

肼(N₂H₄)是一种具有强还原性与双功能基团的高活性小分子化合物。作为化学燃料，反应起始物在航天与燃料电池及抗氧化剂、高分子化合物、杀虫剂的合成等领域得到了广泛的应用。但是肼也具有高毒性及至畸变与致癌性，能通过呼吸系统及皮肤被人体摄入，产生头痛、恶心等症状，以及导致肝肾等器官的损伤。美国国家环境保护局规定了肼的安全限量值为10 ppb (0.3μmol·L^-1)。由于肼的大量工业使用排放及毒害作用，因此，开发高灵敏、高选择检测肼的方法对环境检测与保护是非常必要的。

目前检测肼的方法主要采用滴定测量、衍生化色谱法(Vessman J. J. Chromatogr. A 1990, 511, 303; Anal. 2009, 49, 529.; Oh J-A. Chromatogr. A 2015, 1395, 73.)及基于修饰电极的电化学方法(Joseph M.B. Anal. Chem. 2015, 87, 10064.; Casella I. G. Electroanalysis 2012, 24, 752; Wang J. Sens. Actuators, B 2017, 239, 898.)等。但这些方法一般都耗时较长、涉及复杂繁琐的样品处理过程或需要昂贵的精密仪器等。而利用分子探针荧光法检测肼具有样品处理简洁、成本低廉及操作简便快速等优点，近年来得到了发展与利用。但目前开发的用于检测肼的荧光探针分子其激发及发射波长大都在中短波段区域，这样不利于复杂样品背景干扰的消除，由于波段的光生物穿透能力弱且存在生物损伤性，因此，不利于生物样品的检测。而长波长的荧光探针，特别是激发与发射波长均在长波长处的荧光探针能很好的克服上述问题。

发明内容

对于上述情况，本发明目的是提供一种新的易于制备、性能稳定的长波长荧光分子探针，并提供该探针的合成方法，还在此基础开发出对肼进行高选择性和高灵敏度的检测方法。

为实现本发明目的，本发明利用肼具有较强的亲电性，能对缺电子分子或基团进行亲电反应，而脂肪酸在一定的溶液环境中羰基能选择性的与肼发生亲电加成与脱出反应，设计酯键为响应基团。另一方面，基于三氰呋喃为吸电子基团，酚羟基为给电子基团的大π共轭推拉体系，具有很好的长波长荧光发射性能，且通过在酚羟基位引入不同的吸电子基团能改变原荧光分子的推拉电子体系的特性从而改变其荧光性质，设计大π共轭推拉体系骨架作为发光团，合成用于检测肼的荧光分子探针。

所述检测肼的荧光分子探针，结构通式如下：

其中R₁、R₂选自具有1至18个碳原子的烷基链中的任一种；n₁为1、2或3；n₂取自0–17的任一整数。优选：R₁、R₂选自具有1至6个碳原子的烷基链中的任一种；n₁为1、2；n₂取自0–8的任一整数。优选：R₁、R₂选自具有1至4个碳原子的直链烷基链中的任一种；n₁为1；n₂取自0–4的任一整数。

R₁、R₂可以相同或不同。

进一步优选为：

其反应流程如下：

其合成方法具体如下：

合成分两步：

第一步：有机溶剂中，将三氰呋喃化合物3与末端对羟基苯基取代的共轭醛加热回流，缩合反应得到探针分子的前体化合物2；

第二步：有机溶剂中，加入催化剂，将得到的化合物2与脂肪酸衍生物在室温下进行缩合反应，分离纯化后得到最终目标产物探针分子1。

三氰呋喃化合物3中R₁、R₂选自具有1至18个碳原子的烷基链中的任一种，优选为1-6个碳原子中的任一种。更优选1至4个碳原子的直链烷基链中的任一种。

对羟基苯基取代的共轭醛为：

其中：n₃为具为0、1或2；n₃优选为0或1。

脂肪酸衍生物为：

其中X为OH、Cl或Br；优选X为Cl或Br。n₂取自0–17的任一整数，优选n₂取自0–8的任一整数，更优选n₂取自0–4的任一整数。

第一步反应有机溶剂选自乙醇、甲苯。

第二步反应有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮。

所述催化剂选自三乙胺、4-二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺其中之一。

上述方法中第一步反应时间为4-12 h。

上述方法中第二步反应时间为12-24 h。

更进一步优选如下：

将化合物3(R₁、R₂均为一个碳原子数的烷基)与对羟基苯甲醛在乙醇溶液中回流，得到化合物2(R₁、R₂均为一个碳原子数的烷基，n₁为1)；将化合物2与乙酰氯加入含有三乙胺的无水二氯甲烷中，室温下反应过夜，减压蒸馏除去溶剂后分离纯化得到探针分子化合物。

反应流程如下：

利用该分子探针对肼进行定性和定量测定，用于水体、土壤或生物体系中肼的检测。

采用比色法或荧光法检测时，分子探针溶解于水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液中，对肼进行测试。当加入肼后，肼能亲核加成羰基，并进一步通过脱除反应，使荧光团的的酚羟基游离出来形成氧负离子的结构，与探针分子的大π共轭吸电子基团三氰呋喃反应，从而产生强烈的分子内电荷转移(ICT) 效应，使探针溶液的吸收光谱发生红移，并伴随产生强的荧光发射特性。

采用荧光法检测时，所述荧光分子探针对肼的检测浓度为1 – 50 μmol·L^-1，检测限为0.13 μmol·L^-1。

本发明荧光探针分子具有如下特点和优点：

该荧光探针分子具有良好的稳定性和光学性质，反应前最大吸收波长为~410nm，单独溶液呈黄色，在红光波段无发射；随着肼的加入，探针分子在紫外吸收峰红移至~580 nm，溶液呈紫色，在~620nm处有强的荧光发射性质。

本发明所述的探针分子原料易得，合成产率较高，达85%以上，光学性能稳定（探针母液能在室内稳定存放三个月以上，其光谱性质保持不变），高选择性，对Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、 HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-有很好的抗干扰没能力，对肼识别能力强，且响应速度较快，响应范围为1.0 – 50 μmol·L^-1。高灵敏度，检测限低（0.13 μM），因此，该类型探针可用于水体、土壤以及生物体系中肼的检测。

附图说明

图1为本发明合成的分子探针的核磁共振氢谱；

图2 为本发明分子探针与肼反应前后的紫外谱图A与荧光光谱图B，其中，A图中，1-反应前，2-反应后；B图中，1-反应前，2-反应后；

图3为本发明5 μmol·L^-1分子探针加入不同浓度肼后荧光发射光谱图，从a至n，肼浓度分别为0、1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol·L^-1，溶液体系为水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液（H₂O/DMSO=9/1, v/v, 10 mM HEPES, pH 7.4），横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图4为肼的浓度标准曲线图，即5 μmol·L^-1本发明分子探针，反应前后在620nm处荧光发射强度的和肼浓度的线性关系；横坐标为肼的浓度，纵坐标为荧光强度。

图5为本发明分子探针对肼选择性；即5 μM本发明分子探针，加入100 μmol·L^-1不同离子(Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、 HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-)后，在620 nm处荧光发射强度的变化；横坐标为测试的干扰离子，纵坐标为荧光强度。

图6为本发明分子探针检测Hela细胞内肼的成像图片。(A,B)分别是本发明分子荧光探针(20 μmol·L^-1)培养的HeLa的明场图片和荧光图片；(C,D)分别是本发明分子荧光探针(20 μmol·L^-1)和N₂H₄(100 μmol·L^-1)培养的Hela细胞的明场图片和荧光图片。标尺：50 μm。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例 1：荧光分子探针的合成

将化合物3(R₁、R₂均为一个碳原子数的烷基)(398 mg, 2.0 mmol)与对羟基苯甲醛(268 mg, (2.2 mmol)加入到乙醇(50 mL)中加热回流反应12h。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，柱层析住分离得到棕红色固体(化合物2)。

将化合物2(303 mg,1 mmol)，乙酰氯(157 mg, 2.0 mmol, 142 mL)加入三乙胺 (304 mg, 2.2 mmol, 416 mL)，溶剂二氯甲烷(20 mL)中室温反应8h。待反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，柱层析柱分离（洗脱剂为二氯甲烷/甲醇=10/1的混合溶液）得到产物黄色固体293mg (收率：85%)。产物结构式如下:

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.61 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.55 (s, 1H), 7.18 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 2.27 (s, 3H), 1.66 (d, J = 58.5 Hz, 6H). MS [ESI]: m/z, calcd for [M+H]⁺ 346.1192; found 346.1184.。

实施例 2：探针对肼的荧光检测

将上述制得分子探针溶解于水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液（H₂O/DMSO=9/1, v/v, 10 mM HEPES, pH 7.4)）中，配制成5 μmol·L^-1的探针溶液。在3 mL的比色皿中加入2mL配制的5 μmol·L^-1 的本发明探针溶液，然后分别加入不同浓度的肼均匀混合，测试其荧光光谱，结果如图3所示。以溶液在620nm处荧光发射强度对肼的浓度作图，肼浓度在1.0 – 50 μmol·L^-1范围内时，两者之间呈现良好的线性关系(图4)，能实现该浓度范围内肼的定量检测，而且溶液从黄色变为紫色，也适用于裸眼检测。并且此探针不受其它一些常见离子的影响，如：Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、 HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-。在上述干扰离子存在的条件下，探针对肼仍具有良好的选择性和灵敏度(图5)。