专利摘要

本发明公开了一种白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱构建方法及其应用，指纹图谱构建过程包括以下步骤：步骤1，制备复合固相微萃取头；步骤2，对白花蛇舌草样品进行前处理，使用复合固相微萃取头萃取白花蛇舌草样品中的挥发性成分；步骤3，使用气相色谱‑质谱联用仪检测白花蛇舌草中的挥发性成分；步骤4，根据检测结果建立白花蛇舌草的挥发性成分GC/MS指纹图谱；将构建的指纹图谱用于白花蛇舌草种类鉴别，能够标准化控制白花蛇舌草的质量，提高白花蛇舌草的使用效率和安全性。

权利要求

1.白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，制备复合固相微萃取头，

将对电极-铂丝、参比电极-饱和甘汞、工作电极-不锈钢丝浸入5mL电解液中形成三电极池工作系统，在电压0～1.5V循环伏安范围内以速度0.05mV/s循环扫描工作电极50圈制成固相微萃取头；

所述电解液中HNO3的浓度为1mol/L、苯胺的浓度为0.1mol/L，所述固相微萃取头需在1-丁基-3甲基-咪唑氯的纯离子液体中浸泡、晾干，然后使用质量比为1：1的环氧树脂和聚酰胺树脂将固相微萃取头与进样器手柄粘结，将固相微萃取头置于气相色谱仪的进样口，250℃下老化30min；

步骤2，对白花蛇舌草样品进行前处理，使用复合固相微萃取头萃取白花蛇舌草样品中的挥发性成分；

称取白花蛇舌草干粉置于密闭的静态顶空进样瓶中，在120℃下搅拌的同时使用复合固相微萃取头萃取30min，待测；

步骤3，使用气相色谱-质谱联用仪，对白花蛇舌草样品中的挥发性成分进行检测；

气相色谱仪的进样口温度为250℃，检测过程中不分流，载气与白花蛇舌草的体积比为100：1，载气为纯度≥99.999%、压力13.5±0.5MPa的He，柱箱温度为50℃，进样柱的流量为1.0mL/min，进样柱的总流量为102.0mL/min，吹扫流量为1.0mL/min，气相毛细管色谱柱的型号为DB-1701，尺寸为30m×0.250mm×0.25μm；

所述气相色谱仪的控温方式为：初始温度50℃保持10min，然后以5℃/min速度升至120℃保持1min，最后以8℃/min速度升至230℃保持2min；

质谱仪与气相色谱仪的接口温度为250℃，离子源温度为220℃，检测器电压为0.88KV，溶剂延迟时间为0min，质谱仪质荷比m/z为35-1000；

步骤4，根据检测结果绘制白花蛇舌草挥发性成分的GC/MS指纹图谱。

2.如权利要求1所述的白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱构建方法在白花蛇舌草鉴别方面的应用。

说明书

技术领域

本发明属于成分检测技术领域，特别是涉及一种白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱构建方法及其应用。

背景技术

白花蛇舌草始载于《广西中药志》，茎干纤细，夏秋之间生长茂盛，多见于水田、田埂和湿润的旷地，主要分布于我国云南、广西、广东、福建等地，为双叶植物茜草科植物白花蛇舌草的带根全草，具有抗肿瘤、抗菌消炎等药理作用，气微味苦甘，全草可供药用且价格低廉。现代医学研究证明，白花蛇舌草能增强机体的免疫力，抑制细胞的生长，是清热解毒的良药，由于白花蛇舌草全草可供药用、价格低廉，也较为常见，所以被广泛用于医学界，白花蛇舌草是2015版药典中收录的花红颗粒、男康片、抗骨髓炎片、肾炎康片、炎宁糖浆等制剂和单味制剂中的配方成分之一，随着对白花蛇舌草研究的不断深入，白花蛇舌草已经成为中药材具有开发前景的品种。白花蛇舌草中含有多类化学成分，主要有蒽醌类、萜类、甾醇类、苷类、有机酸类、黄酮类和多糖类等，目前白花蛇舌草在临床医学应用广泛，用于抑制肿瘤生长，据有关报道，抑制肿瘤最有效的成分为蒽醌类化合物，而其挥发性成分主要是黄酮类、萜类和有机酸化合物，其中黄酮类化合物是抗炎抗菌的主要成分。

由于白花蛇舌草功效显著，其相关研究报道较多，目前相关报道主要集中于采用离子色谱法、液质联用法、原子分光光度等多种方法对白花蛇舌草中的化学成分的研究，液质联用法测定白花蛇舌草中熊果酸、齐墩果酸的含量以及快速有效的鉴定白花蛇舌草中黄酮类的化学成分，原子吸收分光光度法测定白花蛇舌草中的重金属元素，结合超临界萃取技术、水蒸气蒸馏法为基础采用GC/MS法对白花蛇舌草中的挥发性成分进行分析，结果显示其挥发性成分以脂肪酸及脂肪酸脂为主，利用高效液相色谱法检测出白花蛇舌草的成分主要为环烯醚苷萜类、黄酮类、甾醇类等，多种成分均具有抗肿瘤、加强吞噬细胞作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱构建方法及其应用，本发明通过对白花蛇舌草的挥发性成分进行检测，进而构建白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱，利用该指纹图谱对未知产地的白花蛇舌草进行鉴别，以用于控制白花蛇舌草的质量，方便对白花蛇舌草的质量监控和使用。

本发明所采用的技术方案是，白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱构建方法，包括以下步骤：

步骤1，制备复合固相微萃取头，

将对电极-铂丝、参比电极-饱和甘汞、工作电极-不锈钢丝浸入5mL电解液中形成三电极池工作系统，在电压0～1.5V循环伏安范围内以速度0.05mV/s循环扫描工作电极50圈制成复合微萃取头；

步骤2，对白花蛇舌草样品进行前处理，使用复合固相微萃取头萃取白花蛇舌草样品中的挥发性成分；

称取白花蛇舌草干粉置于密闭的静态顶空进样瓶中，在120℃下搅拌的同时使用复合固相微萃取头萃取30min，待测；

步骤3，使用气相色谱-质谱联用仪，对白花蛇舌草样品中的挥发性成分进行检测；

步骤4，根据检测结果绘制白花蛇舌草挥发性成分的GC/MS指纹图谱。

进一步的，所述步骤1电解液中HNO₃的浓度为1mol/L、苯胺的浓度为0.1mol/L。

进一步的，所述步骤1制备的固相微萃取头需在1-丁基-3甲基-咪唑氯的纯离子液体中浸泡、晾干，然后使用质量比为1：1的环氧树脂和聚酰胺树脂将SPME头与进样器手柄粘结，将固相微萃取头置于气相色谱仪的进样口，250℃下老化30min。

进一步的，所述步骤3中气相色谱仪的进样口温度为250℃，检测过程中不分流，载气与白花蛇舌草挥发性成分的体积比为100：1，载气为纯度≥99.999％、压力13.5±0.5MPa的He，柱箱温度为50℃，进样柱的流量为1.0mL/min，进样柱的总流量为102.0mL/min，吹扫流量为1.0mL/min，气相毛细管色谱柱的型号为DB-1701，尺寸为30m×0.250mm×0.25μm。

进一步的，所述步骤3中气相色谱仪的控温方式为：初始温度50℃保持10min，然后以5℃/min的速度升至120℃保持1min，最后以8℃/min的速度升至230℃保持2min。

进一步的，所述步骤3中质谱仪与气相色谱仪的接口温度为250℃，离子源温度为220℃，检测器电压为0.88KV，溶剂延迟时间为0min，质谱仪质荷比m/z为35-1000。

白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱构建方法在白花蛇舌草鉴别方面的应用。

本发明的有益效果是：本发明构建指纹图谱的过程简单、指纹图谱准确程度高，能用于对不同产地的白花蛇舌草进行鉴别和归类，便于控制白花蛇舌草的质量，提高白花蛇舌草的使用效率和安全性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的流程图。

图2是本发明实施例1的指纹图谱。

图3是本发明实施例2的指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱构建方法，其构建流程如图1所示，具体包括以下步骤：

步骤1，制备复合固相微萃取头SPME，

以铂丝为对电极、饱和甘汞为参比电极、不锈钢丝为工作电极，将三电极浸入5mL电解液中组装成三电极池工作系统，电解液中HNO₃的浓度为1mol/L、苯胺的浓度为0.1mol/L，在电压为0～1.5V循环伏安范围中，以0.05mV/s的速度扫描工作电极50圈，制成复合固相微萃取头即SPME头；将SPME头晾干后在1-丁基-3甲基-咪唑氯的纯离子液体中浸泡、晾干，使用质量比为1：1的环氧树脂和聚酰胺树脂将SPME头与进样器手柄粘结，然后将SPME头置于气相色谱仪的进样口，250℃下老化30min，备用；

对SPME头进行老化处理，是为了稳定工作电极上沉积的苯胺涂层，SPME头老化的温度和时间会影响SPME头对白花蛇舌草挥发性成分的吸附效率，在250℃下老化30min，使得SPME头对挥发性成分的吸附效果良好，且不会影响后期的解吸，便于对白花蛇舌草挥发性成分的检测；

步骤2，对固相微萃取样品进行前处理，

称取白花蛇舌草干粉置于密封的静态顶空进样瓶中，在120℃下搅拌的同时使用复合固相微萃取头萃取白花蛇舌草的挥发性成分30min，待测；

步骤3，将复合固相微萃取头置于气相色谱-质谱联用仪进样口，对白花蛇舌草样品中的挥发性成分进行实验检测；

将携带样品的复合固相微萃取头置于气相色谱-质谱联用仪体系中，气相色谱仪的进样口温度为250℃，检测过程中不分流，载气与待测样品的体积比为100：1，载气为纯度≥99.999％、压力13.5±0.5MPa的He，柱箱温度为50℃，进样柱的流量为1.0mL/min，总流量为102.0mL/min，吹扫流量为1.0mL/min，气相毛细管色谱柱的型号为DB-1701，尺寸为30m×0.250mm×0.25μm；

对待测样品进行进样分离时，气相色谱仪的控温方式为：初始温度50℃保持10min，然后以5℃/min的速度升至120℃保持1min，最后以8℃/min的速度升至230℃保持2min，气相色谱仪的总运行时间为48.75min；

质谱仪检测待测样品的挥发性成分时，质谱仪与气相色谱仪的接口处温度为250℃，离子源的温度为220℃，检测器的电压为0.88KV，溶剂的延迟时间为0min，质谱仪的质荷比m/z为35-1000；

步骤4，利用步骤3的检测结果构建白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱。

使用本发明的气相色谱-质谱仪检测条件对白花蛇舌草的挥发性成分进行检测时，能够准确分离白花蛇舌草中的各挥发性成分，对成分组成和含量检测准确，白花蛇舌草的非挥发性成分对检测结果影响很小，检测结果能够反映不同地区白花蛇舌草的差异，进而用于白花蛇舌草的产地、质量鉴别和分类，有利于对白花蛇舌草进行质量监督、管理，提高白花蛇舌草的使用效率和安全性。

实施例1

利用以下步骤对云南省22个地区白花蛇舌草的挥发性成分进行检测，构建不同地区白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱，并对实验结果进行分析处理：

步骤1，以铂丝为对电极、饱和甘汞为参比电极、不锈钢丝为工作电极，将三电极浸入5mL电解液中组装成三电极池工作系统，电解液中HNO₃的浓度为1mol/L、苯胺的浓度为0.1mol/L，在电压为0～1.5V循环伏安范围内，以0.05mV/s的速度扫描工作电极50圈，制成复合固相微萃取头SPME；

步骤2，称取白花蛇舌草干粉置于密封的静态顶空进样瓶中，在120℃下搅拌的同时使用复合固相微萃取头萃取白花蛇舌草的挥发性成分30min，待测；

步骤3，将复合固相微萃取头置于气相色谱-质谱仪中，对白花蛇舌草样品中的挥发性成分进行实验检测；

使用气相色谱-质谱联用仪检测白花蛇舌草样品中的挥发性成分，检测时气相色谱仪的进样口温度为250℃，检测过程中不分流，载气与白花蛇舌草样品的体积比为100：1，毛细管色谱柱型号为DB-1701(规格30m×0.250mm×0.25μm)，柱箱初始温度为50℃，进样口温度为250℃，柱流量为1.0mL/min，气相色谱仪控温时，初始温度50℃保持10min，以5℃/min的速度升至120℃保持1min，再以8℃/min的速度升至230℃保持2min，气相色谱仪的总运行时间为48.75min；

质谱仪检测待测样品的挥发性成分时，质谱仪与气相色谱仪的接口处温度为250℃，离子源的温度为220℃，检测器的电压为0.88KV，溶剂的延迟时间为0min，质谱仪的质荷比m/z为35-1000；

步骤4，根据气相色谱-质谱仪的检测构建不同白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱，GC/MS指纹图谱如图2所示。

云南省22个地区白花蛇舌草的产地信息如表1所示，构建的白花蛇舌草指纹图谱如图2所示，利用色谱指纹图谱相似度评价系统对云南省22个地区的白花蛇舌草挥发性成分指纹图谱进行相似度分析可知，不同产地的白花蛇舌草指纹图谱的色谱峰相似度均较小、挥发性成分存在较大的差异；云南省22个地区中白花蛇舌草指纹图谱相似度最大的是：西双版纳和普洱镇沅者东、西双版纳和临沧、文山马关和保山施甸、玉溪新平和保山施甸、临沧和普洱镇沅者东、玉溪新平和文山马关，说明临沧、保山施甸、西双版纳、玉溪新平、文山马关地区的白花蛇舌草挥发性成分与含量较为相近，说明本发明建立的GC/MS指纹图谱能够表示各地区白花蛇舌草挥发性成分的组成、含量信息，并用于不同地区白花蛇舌草的鉴别，可以根据不同地区白花蛇舌草的标准指纹图谱对本地区的白花蛇舌草进行识别，还能根据不同地区白花蛇舌草的标准指纹图谱对白花蛇舌草进行归类，便于对白花蛇舌草质量进行监控，有利于提高白花蛇舌草的使用效率和安全性。

实施例2

采用静态顶空进样法将白花蛇舌草样品的挥发性成分置于气相色谱-质谱仪中，静态顶空进样时进样体积为2.0μL，振荡箱温度为180℃、振荡速度为250rpm、振荡时间为40min，振荡开启5s、停止2s，进样针温度150℃，针杆速度200μL/s，补偿时间1s，进样速度500μL/s，气体吹针时间120s，气相运行时间22.00min，使用实施例1所述的气相色谱-质谱仪试验条件进行检测，根据检测结果建立白花蛇舌草挥发性成分的GC/MS指纹图谱，如图3所示。

表1云南省不同地区白花蛇舌草的产地信息

图2和图3中从下至上的线条依次为表1中序号1～22的各地区白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱，对实施例1和实施例2检测得到的白花蛇舌草挥发性成分检测结果进行分析，分析结果如下：

1、根据检测结果中白花蛇舌草挥发性成分的组成比较可知，采用静态顶空进样方式检测到白花蛇舌草的挥发性成分最多有110种化合物，采用固相微萃取方式测得白花蛇舌草挥发性成分共有37种化合物，其中有20种为特征化合物。

2、将实施例1构建的22个指纹图谱进行相似度对比可知，云南省不同地区之间的白花蛇舌草挥发性成分的组成和含量均有较大差异，可以根据白花蛇舌草挥发性成分的指纹图谱来区分白花蛇舌草的产地，对其进行分类和批量处理，实施例2构建的各指纹图谱之间相似度对比结果也证明不同地区的白花蛇舌草挥发性成分组成和含量均有较大差异。

3、对实施例1构建的各指纹图谱进行聚类分析，可以将云南省22个地区的白花蛇舌草分为4类，其中普洱景谷、德宏瑞丽、文山小街地区各为1类，其他地区为1类；对实施例2构建的各指纹图谱进行聚类分析，可以将云南省22个地区的白花蛇舌草分为5类，其中德宏户撒乡、德宏瑞丽勐秀乡、德宏梁河县、普洱景谷各为1类，其他地区为1类。

4、对实施例1不同地区白花蛇舌草的挥发性成分组成进行主成分分析，共提取出9个主成分，主成分之间的累计方差贡献率为77.515％，不能代表白花蛇舌草不同产地22个样品所有信息，进一步说明采用固相微萃取对样品进行测定，样品间存在差异；对实施例2不同地区白花蛇舌草的指纹图谱进行主成分分析，共提取出5个主成分，主成分之间的累计方差贡献率为81.62％，能较好的代表白花蛇舌草不同产地22个样品全部信息，可以用主成分分析来反映样品的全部信息。

根据实施例的结果分析可知，对不同地区的白花蛇舌草挥发性成分进行检测，构建的指纹图谱存在较大差异，可以据此对白花蛇舌草进行成分分析和聚类分析，根据各个地区白花蛇舌草的标准GC/MS指纹图谱能够对白花蛇舌草的产地和质量进行鉴别，以便对白花蛇舌草质量进行监控和管理，提高了白花蛇舌草的使用效率和安全性。

本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

白花蛇舌草的GC/MS指纹图谱构建方法及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。