专利摘要
本发明涉及一种以胭脂红为探针的紫外分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，属于大分子检测领域。本发明利用壳聚糖在弱酸性条件下，与胭脂红结合生成缔合物，用分光光度计在514nm处测定其吸光度，通过吸光度与壳聚糖含量在一定的浓度范围内呈线性关系，以此作为壳聚糖的定量基础。建立了测定壳聚糖的紫外分光光度法，本方法测定受壳聚糖的分子量的影响，其具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点，适合在实际应用中推广应用。
权利要求
1.一种以胭脂红为探针的紫外分光光度法测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：
1)绘制ΔA和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线：
向10mL比色管中加入3.0mL一定浓度梯度的低分子壳聚糖标准溶液，2.0mL的BR缓冲溶液，以及2.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的胭脂红溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，在室温中静置5min后于紫外分光光度计上，在体系有最大吸收峰的波长514nm处以水为参比测量吸光度；其中试剂空白记为A0，含壳聚糖的溶液记为A，并计算ΔA＝A0-A，建立ΔA与低分子壳聚糖浓度的标准曲线C1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔA与中分子壳聚糖浓度的标准曲线C2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔA与高分子壳聚糖浓度的标准曲线C3；
2)30μg/mL的样品工作液的制备：将甲壳素胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液；用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液7.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为30μg/mL的样品工作液；
3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)中检测方法绘制ΔA和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的ΔA和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；
4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在514nm处测定其吸光度值A，并计算ΔA＝A0-A，将ΔA代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验；
所述的BR缓冲溶液的pH为5.5；
所述步骤1中溶液的加入顺序为首先加入壳聚糖标准溶液，其次加入聚乙烯醇溶液，再次加入BR缓冲溶液，最后加入胭脂红溶液；
所述BR缓冲溶液由0.04mol/L混合酸与0.2mol/LNaOH溶液按不同比例配制而成；
所述混合酸由2.71mL正磷酸+2.36mL冰乙酸+2.47g硼酸组成。
2.根据权利要求1所述的以胭脂红为探针的紫外分光光度法测定壳聚糖含量的方法，其特征在于，步骤1)标准曲线C1，C2与C3中壳聚糖的浓度范围为1.5μg/mL-9μg/mL。
说明书
技术领域
本发明涉及一种以胭脂红为探针的紫外分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，属于大分子检测领域。
背景技术
壳聚糖为甲壳素经过强碱水解或酶解等化学法脱乙酞基(脱去55％以上)后形成的产物，是以β-(1，4)糖苷键串联的氨基葡萄糖线性大分子，化学名称是聚(1， 4)一2-氨基一2脱氧-β-D葡聚糖。壳聚糖是含有游离氨基阳离子生物多糖，壳聚糖及其衍生物是重要的生物活性物质，具有抗肿瘤，抗凝血，抗血栓，降血脂和增强免疫力等功能，可作为医药保健品，食品，化妆品等的添加剂及制备人造皮肤和手术缝合线等的重要原]。随着壳聚糖在生物医学广泛的应用，其与人们生活及健康也越来越息息相关，因此，壳聚糖的准确定量显得十分重要，建立简便高效的方法测定壳聚糖含量有着重要的意义，这将进一步推进壳聚糖在各个领域的应用。
目前常用测定CTS含量的方法有高效液相色谱法，紫外分光光度法，核磁共振法，电化学法荧光分析法，红外光谱法测等。如郑铁生，王亚娜，宗爱萍利用溴甲酚绿法测定壳聚糖的含量在0-10g/L范围内，该法线性关系较好： A＝0.0731c+0.771(R2＝0.9996)；谭学才，麦智彬，邹小勇，黄在银，蔡沛祥以茜素红(AR)为电活性探针间接测定无电活性壳聚糖(CTS)的新方法，采用标准加入法测定了不同样品中壳聚糖的含量，其回收率在97％-102％之间。高贵珍，焦庆才，丁一磊，陈雷研究发现在pH5.0的NaAc-HAc缓冲液中茜素红与壳聚糖反应生成复合物，在530nm处产生新的吸收峰，反应体系在422nm和530nm处吸光值变化与壳聚糖含量成线性关系，据此建立一种具有高选择性和高灵敏度的简便快速测定壳聚糖含量的分光光度法，在0-120mg/mL范围内呈现良好的线性关系 (r＝0.997)，平均回收率为99.18％同时，他们[12]发现在pH5.0的NaAc-HAc缓冲液中壳聚糖对茜素红S的荧光强度具有明显的猝灭作用，且猝灭程度与加入的壳聚糖浓度成线性关系，据此建立了一种测定壳聚糖含量的荧光猝灭法，检出限为 0.473mg/L，平均回收率为100.60％。利用紫外分光光度法直接测定壳聚糖含量简便、快速且设备简便，因此，紫外分光光度法可广泛用于基层单位测定壳聚糖，对紫外分光光度法测定壳聚糖的研究和条件优化有着很大的发展前景及重要意义。
发明内容
为了克服现有技术中对于成品中壳聚糖的含量难以定量，操作技术繁琐的技术不足，本发明提供一种以胭脂红为探针的紫外分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，本发明利用壳聚糖在弱酸性条件下，与胭脂红结合生成缔合物，用分光光度计在514nm处测定其吸光度，通过吸光度与壳聚糖含量在一定的浓度范围内呈线性关系，以此作为壳聚糖的定量基础。建立了测定壳聚糖的紫外分光光度法，本方法测定受壳聚糖的分子量的影响，其具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点，适合在实际应用中推广应用。
一种以胭脂红为探针的紫外分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：
1)绘制ΔA和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线：
向10mL比色管中加入3.0mL一定浓度梯度的低分子壳聚糖标准溶液， 2.0mL的BR缓冲溶液，以及2.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的胭脂红溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，在室温中静置5min后于紫外分光光度计上，在体系有最大吸收峰的波长514nm处以水为参比测量吸光度；其中试剂空白记为A0，含壳聚糖的溶液记为A，并计算ΔA＝A0-A，建立ΔA与低分子壳聚糖浓度的标准曲线C1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔA与中分子壳聚糖浓度的标准曲线C2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔA与高分子壳聚糖浓度的标准曲线C3；
在最佳的实验条件下，考察该体系对不同分子量的壳聚糖的测定结果。分别考察了低分子量、中分子量和高分子量的壳聚糖。经过统计学分析，不同分子量的壳聚糖结果存在显著差异性，该方法测定壳聚糖含量受不同分子量的影响；
2)30μg/mL的样品工作液的制备：将甲壳素胶囊去胶囊壳，称取0.04g于 100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液7.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为30μg/mL的样品工作液；
3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)中检测方法绘制ΔA和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的ΔA和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；
4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在514nm处测定其吸光度值A，并计算ΔA＝A0-A，将ΔA代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。
如上所述的以胭脂红为探针的褪色分光光度法测定壳聚糖含量的方法，所述的B-R缓冲溶液由0.04mol/L混合酸[(2.71mL正磷酸+2.36mL冰乙酸+2.47g硼酸)/L]与0.2mol/LNaOH溶液按不同比例配制而成，申请人通过实验发现，体系在pH＝5.5的B-R缓冲溶液中灵敏度最高，ΔA值最大，故最佳缓冲溶液选择为 pH＝5.5的B-R缓冲溶液。
如上所述的以胭脂红为探针的紫外分光光度法测定壳聚糖含量的方法，步骤 1中溶液的加入顺序为首先加入壳聚糖标准溶液，再次加入BR缓冲溶液，最后加入胭脂红溶液。
如上所述的以胭脂红为探针的紫外分光光度法测定壳聚糖含量的方法，所述壳聚糖的浓度范围为1.5μg/mL-9μg/mL。
样品前处理：将甲壳素胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用 0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经 6000r/min，离心机离心20min，取上清液7.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为30μg/mL的样品工作液。
用样品工作液按实验方法绘制样品曲线，与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的ΔA和壳聚糖浓度的标准曲线；
取样品工作液1mL，按实验方法进行测定，在514nm处测定其吸光度值A，并计算ΔA＝A0-A，将ΔA代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。
试验例：
1.CTS-胭脂红体系的紫外分光光谱图
图1为体系的共振散射光谱图。由图1可知，CTS和胭脂红在514nm处有最大吸收峰，实验组随着CTS的浓度的增大，体系的吸光度值降低，存在线性关系。
2.胭脂红加入量对于体系吸光度的影响
胭脂红作为染料探针与目标物质壳聚糖结合，其加入量直接影响着离子缔合物的形成。于10mL的比色管中，依次加入1.0mLpH＝3.5的B-R缓冲溶液，2.0mL 浓度为10μg/mL的壳聚糖溶液，改变浓度为1.0×10-4mol/L的胭脂红的加入量为 1.0，2.0，2.5，3.0mL，同时做空白管，平行两份，用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀，于室温测定其吸光度值。于UV-3010型紫外分光光度计上以 220nm-800nm波长范围扫描，得到紫外分光光度图谱。
结果见图2，胭脂红的加入量对该反应体系有显著影响，当加入量大于2.0mL 时散射值呈下降趋势，故1.0×10-4mol/L的胭脂红最佳加入量为2.0mL
3.不同缓冲溶液对于体系吸光度的影响
分别考察了pH＝3、4、5、6的B-R缓冲溶液，乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液4种缓冲溶液对体吸光度值的影响。按照实验方法，改变加入的缓冲溶液，得到各个缓冲溶液的吸光度值。
结果见图3，体系在B-R缓冲溶液中灵敏度最高，吸光度值最大，故最佳缓冲溶液选择为B-R缓冲溶液，且该体系在B-R缓冲溶液PH＝5时具有最高的灵敏度。
4.缓冲溶液的pH对于体系吸光度的影响
在上一条件对缓冲溶液对反应体系的影响的研究中，可见体系在B-R缓冲溶液中灵敏度最高，吸光度值最大，且该体系在B-R缓冲溶液PH＝5时具有最高的灵敏度。因此对PH＝5的B-R缓冲溶液进行细化，最终最佳酸度条件确定在pH5.5处。
5.B-R缓冲溶液的加入量对于体系吸光度的影响
缓冲溶液为实验体系提供合适的酸度结合环境，其加入量对离子缔合物的形成有着一定的影响，于10mL的比色管中，依次加入4.0mL浓度为10μg/mL的壳聚糖溶液，加入量为1.0，2.0，3.0，4.0mL的pH＝5.5的B-R缓冲溶液，2.0mL 浓度为1.0×10-4mol/L的胭脂红染料，同时做空白管，平行两份，用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀，于室温测定其吸光度值。于UV-3010型紫外分光光度计上以220nm-800nm波长范围扫描，测定其吸光度值，得到紫外分光光度图谱。
结果见图5，B-R缓冲溶液的加入量对该反应体系的影响较小，在加入量在 1.0～4.0mL范围内，散射值变化较小，在2.0mL加入量时吸光度值达到最大。故选B-R缓冲溶液加入量为2.0mL。
6.反应温度对于体系吸光度的影响
在实验条件下，考察了20℃、50℃、80℃、100℃四个不同温度对体系灵敏度的影响。于10mL的比色管中，依次加入5.0mL浓度为10μg/mL的壳聚糖溶液，加入2.0mL的pH＝5.5的B-R缓冲溶液，2.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的胭脂红染料，分别于20℃、50℃、80℃、100℃下水浴5min，同时做空白管，平行两份，用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀，于室温测定其吸光度值。于UV-3010 型紫外分光光度计上以220nm-800nm波长范围扫描，测定其吸光度值，得到紫外分光光度图谱。
结果表明(见图6)，温度对体系的吸光度值不存在着影响。吸光度值随着温度的升高无明显变化，故本体系可在常温下进行实验。
7.增敏剂种类对于体系吸光度的影响
分别考察了吐温20、吐温80、OP-10、十二烷基磺酸钠(SLS)、和十二烷基硫酸钠(SDS)5种增敏剂在分别在各自临界胶束浓度(CMC)时对体系吸光度值的影响，5种增敏剂分别对应的临界胶束浓度CMC为0.06g/L、0.014g/L、 1.9×10-4mol/L、0.014mol/L、0.0086mol/L。按照实验方法，于10mL的比色管中，依次加入4.0mL浓度为10μg/mL的壳聚糖溶液，加入2.0mL的pH＝5.5的B-R 缓冲溶液，2.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的胭脂红染料改变加入的增敏剂，得到各个增敏剂的吸光度值。
结果见图7，体系在不添加增敏剂时灵敏度最高，吸光度值最大，故增敏剂对该体系无增强灵敏度作用，不加增敏剂效果更优
8.试剂加入顺序对于体系吸光度的影响
在实验条件下，考察了胭脂红，B-R缓冲液，CTS的6种不同的加入顺序对体系灵敏度的影响。结果见表1，图8，最佳加入顺序为“1.CTS+缓冲液+胭脂红”，此时体系的吸光度值最大，灵敏度最高且重现性最好。
表1加入顺序的影响
9.稳定时间对于体系吸光度的影响
在较优条件下，考察体系的稳定时间，考察2h，30min内每隔10min测定一次，超过30min，每20min测定一次。结果表明，体系在5min内即可达到稳定， 30min内可保持稳定的吸光度值不变。故选择稳定时间为30min。
10.离子强度对于体系吸光度的影响
以NaCl(0.01～3mol/L)考察离子强度对体系的吸光值的影响。结果见图10，在0.005-0.02mol/L时离子强度对体系吸光度值影响不大，吸光度值趋于平稳；在 0.02mol/L后，体系的吸光值随离子强度的增加而呈升高趋势，可能是在高浓度时NaCl与该体系结合在一起使ΔA降低。因此，NaCl的浓度小于0.02mol/L的时候对实验没有影响。
11.共存物质对于体系吸光度的影响
考察了12种共存物质对该体系的干扰，体系中壳聚糖的浓度为6μg/mL。在相对误差在±5％范围内，各种共存物质的允许量见表2。常见的氨基酸，糖类，等的干扰小，允许量大；Mn2+和Ca2+允许量相对较小。
表2共存物质的影响
本发明与现有技术相比具有如下技术优势：
1)线性好、检出限低：在最佳实验条件下，按照实验方法测定不同浓度的壳聚糖对应的ΔA，绘制标准曲线，结果表明，壳聚糖在浓度1.5μg/mL-9μg/mL范围内与ΔA存在良好的线性关系，检出限0.6104μg/mL。
2)本方法测定受壳聚糖的分子量的影响，在实际样品测定中，需考虑采用相近分子量标准品做定量标准，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点。
附图说明
图1 CTS-胭脂红体系在不同CTS浓度下的紫外吸收光谱图。
图2胭脂红加入量对于体系吸光度的影响。
图3不同缓冲溶液对于体系吸光度的影响。
图4 B-R缓冲溶液的pH对于体系吸光度的影响。
图5 B-R缓冲溶液加入量对于吸光度值的影响。
图6反应温度对于体系吸光度的影响。
图7增敏剂种类对于体系吸光度的影响。
图8试剂加入顺序对于体系吸光度的影响。
图9稳定时间对于体系吸光度的影响。
图10离子强度对于体系吸光度的影响。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述发明并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
实施例
一种以胭脂红为探针的紫外分光光度法准确测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：
1)绘制ΔA和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线：
向10mL比色管中加入3.0mL一定浓度梯度的低分子壳聚糖标准溶液， 2.0mL pH＝5.5的BR缓冲溶液，以及2.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的胭脂红溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，在室温中静置5min后于紫外分光光度计上，在体系有最大吸收峰的波长514nm处以水为参比测量吸光度；其中试剂空白记为A0，含壳聚糖的溶液记为A，并计算ΔA＝A0-A，建立ΔA与低分子壳聚糖浓度的标准曲线C1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔA与中分子壳聚糖浓度的标准曲线C2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔA与高分子壳聚糖浓度的标准曲线C3；
表3不同分子量的壳聚糖结果
2)30μg/mL的样品工作液的制备：将甲壳素胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL 容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液7.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为30μg/mL的样品工作液；
3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)中检测方法绘制ΔA和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的ΔA和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；
用样品工作液按实验方法绘制样品曲线，与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，结果为样品的线性回归方程是ΔA＝0.014c+0.0011，相关系数0.9918，结果与中分子量的壳聚糖标准曲线接近，采用中分子量壳聚糖的标准曲线作为定量标准曲线。
4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)实验方法进行测定，在514nm处测定其吸光度值A，并计算ΔA＝A0-A，将ΔA代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。
取样品工作液1mL，按实验方法进行测定，在514nm处测定其吸光度值A，并计算ΔA＝A0-A，将ΔA代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。结果为：甲壳素胶囊中壳聚糖的含量为999.62mg/g，RSD为4.46％。加标回收率见表5。
表4样品含量分析结果
表5样品分析结果
在实验中，于10mL的比色管依次加入3.0mL浓度为30μg/mL的壳聚糖溶液，1.2.0mLpH＝5.5的BR缓冲溶液，以及2.0mL浓度为1.0×10-4mol/L的胭脂红溶液，使用蒸馏水定容后充分摇匀，在室温中静置5min后于紫外分光光度计上，在体系有最大吸收峰的波长514nm处以水为参比测量吸光度，于30min内测定完成。其中试剂空白记为A0，含壳聚糖溶液记为A，并计算ΔA＝A0-A。壳聚糖在浓度 1.5μg/mL-9μg/mL范围内与A0存在良好的线性关系，检出限为0.6104μg/mL。本方法测定受壳聚糖的分子量的影响，在实际样品测定中，需考虑采用相近分子量标准品做定量标准，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点。
线性范围与检出限
在最佳实验条件下，按照实验方法测定不同浓度的壳聚糖对应的ΔA，绘制标准曲线，结果表明，壳聚糖在浓度1.5μg/mL-9μg/mL范围内与ΔA存在良好的线性关系，线性回归方程为线性回归方程为ΔA＝0.0098c-0.0044，相关系数0.9975，方法线性范围宽，检出限0.6104μg/mL。
一种以胭脂红为探针的紫外分光光度法测定壳聚糖含量的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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