专利摘要

本发明属于医药学技术领域，公开了一种薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物及其制备方法及应用，经相应的化学反应制备了一系列季磷盐类衍生物，以及衍生物在抗肿瘤方面的应用。本发明经药理实验表明：所有合成的薯蓣皂苷元季磷盐衍生物对A549、H1975、HCT‑116、Aspc‑1细胞具有明显的抑制作用，抗肿瘤活性均优于薯蓣皂苷元，大部分衍生物对Ramos、A431细胞抗肿瘤活性优于薯蓣皂苷元，部分衍生物对HBE、LO‑2细胞呈低毒性。

权利要求

1.一种薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物，其特征在于，所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物的分子结构为：

所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物的制备方法包括：

将薯蓣皂苷元10.0g溶于二氯甲烷300mL，依次加入EDC·HCl18.4g，4-二甲氨基吡啶1.20g，5-溴戊酸17.5g，25℃反应3-5h；滤液减压浓缩；经乙醇40mL85℃重结晶得中间体2；

将中间体2 0.80g溶于乙腈20mL中，加入三苯基膦3.64g，80-85℃加热回流5-10h，将反应液减压浓缩；加入正己烷60mL，25℃搅拌30min，抽滤；

重结晶或柱层析得薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物化合物；

所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物的制备方法的反应式为：

2.一种利用权利要求1所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物制备的抗肿瘤药物。

3.一种利用权利要求1所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物制备的对A549肺癌细胞抑制的药物。

4.一种利用权利要求1所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物制备的对A431皮肤鳞癌细胞抑制的药物。

5.一种利用权利要求1所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物制备的对H1975肺腺癌细胞抑制的药物。

6.一种利用权利要求1所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物制备的对Aspc-1转移胰腺癌细胞抑制的药物。

7.一种利用权利要求1所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物制备的对Ramos B淋巴瘤细胞抑制的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及季鏻盐类薯蓣皂苷元衍生物领域，特别涉及一种季鏻盐类薯蓣皂苷元衍生物及其合成方法和应用。

背景技术

从天然产物中寻找有效的具有抗肿瘤作用的活性成分已成为当今研发和筛选抗肿瘤药物的趋势。薯蓣皂苷元是生产甾体激素类药物的重要基础原料，在自然界的资源丰富。甾体激素具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克的药理作用，是治疗风湿、心血管、淋巴白血病、细胞性脑炎、皮肤病、抗肿瘤和抢救危重病人的重要用药。

最近有大量研究表明,薯蓣皂苷元及其衍生物对多种肿瘤细胞具有抑制活性和诱导细胞凋亡的作用。近年来,薯蓣皂苷元的化学结构修饰主要集中于A环C3-位羟基和F环开环后C26-位的改造,部分改造后的衍生物表现出较好的抗肿瘤活性。但是,薯蓣皂苷元及其衍生物作为潜在的抗肿瘤活性物质,适用范围相对较窄,因此需要进行进一步的结构修饰和药理研究来提高其生物利用度及应用范围。因此，以薯蓣皂苷元为原料进行结构修饰获得药效更好的先导物或药物是寻找新药的重要途径之一。

综上所述，现有技术存在的问题是：薯蓣皂苷元作为合成甾体激素类药物的重要原料，其衍生物的水溶性差，在体内极易被氧化，导致其生物活性与临床疗效弱、急性毒性较大。

解决上述技术问题的难度和意义：本发明以改善薯蓣皂苷元的水溶性，增加其抗肿瘤活性为目的，设计并合成了新型的薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物。为了合成薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物，需要在甾体环上引入磷基。

本发明设计将薯蓣皂苷元C3-位羟基通过两步反应转化为磷基，以此为中间体分别与不同的磷发生取代反应，得到相对应的季磷盐类衍生物。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种季鏻盐类薯蓣皂苷元衍生物及其合成方法和应用。,薯蓣皂苷元作为一种天然药物提取的化合物,药理作用广泛,其作用机制具有多靶点、多环节、多效应的特点。然而,薯蓣皂苷元及其衍生物作为潜在的抗肿瘤活性物质，同时也具有水溶性差、生物利用度较低、细胞毒性大、适用范围相对较窄等缺点，因此需要更进一步地进行结构修饰和药理研究来提高其生物利用度及应用范围,对其进行深入研究,以便更好地开发利用薯蓣皂苷元。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种季鏻盐类薯蓣皂苷元衍生物的合成方法。首先以薯蓣皂苷元(1)为先导物，其C-3位羟基与5-溴戊酸发生缩合反应得到共同中间体2，再与三苯基磷反应，经重结晶或柱层析得到终产物季磷盐衍生物3。分子结构通式为：

其中R1、R2、R3为烃基或取代烃基；

X＝F、Cl、Br、I。

本发明的另一目的在于提供一种薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物的制备方法，其特征在于，所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物的制备方法包括：

将薯蓣皂苷元溶于二氯甲烷，依次加入EDC·HCl，4-二甲氨基吡啶,5-溴戊酸，25℃反应3h。

将反应液过滤，滤液减压浓缩；

经乙醇重结晶得中间体溶于二氯甲烷中，加入三苯基膦10eq， 80℃加热回流h，将反应液减压浓缩；加入正己烷，25℃搅拌30min, 抽滤；

重结晶或柱层析得薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物化合物。

所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物的制备方法的反应式为：

本发明的另一目的在于提供一种利用所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物制备的抗肿瘤药物。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物制备的对A549肺癌细胞抑制的药物。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物制备的对A431皮肤鳞癌细胞抑制的药物。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物制备的对H1975肺腺癌细胞抑制的药物。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物制备的对Aspc-1转移胰腺癌细胞抑制的药物。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物制备的对Ramos B淋巴瘤细胞抑制的药物。

化合物2的合成

将薯蓣皂苷元(10.0g,24.1mmol)溶于二氯甲烷(300mL)，依次加入 EDC·HCl(18.4g,96.3mmol)，4-二甲氨基吡啶(1.20g,9.82mmol),5-溴戊酸 (17.5g,96.7mmol)，25℃反应3h，TLC检测反应完全。反应液依次用2N盐酸(3×100mL)、饱和碳酸氢钠(3×100mL)、水(3×100mL)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后用乙醇重结晶得白色固体2(12.1g,87％)。m.p. 108-109℃.[α]18D–94.3(c 0.003,CHCl3).IR(KBr)νmax 3464,2959,1745,1459, 1388,1281,1200,1052,1010,989,903cm-1.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.37(d, J＝3.4Hz,1H,H-6),4.68-4.53(m,1H,H-3),4.40(q,J＝6.8Hz,1H,H-16), 3.52-3.29(m,4H,H-26and-CH2-Br),2.41-2.23(m,4H,H-4and-COCH2-)ppm.13C NMR(100MHz,CDCl3)δ172.66,139.75,122.53,109.40,80.92,74.04,66.96, 62.18,56.54,50.04,41.73,40.38,39.84,38.24,37.06,36.85,33.76,33.22,32.16, 32.12,31.96,31.51,30.42,28.93,27.90,23.71,20.94,19.47,17.28,16.42,14.67ppm. HR-ESI-MS m/z calcd for C32H49BrO4Na[M+Na]+601.2692,found 601.2690。

化合物3的合成。

将化合物2(0.80g,1.39mmol,1eq.)溶于乙腈(20mL)，加入三苯基磷(3.64 g,13.9mmol,10eq.)，80℃下搅拌至TLC检测反应完全。将反应液减压浓缩，加入正己烷(60mL)，25℃搅拌30min，抽滤，滤饼经硅胶柱色谱(二氯甲烷：甲醇(v/v)＝200:1)分离得白色固体3(1.04g,90％)。m.p.132-133℃.[α]18D– 59.0(c 0.003,CHCl3).IR(KBr)νmax3405,2956,1736,1447,1382,1182,1117,1051, 695cm-1.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90-7.72(m,9H,P+-Ph),7.68(dd,J＝7.4, 2.9Hz,6H,P+-Ph),5.28(d,J＝4.1Hz,1H,H-6),4.54-4.42(m,1H,H-3),4.38(q,J＝ 7.4Hz,1H,H-16),3.82(t,J＝14.1Hz,2H,P+-CH2-),3.50-3.39(m,1H,H-26α),3.34 (t,J＝10.9Hz,1H,H-26β),2.33(t,J＝6.5Hz,2H,-COCH2-),2.21-2.06(m,4H) ppm.13C NMR(100MHz,CDCl3)δ172.51,139.68,135.08,135.05,133.79,133.69, 130.60,130.48,122.34,118.70,117.84,109.31,80.81,73.87,66.86,62.08,56.45, 49.95,41.62,40.27,39.73,38.09,36.92,36.74,33.73,32.06,31.85,31.39,30.30, 28.81,27.70,26.93,25.67,25.49,22.89,22.40,21.96,21.90,20.83,19.37,17.17, 16.31,14.56ppm.HR-ESI-MS m/z calcd for C50H64O4P+[M–Br]+759.4537,found759.4524。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明改善了薯蓣皂苷元的水溶性，以抗肿瘤活性、降低毒副作用为目的，设计了薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物。

所有合成新型衍生物结构都经1H NMR，13C NMR，HRMS(ESI) 确证。同时考察了目标衍生物的水溶性，以及对A549(人肺癌细胞)、H1975(人肺腺癌细胞)、A431(人皮肤鳞癌细胞)、Aspc-1(人转移胰腺癌细胞)、Ramos(人B淋巴瘤细胞)的抗肿瘤活性和HBE(人支气管上皮样细胞)的细胞毒性。

附图说明

图1为本发明季鏻盐类薯蓣皂苷元衍生物合成图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

如图1所示，

本文设计以薯蓣皂苷元(1)为先导物，其C-3位羟基与5-溴戊酸发生缩合反应得到共同中间体2，再与三苯基磷反应，得到一系列季磷盐衍生物3，如图1 所示。

化合物2的合成

将薯蓣皂苷元(10.0g,24.1mmol)溶于二氯甲烷(300mL)，依次加入 EDC·HCl(18.4g,96.3mmol)，4-二甲氨基吡啶(1.20g,9.82mmol),5-溴戊酸 (17.5g,96.7mmol)，25℃反应3h，TLC检测反应完全。反应液依次用2N盐酸(3×100mL)、饱和碳酸氢钠(3×100mL)、水(3×100mL)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后用乙醇重结晶得白色固体2(12.1g,87％)。m.p. 108-109℃.[α]18D–94.3(c 0.003,CHCl3).IR(KBr)νmax 3464,2959,1745,1459, 1388,1281,1200,1052,1010,989,903cm-1.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.37(d, J＝3.4Hz,1H,H-6),4.68-4.53(m,1H,H-3),4.40(q,J＝6.8Hz,1H,H-16), 3.52-3.29(m,4H,H-26and-CH2-Br),2.41-2.23(m,4H,H-4and-COCH2-)ppm.13C NMR(100MHz,CDCl3)δ172.66,139.75,122.53,109.40,80.92,74.04,66.96, 62.18,56.54,50.04,41.73,40.38,39.84,38.24,37.06,36.85,33.76,33.22,32.16, 32.12,31.96,31.51,30.42,28.93,27.90,23.71,20.94,19.47,17.28,16.42,14.67ppm. HR-ESI-MS m/z calcd for C32H49BrO4Na[M+Na]+601.2692,found 601.2690。

化合物3的合成

将化合物2(0.80g,1.39mmol,1eq.)溶于乙腈(20mL)，加入三苯基磷(3.64 g,13.9mmol,10eq.)，80℃下搅拌至TLC检测反应完全。将反应液减压浓缩，加入正己烷(60mL)，25℃搅拌30min，抽滤，滤饼经硅胶柱色谱(二氯甲烷：甲醇(v/v)＝200:1)分离得白色固体3(1.04g,90％)。m.p.132-133℃.[α]18D– 59.0(c 0.003,CHCl3).IR(KBr)νmax3405,2956,1736,1447,1382,1182,1117,1051, 695cm-1.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90-7.72(m,9H,P+-Ph),7.68(dd,J＝7.4, 2.9Hz,6H,P+-Ph),5.28(d,J＝4.1Hz,1H,H-6),4.54-4.42(m,1H,H-3),4.38(q,J＝ 7.4Hz,1H,H-16),3.82(t,J＝14.1Hz,2H,P+-CH2-),3.50-3.39(m,1H,H-26α),3.34 (t,J＝10.9Hz,1H,H-26β),2.33(t,J＝6.5Hz,2H,-COCH2-),2.21-2.06(m,4H) ppm.13C NMR(100MHz,CDCl3)δ172.51,139.68,135.08,135.05,133.79,133.69, 130.60,130.48,122.34,118.70,117.84,109.31,80.81,73.87,66.86,62.08,56.45, 49.95,41.62,40.27,39.73,38.09,36.92,36.74,33.73,32.06,31.85,31.39,30.30, 28.81,27.70,26.93,25.67,25.49,22.89,22.40,21.96,21.90,20.83,19.37,17.17, 16.31,14.56ppm.HR-ESI-MS m/z calcd for C50H64O4P+[M–Br]+759.4537,found759.4524。

生物活性实验

实验采用MTT(噻唑蓝)法测定薯蓣皂苷衍生物的对人体肿瘤细胞的抗肿瘤活性及正常人体细胞的细胞毒性,MTT化学名为2-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-3,5- 二苯基-2H-四唑氢溴酸盐。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞内，死细胞则没有此功能。而二甲亚砜(DMSO)可以溶解被MTT还原出来的甲瓒，用酶联免疫检测仪在所需波长处测定其吸光值(OD值)可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，甲瓒形成量和细胞数成正比，所以采用MTT法检测细胞存活和生长状况来反应薯蓣皂苷元衍生物的抗肿瘤活性及细胞毒性。用所测得的OD值计算出细胞增殖抑制率百分数，根据IC50统计软件进行计算得到每个衍生物对应每种细胞的 IC50值。IC50值是指靶细胞凋亡50％时的抑制剂浓度，由此来衡量衍生物诱导靶细胞凋亡的能力。对于肿瘤细胞，IC50值越小，表示衍生物的抗肿瘤活性越强；对于人体正常细胞，IC50值越小，表示衍生物的细胞毒性越大。

收集A549、A431、Aspc-1、H1975、Ramos的对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，以每孔7×103个细胞，每孔体积100μL接种到96孔板，每孔设4个复孔，边缘孔用无菌PBS填充。细胞贴壁后，0％FBS RPMI-1640饥饿8h，对照组用10％FBS RPMI-1640培养。37℃，5％CO2培养箱中继续培养48h后，加入100μL MTT溶液(5mg·mL-1)，4h后终止培养，每孔加入100μL三联液，于摇床上低速振荡10min，使结晶充分溶解。在酶联免疫检测仪上测定各孔光度值(OD值)，选择570nm波长，以无细胞的即RPMl-1640培养液空白孔调零，测各孔的吸光度值。实验重复三次，记录结果：细胞生长抑制率＝(对照组吸光度值–实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100％，并通过GraphPad Prism软件可估算出衍生物的IC50值。测定结果如下表，薯蓣皂苷元季铵盐类衍生物3的 IC50值显示：对于肿瘤细胞A549、A431、H1975、Aspc-1及RAMOS衍生物3的抗肿瘤活性均优于先导物薯蓣皂苷元；对于A549、A431、H1975、Aspc-1衍生物3的抑制活性均优于对照组阿霉素。具体见表1

表1抗增殖活性测定

为了考察薯蓣皂苷元季磷盐类衍生物的水溶性，实验设计用紫外分光光度法来测定衍生物与先导物的相对水溶性，测定结果如下表所示。水溶性测定结果用浓度(mg/mL)表示，浓度值越大，表示水溶性越大。所合成的薯蓣皂苷元季磷盐衍生物3的水溶性优于先导物薯蓣皂苷元。具体见表2

表2水溶性测定

本发明经水溶性实验测定表明：合成的薯蓣皂苷元季磷盐衍生物的水溶性优于先导物薯蓣皂苷元。

所有合成的化合物结构都经1H NMR，13C NMR，HRMS(ESI) 确证。同时考察了目标衍生物的水溶性，以及对A549(人肺癌细胞)、 H1975(人肺腺癌细胞)、A431(人皮肤鳞癌细胞)、Aspc-1(人转移胰腺癌细胞)、Ramos(人B淋巴瘤细胞)的抗肿瘤活性的细胞毒性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

一种季鏻盐类薯蓣皂苷元衍生物及其合成方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。