专利摘要

本发明公开了一株提高鱼酱发酵品质的中度嗜盐菌菌株海水芽孢杆菌，涉及食品微生物技术应用领域。该菌株已经于2018年9月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCCNO.16541，可称为BacillusaquimarisCGMCC16541。该菌株从传统发酵虾酱中利用Gibbons培养基筛选而来，该菌株有较强的的产蛋白酶能力，可应用于动物水产品发酵，能加快动物水产品的发酵和风味的改善。

权利要求

1.一株中度嗜盐菌株海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)，其特征在于，所述菌株的保藏编号为CGMCC NO.16541。

2.一种利用权利要求1所述海水芽孢杆菌发酵鱼肉酱的方法，按照下述步骤进行：

(1)原料鱼的预处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐5～20％(w/w)，在发酵前放置在4℃冰箱内5～24h；

(2)中度嗜盐菌菌株的制备：将中度嗜盐菌Bacillus aquimaris CGMCC NO. 16541接种在培养基上活化培养，重复操作三次；将培养的菌种菌液于4℃、10000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中；最后将菌液浓度调整到105～106CFU/mL，将菌液于4℃保存，并于24h内使用；

(3)发酵剂的添加：将中度嗜盐菌菌种Bacillus aquimaris CGMCC NO. 16541混入到预处理过的原料鱼中，菌种添加量按最终添加量为104～107CFU/g；使最终菌数达到添加要求即可；

(4)鱼肉酱发酵：把步骤(3)得到的混合物料在温度28～40℃下保温发酵5～30d；将发酵好鱼肉酱置于-20冰箱中备用；

(5)鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的5～30d内，每隔1～5d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌1～5min，搅拌结束后静置透气10～120s；

(6)鱼肉酱熟制：将步骤(4)得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸20～40min至鱼肉酱熟透；

(7)鱼肉酱灭菌：将步骤(6)熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌15～20min，即得鱼肉酱成品。

说明书

技术领域

本发明涉及食品微生物技术应用领域，尤其涉及一株提高鱼酱发酵品质的中度嗜盐菌菌株海水芽孢杆菌，可有效促进鱼酱发酵和提高鱼酱品质的新菌株。

背景技术

我国淡水养殖发展迅速，但加工业发展中相对滞后。因此开发适合国内消费市场需求的淡水鱼产品，对推动淡水鱼产业健康发展具有重要的现实意义。目前，发酵水产品中氨基酸含量丰富，营养价值高，深受消费者喜爱，但对于发酵产品又存在着发酵时间长、含盐量高和发酵不稳定等问题。中度嗜盐菌是一种在NaCl浓度为0.5mol/L到2.5mol/L之间生长最佳的极端微生物。与轻度嗜盐菌相比，中度嗜盐菌能够在高盐环境中生长，从而减少发酵过程中杂菌污染。与极端嗜盐古菌相比，中度嗜盐菌比嗜盐古菌的嗜盐范围宽，分布及来源更广泛、对营养物质要求也更低、更容易适应生存环境，在实际生产中更容易被应用。有些中度嗜盐菌又有较强的产胞外蛋白酶特性。本发明将利用一株中度嗜盐菌新菌株发酵鱼肉酱，得到发酵时间短，盐度较低和风味和营养价值较高的鱼肉酱产品。为水产品发酵品质的提升提供了理论基础和方法。

发明内容

本发明为了加快动物水产品的发酵及提升发酵产品的品质，从传统发酵虾酱中筛选出一株改善发酵鱼肉酱品质的新菌株。该菌株可有效的提高发酵产品的风味和营养价值，为发酵制品品质的提升提供了指导。

本发明所采取的技术方案如下：

本发明提供的中度嗜盐菌(Bacillus aquimaris JD)，为可以应用于发酵鱼酱品质提升的新菌株。该中度嗜盐菌菌株已经于2018年9月27日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC NO.16541，建议的分类命名：海水芽孢杆菌Bacillus aquimaris。

在本发明的一个方面中，提供上述Bacillus aquimaris CGMCC 16541的用途，用于鱼酱发酵风味和品质的提升，一种利用中度嗜盐菌菌株海水芽孢杆菌发酵鱼肉酱的方法，按照下述步骤进行：

(1)原料的处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐5～20％(w/w)，在发酵前放置在4℃冰箱内5～24h。

(2)中度嗜盐菌菌株的制备：将中度嗜盐菌Bacillus aquimaris CGMCC 16541接种在培养基上活化培养，重复操作三次。将培养的菌种菌液于4℃、10000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中。最后将菌液浓度调整到10⁵～10⁶CFU/mL，将菌液于4℃保存，并于24h内使用。

(3)发酵剂的添加：将中度嗜盐菌菌种Bacillus aquimaris CGMCC 16541按最终添加量(10⁴～10⁷CFU/g)混入到预处理过的原料鱼中，使最终菌数达到添加要求即可

(4)鱼肉酱发酵：把步骤(3)得到的混合物料在温度28～40℃下保温发酵5～30d；将发酵好鱼肉酱置于-20冰箱中备用。

(5)鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的5～30d内，每隔1～5d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌1～5min，搅拌结束后静置透气10～120s。

(6)鱼肉酱熟制：将步骤(4)得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸20～40min至鱼肉酱熟透。

(7)鱼肉酱灭菌：将步骤(6)熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌15～20min，即得鱼肉酱成品。

(8)产品发酵理化指标的评价：氨基酸态氮含量评价，方法参照GB5009.235-2016酸度计法。挥发性盐基氮含量评价，方法参照GB5009.228-2016微量扩散法。组胺含量的测定，方法参照GB5009.208-2016分光光度法。

(8)感官评定：由10人组成感官评定小组，评定前需对小组成员进行风味培训。评分包括0～9十个分数，对鱼肉酱的鱼味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行整体风味的综合评分。

本发明的有益效果

利用该中度嗜盐菌菌株发酵的鱼肉酱的发酵时间短，盐度较低，氨基酸态氮含量较高，滋味鲜美，营养价值丰富，挥发性盐基氮的含量低于欧盟标准，组胺的含量远低于国家标准，是一种品质和安全性高的的发酵鱼肉酱产品。

综上所述，本发明利用已经具备了发明专利的独特性、取得突出的实质性特点和显著进步的创新性和实用性，产生了有益的效果。

附图说明

图1为中度嗜盐菌Bacillus aquimaris JD菌落形态；

图2为中度嗜盐菌Bacillus aquimaris JD的16SrRNA序列构建的系统发育树。注：zzy8为本发明中度嗜盐菌Bacillus aquimaris JD。

具体实施方式

1.菌株的分离筛选：

以传统发酵的新鲜虾酱为原材料，虾酱来源于河北省唐山市丰南区黑沿子镇渔民自制虾酱，从虾酱中分离筛选中度嗜盐菌。中度嗜盐菌的分离和纯化使用添加1％脱脂乳粉的Gibbons培养基，将无菌水按一定倍数稀释后的虾酱涂布于固体Gibbons培养基上，30℃培养48h，挑取具有典型特征的菌落，继续在添加1％脱脂乳粉的固体Gibbons培养基上进行多次分离纯化，获得纯培养产蛋白酶的嗜盐菌菌株。将分离并纯化后的菌株接种到Gibbons斜面上，30℃培养48h，置于4℃冰箱短期保藏备用。

2.菌株的鉴定

2.1菌株的形态特征

菌落淡黄色、表面光滑、边缘整齐、不透明、菌落致密，革兰氏染色为阴性，菌体呈杆状。在液体Gibbons培养基中培养24h后，菌液浑浊。

2.2菌株的生理特征

该菌株在NaCl浓度为0～15％时均可进行生长；在pH为7～9时，生长较快；在温度范围为25℃～43℃都能进行良好生长；

2.3分子生物学鉴定

对分离筛选出的中度嗜盐菌经16SrRNA测序，基因序列经操作整理后，在Ezbiocloud中检索，确定为(Bacillus aquimaris)。根据检索到的同源菌株，应用DNAStar软件的Mege5.1程序，构建生物进化关系树如图2。

该中度嗜盐菌菌株已经于2018年9月27日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC NO.16541，建议的分类命名：海水芽孢杆菌Bacillus aquimaris。

实施例1：

一种利用中度嗜盐菌菌株海水芽孢杆菌发酵鱼肉酱的方法，按照下述步骤进行：

(1)原料的处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐5％(w/w)，在发酵前放置在4℃冰箱内24h。

(2)中度嗜盐菌菌株的制备：将中度嗜盐菌菌种Bacillus aquimaris CGMCC 16541接种在培养基上活化培养，重复操作三次。将培养的菌种菌液于4℃、10000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中。最后将菌液浓度调整到10⁵～10⁶CFU/mL，将菌液于4℃保存，并于24h内使用。

(3)发酵剂的添加：将中度嗜盐菌菌种Bacillus aquimaris CGMCC 16541按最终添加量10⁴CFU/g)混入到预处理过的原料鱼中，使最终菌数达到添加要求即可

(4)鱼肉酱发酵：把步骤(3)得到的混合物料在温度28℃下保温发酵30d；将发酵好鱼肉酱置于-20冰箱中备用。

(5)鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的30d内，每隔5d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌1min，搅拌结束后静置透气10s。

(6)鱼肉酱熟制：将步骤(4)得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸20min至鱼肉酱熟透。

(7)鱼肉酱灭菌：将步骤(6)熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌15min，即得鱼肉酱成品。

(8)产品发酵理化指标的评价：氨基酸态氮含量评价，方法参照GB5009.235-2016酸度计法。挥发性盐基氮含量评价，方法参照GB5009.228-2016微量扩散法。组胺含量的测定，方法参照GB5009.208-2016分光光度法。

(9)感官评定：由10人组成感官评定小组，评定前需对小组成员进行风味培训。评分包括0～9十个分数，对鱼肉酱的鱼味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行整体风味的综合评分。

(10)鱼肉酱的理化指标和感官评价

利用该株中度嗜盐菌菌株发酵鱼肉酱的氨基酸态的含量为0.643g/100g；挥发性盐基氮含量为25.32mg/100g，低于欧盟标准35mg/100g；组胺含量为3.77mg/100g，远低于食品安全国家标准鱼类中组胺的含量20mg/100g；感官评价的综合得分为6.27。未添加菌株鱼酱的感官评分为5.69。本鱼肉酱中原料中固有的土腥味大大减少，鲜味明显，与未添加菌株鱼酱相比，风味有显著提升。

实施例2：

一种利用中度嗜盐菌菌株海水芽孢杆菌发酵鱼肉酱的方法，按照下述步骤进行：

(1)原料的处理：碎鱼肉利用斩拌机斩断，加入腌制海盐20％(w/w)，在发酵前放置在4℃冰箱内24h。

(2)中度嗜盐菌菌株的制备：将中度嗜盐菌菌种Bacillus aquimaris CGMCC 16541接种在培养基上活化培养，重复操作三次。将培养的菌种菌液于4℃、10000r/min离心10min，然后用无菌生理盐水洗涤两次，再悬浮于无菌生理盐水中。最后将菌液浓度调整到10⁵～10⁶CFU/mL，将菌液于4℃保存，并于24h内使用。

(3)发酵剂的添加：将中度嗜盐菌菌种Bacillus aquimaris CGMCC 16541按最终添加量10⁷CFU/g)混入到预处理过的原料鱼中，使最终菌数达到添加要求即可

(4)鱼肉酱发酵：把步骤(3)得到的混合物料在温度40℃下保温发酵5d；将发酵好鱼肉酱置于-20冰箱中备用。

(5)鱼肉酱发酵过程中的搅拌与透气：在鱼酱发酵的5d内，每隔1d在无菌条件下对发酵鱼酱进行顺时针的搅拌5min，搅拌结束后静置透气120s。

(6)鱼肉酱熟制：将步骤(4)得到的鱼肉酱利用水蒸气在蒸屉中蒸40min至鱼肉酱熟透。

(7)鱼肉酱灭菌：将步骤(6)熟制的鱼肉酱灌装密封，在120℃下二次灭菌25min，即得鱼肉酱成品。

(8)产品发酵理化指标的评价：氨基酸态氮含量评价，方法参照GB5009.235-2016酸度计法。挥发性盐基氮含量评价，方法参照GB5009.228-2016微量扩散法。组胺含量的测定，方法参照GB5009.208-2016分光光度法。

(9)感官评定：由10人组成感官评定小组，评定前需对小组成员进行风味培训。评分包括0～9十个分数，对鱼肉酱的鱼味、腥味、发酵味、氨味、鲜味、咸味、甜味和苦涩味进行整体风味的综合评分。

(10)鱼肉酱的理化指标和感官评价

利用该株中度嗜盐菌菌株发酵鱼肉酱的氨基酸态的含量为0.307g/100g；挥发性盐基氮含量为7.57mg/100g，低于欧盟标准35mg/100g；组胺含量为2.01mg/100g，远低于食品安全国家标准鱼类中组胺的含量20mg/100g；感官评价的综合得分为5.88。未添加菌株鱼酱的感官评分为5.49。本鱼肉酱中原料中固有的土腥味大大减少，鲜味明显，与未添加菌株鱼酱相比，风味有显著提升。

一株提高鱼酱发酵品质的中度嗜盐菌菌株海水芽孢杆菌专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。