专利摘要
本发明公开了一种穿心莲类制剂中穿心莲内酯含量的检测方法，包括以下步骤：(1)取穿心莲内酯对照品，溶剂溶解，作为对照品溶液；(2)取供试品，溶剂溶解，作为供试品溶液；(3)分别对供试品溶液和对照品溶液进行差分脉冲伏安法电化学检测；所述电化学检测中：支持电解质为磷酸盐缓冲溶液；工作电极为纳米氧化铜/Nafion修饰金电极；参比电极为饱和甘汞电极；辅助电极为铂丝电极为辅助电极；(4)绘制标准曲线，计算穿心莲类制剂中的穿心莲内酯含量。本发明方法简单、快速、经济，可用于穿心莲内酯的现场快速检测。
权利要求
1.一种穿心莲类制剂中穿心莲内酯含量的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取穿心莲内酯对照品，溶剂溶解，作为对照品溶液；
(2)取供试品，溶剂溶解，作为供试品溶液；
其中，步骤(1)和步骤(2)中，所述溶剂为乙腈；
(3)分别对供试品溶液和对照品溶液进行差分脉冲伏安法电化学检测；
所述电化学检测中：
支持电解质为磷酸盐缓冲溶液；所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1M；
工作电极为纳米氧化铜/Nafion修饰金电极；
参比电极为饱和甘汞电极；
辅助电极为铂丝电极；
所述差分脉冲伏安法的参数如下：增量0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.04s，脉冲周期0.2s，静置时间2s；
所述纳米氧化铜/Nafion修饰金电极是通过下述方法制备得到的：
取氧化铜纳米粉末溶解于Nafion和乙醇中，超声分散，得到悬浮液，取修饰剂滴涂于预处理好的金电极表面，干燥即得纳米氧化铜/Nafion修饰金电极；
所述氧化铜纳米粉末与Nafion的质量体积比为1mg：20μL，与乙醇的质量体积比1mg：1mL；
(4)根据检测 结果，绘制穿心莲内酯的工作曲线，计算穿心莲类制剂中的穿心莲内酯含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述0.1M磷酸盐缓冲溶液的pH＝4.5。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述氧化铜纳米粉末的宽度为6-8nm，长度为40-60nm。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述氧化铜纳米粉末是通过下述方法制备得到的：
将Cu(CH3COO)2、冰乙酸溶解在无水乙醇中，加热到78℃，加入NaOH，反应1h，制得的CuO纳米颗粒悬液，分离洗涤即得；
其中，Cu(CH3COO)2与冰乙酸的摩尔比为1:2，与无水乙醇的摩尔体积比为1mmol：50mL，与NaOH的摩尔比为1:4。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于：所述制剂是胶囊剂。
说明书
技术领域
本发明涉及药品的检测，具体涉及穿心莲类制剂中穿心莲内酯含量的检测方法。
背景技术
穿心莲内酯是爵床科植物穿心莲Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees的主要有效成分，结构如下所示:
现代药理研究表明，穿心莲内酯及其衍生物具有抗病原微生物，解热，抗炎，抗生育，抗心血管疾病、免疫刺激，利胆保肝，抗肿瘤等作用[1]，对细菌性与病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊疗效[2]，被誉为天然抗生素药物。临床上用于脑膜炎、菌痢、肺炎、钩端螺旋体病、增强肾上腺皮质功能、上呼吸道感染等[3]。
目前，中国药典公布的检测穿心莲内酯的方法为高效液相色谱法[4]，亦有文献报道穿心莲内酯的其他检测方法。例如邹洪等用单示波极谱法[5]在0.2mol/L NH4Cl+0.25mol/L NH3·H2O中检测穿心莲内酯；李琦等用胶束电动毛细管色谱法[6]分离测定了穿心莲内酯；还有高效液相色谱法[7-11]和薄层扫描法[12]等检测方法。然而，上述方法或实验条件苛刻，或操作步骤较繁琐，或所需仪器较昂贵且耗时，不适合于大规模推广应用，也不适合于现成的快速检测。
因此，目前需要建立一种简单、灵敏、快速检测穿心莲内酯的分析方法。
[1]李曙光，叶再元.穿心莲内酯的药理活性作用.中华中医药学刊，2008,26(5):984-986
[2]董广涛，焦润生，高丽萍，赵敏，王秀杰.穿心莲内酯对内毒素诱导大鼠急性肺损伤的保护作用及机制的实验研究.中国急救医学，2013,33(8):735-738
[3]刘优靖.穿心莲内酯对病毒性下呼吸道感染患儿临床及细胞因子影响的研究.大连医科大学，2014：
[4]国家药典委员会.中国药典:1部.北京:中国医药科技出版社，2015:268
[5]邹洪，袁倬斌.穿心莲内酯的电化学研究.分析试剂室，1997,16(4):1-4
[6]李琦，胡广林，徐晓琴，庄峙厦，王小如.胶束电动毛细管色谱法测定穿心莲中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯.分析化学，2003,31(4):451-454
[7]孟宪波.HPLC测定莲栀清火胶囊中栀子苷、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量.中国实验方剂学杂志,2013,19(14):155-157
[8]汪剑飞，吴静，胡杰，叶文才，范春林.双波长HPLC法同时测定穿心莲浸膏中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量.安徽医药，2014,18(7):1237-1240
[9]黄秀展，潘民儒，朱正英，李荣德.HPLC法测定复方穿心莲片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量.用药指导，2012,14(7):28-29
[10]韩光，许笑笑，刘蕾，许启泰.HPLC-ELSD测定穿心莲超分子提取物中三种穿心莲内酯的含量.中国现代应用药学杂志，2008,25(4):345-347
[11牛其云，李传河，秦增贵，王建.高效液相色谱法测定穿心莲片中穿心莲内酯的含量.中国药事，2005,19(9):550-551
[12]顾利红，朱品业.薄层扫描法测定穿心莲中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量.中草药，2000,31(4):260-262
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种穿心莲类制剂中穿心莲内酯含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)取穿心莲内酯对照品，溶剂溶解，作为对照品溶液；
(2)取供试品，溶剂溶解，作为供试品溶液；
(3)分别对供试品溶液和对照品溶液进行差分脉冲伏安法电化学检测；
所述电化学检测中：
支持电解质为磷酸盐缓冲溶液；
工作电极为纳米氧化铜/Nafion修饰金电极；
参比电极为饱和甘汞电极；
辅助电极为铂丝电极；
(4)绘制标准曲线，计算穿心莲类制剂中的穿心莲内酯含量。
进一步地，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1M。
进一步地，所述0.1M磷酸盐缓冲溶液的pH＝4.5。
进一步地，其特征在于：
所述差分脉冲伏安法的参数如下：增量0.004V，振幅0.05V，脉冲宽度0.04s，脉冲周期0.2s，静置时间2s。
进一步地，所述纳米氧化铜/Nafion修饰金电极是通过下述方法制备得到的：
取氧化铜纳米粉末溶解于Nafion和乙醇中，超声分散，得到悬浮液，取修饰剂滴涂于预处理好的金电极表面，干燥即得纳米氧化铜/Nafion修饰金电极；
所述氧化铜纳米粉末与Nafion的质量体积比为1mg：20μL，与乙醇的质量体积比1mg：1mL。
进一步地，所述氧化铜纳米粉末的宽度为6-8nm，长度为40-60nm。
进一步地，所述氧化铜纳米粉末是通过下述方法制备得到的：
将Cu(CH3COO)2、冰乙酸溶解在无水乙醇中，加热到78℃，加入NaOH，反应1h，制得的CuO纳米颗粒悬液，分离洗涤即得；
其中，Cu(CH3COO)2与冰乙酸的摩尔比为1:2，与无水乙醇的摩尔体积比为1mmol：50mL，与NaOH的摩尔比为1:4。
进一步地，步骤(1)和步骤(2)中，所述溶剂为乙腈。
进一步地，所述制剂是胶囊剂。
本发明还提供了一种纳米氧化铜/Nafion修饰金电极，它是前述方法制备得到的。
发明人在研究中发现，纳米氧化铜/Nafion修饰金电极对穿心莲内酯具有很好的富集作用，构建了基于纳米氧化铜/Nafion修饰电极的穿心莲内酯电化学传感器。同时，利用差分脉冲伏安法对穿心莲内酯进行测定，通过各个条件的筛选，并将所建立的方法用于中药穿心莲中穿心莲内酯含量的测定。本发明方法简单、快速、经济，可用于穿心莲内酯的现场快速检测。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为氧化铜纳米颗粒的透射电镜图。
图2为裸金电极与纳米氧化铜/Nafion修饰电极测定标准品对比图：(a)裸金电极，(b)纳米氧化铜/Nafion修饰金电极。
图3为不同pH 0.1M磷酸盐缓冲液对穿心莲内酯峰电流值的影响。
图4为在本发明最佳测定条件下，穿心莲内酯的DPV图谱。
具体实施方式
实施例1本发明的检测方法
1仪器与试剂
CHI660C型电化学工作站，上海辰华仪器有限公司；舒美KQ116超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；雷磁PHS-3C型精密酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；三电极体系：纳米氧化铜/Nafion修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极。
穿心莲内酯，中国药品生物制品检定所；Nafion溶液，SIGMA公司；无水乙醇，上海子钦有限公司；乙腈、甲醇，默克；不同pH值不同浓度的磷酸盐缓冲液；实验中所用水均为二次蒸馏水；穿心莲内酯软胶囊，珠海金鸿药业股份有限公司(批号：150809)。
2氧化铜纳米颗粒的制备
CuO的合成方法参考文献Kida T,Oka T,Nagano M.Journal of the AmericanCeramic Society,2007,90(1):107–110。
首先1mmol的Cu(CH3COO)2、2mmol的冰乙酸依次溶解在50mL的无水乙醇中，混匀并水浴加热到78℃。磁力搅拌下，4mmol的NaOH粉末添加到该混合溶液中，反应1h。制得的CuO纳米颗粒悬液4000rpm离心10min，取沉淀，依次用乙醇和水清洗数遍，60℃真空干燥24h。
氧化铜纳米颗粒透射电镜(TEM)表征结果如图1所示，所合成的纳米氧化铜是薄片状的纳米长条，宽度为6-8nm，长度为40-60nm。
3纳米氧化铜/Nafion修饰金电极的制备
金电极在修饰前，依次用1.0，0.3，0.05μm的的α-Al2O3粉末在专业抛光布上抛光成镜面，每次打磨后置蒸馏水中超声清洗。将处理好的电极置于含5mM K3Fe(CN)6铁氰化钾的0.5M KCl溶液中，采用三电极系统(金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极)，在扫描电压-1～+0.8V用循环伏安法(CV)进行扫描，根据氧化还原峰电位差判断电极抛光程度，若符合要求则进行活化。活化用0.5mol/L的硫酸溶液，在扫面电压0～+1.7V用循环伏安法(CV)进行扫描，直到峰电流不再增加。
取1mg氧化铜纳米粉末溶解于20μL Nafion和1mL乙醇中，超声分散2h后，得到稳定且分散良好的黑色悬浮液。用微量进样器取12μL修饰剂滴涂于预处理好的金电极表面，室温下自然晾干即制得纳米氧化铜/Nafion修饰金电极。
4穿心莲内酯软胶囊样品处理
取穿心莲内酯软胶囊2粒(规格50mg/粒),精密称定,小心剪开,用乙腈洗内容物,胶皮凉干,精密称定,计算内容物重量；乙腈洗出的内容物转移至25ml容量瓶中,加乙腈至刻度,摇匀,取上清液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取滤液作为供试品溶液，样品检测时用支持电解质稀释到一定浓度。
5、差分脉冲伏安法工艺参数的筛选实验
(1)工作电极的筛选
分别以裸金电极和纳米氧化铜/Nafion修饰金电极为工作电极，在穿心莲内酯浓度为20μg/mL的0.1M PBS缓冲(pH＝4.5)溶液中，并在-0.5～+0.5V电位区间内进行循环伏安扫描。图2中a和b分别是穿心莲内酯在裸金电极和纳米氧化铜/Nafion修饰金电极上的循环伏安图。从图2中可以看出，穿心莲内酯在纳米氧化铜/Nafion修饰金电极上的电化学信号远远高于裸金电极，表明纳米氧化铜/Nafion修饰电极对穿心莲内酯具有催化活性。
(2)支持电解质的选择
实验考察了穿心莲内酯在不同pH的B-R缓冲，磷酸盐缓冲，硼砂-硼酸缓冲，Tris-HCl缓冲等缓冲溶液中的差分脉冲伏安(DPV)行为，结果表明在相同的测定条件下，穿心莲内酯在酸性缓冲中没有电化学氧化还原峰，在碱性缓冲中出现氧化还原峰，磷酸盐缓冲作为支持电解质相较于B-R缓冲，硼砂-硼酸缓冲，Tris-HCl缓冲等缓冲体系所得到的峰电流值大且峰型理想，所以选择磷酸盐缓冲液为支持电解质。
(3)磷酸盐缓冲浓度与pH的筛选
实验考察了穿心莲内酯在pH＝5.5的不同浓度的磷酸盐缓冲溶液中的DPV行为,测定结果如下表1所示，从表中可以看出，浓度为100mM时还原峰峰电流值最大，故选择100mM为磷酸盐缓冲液的配制浓度。
表1不同浓度磷酸盐缓冲对穿心莲内酯峰电流值的影响
实验考察了穿心莲内酯在100mM的不同pH的磷酸盐缓冲溶液中的DPV行为，实验结果如图3所示，穿心莲内酯的还原峰电流值随pH值不同而有所变化，当pH为4.5时，峰电流值最大，偏离4.5，峰电流值均减小，因而选择pH＝4.5为最佳酸度。
(4)DPV参数的筛选
DPV的仪器参数影响测试的灵敏度和分辨率，实验考察了不同DPV仪器参数对穿心莲内酯测定的影响。实验结果表明，峰电流随着脉冲振幅和脉冲增量的增大而增大，但随脉冲宽度和脉冲周期的增大而减小，在峰电流增大的同时，峰形展宽，峰对称性变差；综合考虑峰电流的大小，峰形和分析速度，选择的最佳仪器参数见下表2。
表2穿心莲内酯测定最佳DPV参数
在上述最佳测定条件下，穿心莲内酯的DPV图谱如图4所示。
6、本发明检测方法的方法学验证
(1)电极重现性
平行修饰6根金电极，测定同一样品溶液，测得相对标准偏差RSD为0.36％，说明修饰层在电极表面能形成一层比较稳定均一的薄膜，且电极重现性良好。
(2)工作曲线与检测限
在上述选定的最佳实验条件下进行穿心莲内酯工作曲线的测定，当穿心莲内酯浓度在1μg/mL～20μg/mL范围内时，还原峰峰电流值与其浓度成良好的线性关系，线性方程为Ip(μA)＝1.7436+0.1405c(μg/mL)，相关系数为0.9960，检测限为0.88μg/mL。
(3)仪器精密度与方法重现性
对浓度为20μg/mL的标准品溶液重复测定6次，所测得的平均电流值为8.538μA(n＝6)，RSD为1.19％。取同一批号样品分别制备6份供试品溶液，对6次结果进行分析，求得平均电流值为8.818μA(n＝6),RSD为1.09％。
(4)加样回收率
为了能够更好的研究纳米氧化铜/Nafion修饰金电极对穿心莲内酯实际样品的分析，对穿心莲内酯实际样品进行了回收率的测定，测得回收率平均值为100.6％，RSD为4.75％测试结果如下表3所示。
表3回收率测定结果
(5)实际样品含量测定
为了检验纳米氧化铜/Nafion修饰金电极是否可以用于穿心莲内酯软胶囊中穿心莲内酯的含量测定，在最佳条件下，实验平行测定了6份穿心莲内酯软胶囊(规格50mg/粒)样品中穿心莲内酯的含量，测得平均值为49.24mg/粒，相对标准偏差RSD＝4.54％。结果见表4。
表4穿心莲内酯软胶囊中穿心莲内酯的含量测定
综上所述，本发明方法简单、快速、经济，可用于穿心莲内酯的现场快速检测。
一种穿心莲类制剂中穿心莲内酯含量的检测方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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