一种多重信号放大的免标记电化学传感器及对核酸的检测

IPC分类号 : G01N27/48,G01N27/30

申请号

CN201510009967.0

可选规格: 数量

库存1件

确认取消

￥30000; 库存1件

首页

立即咨询

看了又看

专利摘要

本发明公开了一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定，即S1-CP-AuNPs聚合物；在基底电极表面修饰CS-GR复合物，浸在连接探针2中，得S2/CS-GR/基底电极；将S2/CS-GR/基底电极浸在S1-CP-AuNPs聚合物中，通过S1和S2间碱基互补配对将S1-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/基底电极上，即传感器S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。本发明还提供了一种依据上述方法制备的电化学传感器。所述的传感器可用于核酸的检测，该传感器具有很高的灵敏性，而且免标记，对p53基因检测范围10-15～10-9mol/L，检测限0.3×10-15mol/L。

权利要求

1.一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定，形成连接探针1-捕获探针-金纳米粒子聚合物，即S1-CP-AuNPs聚合物，其中，连接探针1的核苷酸序列为5’-SH-C6-TTT TTC GTG AGC AGC GTC AG-3’，捕获探针的核苷酸序列为5'-SH-C6-AAA GGG TTG GGC GGG ATG GGT TGAGTC TTC C↓AG TGT GAT GAA ACC CAT C-3'；

(2)石墨烯分散在壳聚糖溶液中，形成壳聚糖-石墨烯聚合物，即CS-GR复合物；

(3)在基底电极表面修饰CS-GR复合物，得壳聚糖-石墨烯/基底电极，即CS-GR/基底电极；

(4)将壳聚糖-石墨烯/基底电极处理后，浸在连接探针2中，得连接探针2/壳聚糖-石墨烯/基底电极，即S2/CS-GR/基底电极，其中，连接探针2的核苷酸序列为5’-NH₂-C6-TTT TTT TCT GAC GCT GCT CAC G-3’；

(5)将S2/CS-GR/基底电极浸在S1-CP-AuNPs聚合物中，通过S1和S2间碱基互补配对将S1-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/基底电极上，制得连接探针1-捕获探针-金纳米粒子/连接探针2/壳聚糖-石墨烯/基底电极，即传感器S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。

2.根据权利要求1所述的一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，基底电极为玻碳电极。

3.根据权利要求1或2所述的一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定，连接探针1和捕获探针中分别加入三(2-氯乙基)磷酸酯TCEP，室温避光处理1小时；将上述两溶液混合加入到金纳米粒子中，室温避光搅拌；搅拌的过程中逐滴加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液Tris-HCl，再逐滴加入NaCl溶液，室温避光搅拌；将上述溶液离心，将沉淀重新分散在Tris-HCl 和NaCl的混合溶液中，即得连接探针-捕获探针-金纳米粒子聚合物，即S1-CP-AuNPs聚合物。

4.根据权利要求2所述的一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，玻碳电极用三氧化二铝粉打磨成镜面后清洗，晾干后，将CS-GR复合物滴涂在玻碳电极上，室温晾干，制得壳聚糖-石墨烯/玻碳电极，即CS-GR/GCE。

5.根据权利要求2所述的一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，壳聚糖-石墨烯/玻碳电极浸在戊二醛溶液中，然后清洗；将清洗后的壳聚糖-石墨烯/玻碳电极浸在连接探针S2中，制得连接探针/壳聚糖-石墨烯/玻碳电极，即S2/CS-GR/GCE。

6.根据权利要求2所述的一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述清洗，是在二次水中清洗3～5分钟，然后依次在乙醇和二次水中超声3～5分钟。

7.根据权利要求2所述的一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述清洗，是分别在NaOH溶液和10mmol/L pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中。

8.权利要求1制备的一种多重信号放大的免标记电化学传感器。

9.权利要求8所述的标记电化学传感器作为检测器在检测核酸中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)标准溶液配制：配制一组含有不同浓度p53基因的pH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液为标准液；

(2)建立工作曲线：将所述传感器分别浸入标准溶液中40℃孵育80分钟，孵育后用Tris-HCl缓冲液冲洗，再将传感器分别浸入NEBuffer 3、氯高血红素、亚甲基蓝溶液中，每次浸入后均用Tris-HCl缓冲液冲洗，在10ml Tris-HCl、KCl和H₂O₂的混合溶液中进行差分脉冲伏安法(DPV)扫描，记录响应电流I，所述I值与标准溶液中p53基因浓度c的对数logc成正比，绘制I-log c标准曲线，或采用线性回归法得到I-log c线性回归方程；

(3)p53基因含量测定：将待测样品配制为含有步骤(1)相同浓度p53基因的Tris-HCl缓冲溶液，按照与步骤(2)相同的方法对所述传感器进行孵育和进一步反应后进行差分脉冲伏安扫描，记录响应电流I；根据响应电流I和I-log c线性回归方程，得到p53基因含量。

10.根据权利要求9所述的标记电化学传感器作为检测器在检测核酸中的应用，其特征在于，步骤(1)中所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为100mmol/L，步骤(2)中所用Tris-HCl的浓度均为10mmol/L，所述步骤(2)中NEBuffer 3含有0.5unit/μL N.BstNB I。

说明书

技术领域

本发明涉及核酸的检测方法，特别是一种多重信号放大的免标记电化学传感器及对核酸的检测。

背景技术

现知人类的疾病都与基因有着直接或间接的关系，p53基因是人体重要的抑癌基因，使癌细胞自杀，防止癌变，还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。一旦p53基因发生突变，将会加快肿瘤的生长和癌症的发展。因此，对核酸的高灵敏、高选择性的快速检测方法存在着越来越迫切的需求，这对于基因研究、药物筛选以及临床诊断都有现实意义。

目前，用来检测核酸的方法主要有：DNA印迹、RNA印迹和PCR技术，这些方法操作中的一个共同点是必须把未杂交的探针和引物与杂交体分离后才能借助其他信号对靶核酸进行准确定量检测。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种多重信号放大的免标记电化学传感器及对核酸的检测，所述的电化学传感器具有很高的灵敏性，而且免标记。

本发明的另一目的还在于提供一种快速、高灵敏度的核酸检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，技术方案如下：

(1)连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定，形成连接探针1-捕获探针-金纳米粒子聚合物，即S1-CP-AuNPs聚合物，其中，连接探针1的核苷酸序列为5’-SH-C6-TTT TTC GTG AGC AGC GTC AG-3’，如序列表中SEQ ID NO.1所示，捕获探针的核苷酸序列为5'-SH-C6-AAA GGG TTG GGC GGG ATG GGT TGA GTC TTC C↓AG TGT GAT GAA ACC CAT C-3'，如序列表中SEQ ID NO.2所示；

(2)石墨烯分散在壳聚糖溶液中，形成壳聚糖-石墨烯聚合物，即CS-GR复合物；

(3)在基底电极表面修饰CS-GR复合物，得壳聚糖-石墨烯/基底电极，即CS-GR/基底电极；

(4)将壳聚糖-石墨烯/基底电极处理后，浸在连接探针2中，得连接探针2/壳聚糖-石墨烯/基底电极，即S2/CS-GR/基底电极，其中，连接探针2的核苷酸序列为5’-NH₂-C6-TTT TTTTCT GAC GCT GCT CAC G-3’，如序列表中SEQ ID NO.3所示；

所述步骤(2)中壳聚糖溶液的质量分数为0.1wt％～0.5wt％。

优选地，所述步骤(3)中，基底电极为玻碳电极。

所述步骤(1)中连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定，连接探针1和捕获探针中分别加入三(2-氯乙基)磷酸酯TCEP，室温避光处理1小时；将上述两溶液混合加入到金纳米粒子中，室温避光搅拌；搅拌的过程中逐滴加入三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液Tris-HCl，再逐滴加入NaCl溶液，室温避光搅拌；将上述溶液离心，将沉淀重新分散在Tris-HCl和NaCl的混合溶液中，即得连接探针-捕获探针-金纳米粒子聚合物，即S1-CP-AuNPs聚合物。

所述步骤(3)中，玻碳电极用三氧化二铝粉打磨成镜面后清洗，晾干后，将CS-GR复合物滴涂在玻碳电极上，室温晾干，制得壳聚糖-石墨烯/玻碳电极，即CS-GR/GCE。

所述步骤(4)中，壳聚糖-石墨烯/玻碳电极浸在戊二醛溶液中，然后清洗；将清洗后的壳聚糖-石墨烯/玻碳电极浸在连接探针S2中，制得连接探针/壳聚糖-石墨烯/玻碳电极，即S2/CS-GR/GCE；其中，戊二醛溶液的质量分数为1.5％～5％。

步骤(3)中所述清洗，是在二次水中清洗3～5分钟，然后依次在乙醇和二次水中超声3～5分钟。

步骤(4)中所述清洗，是分别在NaOH溶液和10mmol/L pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中。

本发明还提供了一种根据上述方案制备的免标记电化学传感器。

本发明的另一目的是提供上述电化学传感器在检测核酸含量的应用，包括以下步骤：

(1)标准溶液配制：配制一组含有不同浓度p53基因的pH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液为标准液；

(2)建立工作曲线：将所述传感器分别浸入标准溶液中40℃孵育80分钟，孵育后用Tris-HCl缓冲液冲洗，再将传感器分别浸入NEBuffer 3、氯高血红素、亚甲基蓝溶液中，每次浸入后均用Tris-HCl缓冲液冲洗，在10mL Tris-HCl、KCl和H₂O₂的混合溶液中进行差分脉冲伏安法(DPV)扫描，记录响应电流I(uA)，所述I值与标准溶液中p53基因浓度c(mol/L)的对数log c成正比，绘制I-log c标准曲线，或采用线性回归法得到I-log c线性回归方程；

步骤(1)中所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为100mmol/L，步骤(2)中所用Tris-HCl的浓度均为10mmol/L，所述步骤(2)中NEBuffer 3含有0.5unit/μL N.BstNB I。

本发明的有益效果为：

1.本发明建立了一种基于多重信号放大、免标记的电化学适体传感器用于超灵敏检测p53基因，其中多重信号放大策略包括：(1)壳聚糖-石墨烯复合物基底有利于电子在电极表面的转移；(2)具有高比表面积的金纳米粒子AuNPs可以固定更多的捕获探针CP；(3)在切刻内切酶N.BstNB I的作用下，p53基因能重复利用，从而在酶切后产生更多的富鸟嘌呤G结构，并在氯高血红素hemin和K⁺的存在下形成DNA酶DNAzyme；(4)DNAzyme催化H₂O₂还原，同时促进了亚甲基蓝MB的氧化还原；以上方案能够使信号增强，因此信号放大策略具备可行性；

2.与现有的电化学传感器相比，本发明的电化学传感器具有免标记的特点，信号的产生依靠DNAzyme的催化作用，免除了传统的标记过程；

3.本发明的电化学传感器具有高度的灵敏性和专一性，对核酸的检测简单高效，检测限可达0.3×10^-15mol/L，检测范围为10^-15～10^-9mol/L。

附图说明

图1为本发明的电化学传感器检测原理示意图；

图2为本发明的信号放大结果比较图，其中，(a)为电极S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE在与p53作用前，(b)为电极S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE与1nmol/L p53作用后，(c)为(b)与酶反应后，(d)为(c)与氯高血红素作用后；

图3为本发明的DPV曲线图，其中a-g为标准溶液的浓度分别为10^-15mol/L，10^-14mol/L，10^-13mol/L，10^-12mol/L，10^-11mol/L，10^-10mol/L和10^-9mol/L)；

图4为响应电流的变化ΔI与核酸浓度的标准曲线图；

图5为本发明实施例4的DPV曲线图；

图6为本发明实施例5的DPV峰电流强度柱状图，其中，TD为p53基因(5’-TCA TCA CAC TGG AAG ACT C-3’)(如序列表中SEQ ID NO.4所示)的检测液，sTD为碱基错配(5’-TCA TCA CAC TGG AAG AAT C-3’)的检测液，nTD为全部碱基错配(5’-GAC GTC AGA CTT CCT GCG A-3’)的检测液，CK为pH为7.4的100mmol/L Tris-HCl缓冲溶液。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，并非构成对本发明的限制。本发明的保护范围不以具体实施方式为限。

实施例1：电化学传感器的制备

一种多重信号放大的免标记电化学传感器，制备方法如下：

(1)连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定：

2μL 100μmol/L S1和8μL 100μmol/L CP中分别加入0.1μL 3mmol/L和0.4μL 3mmol/L三(2-氯乙基)磷酸酯(TCEP)，室温避光处理1小时；将上述两溶液混合加入到0.3mL搅拌速率为1r/s的AuNPs中，室温避光搅拌10小时；搅拌的过程中逐滴加入3μL 500μmol/L pH 7.4的Tris-HCl缓冲液，再逐滴加入50μL 1mol/L NaCl溶液，室温避光搅拌10小时；上述溶液在10000r/min的转速下离心10min，将沉淀重新分散在50μL 100mmol/L Tris-HCl和100mmol/L NaCl的混合液中；再次离心速度为10000r/min，时间10min，将沉淀重新分散在200μL pH 7.4的100mmol/L Tris-HCl和300mmol/L NaCl的混合液中，制得连接探针1-捕获探针-金纳米粒子聚合物，即S1-CP-AuNPs聚合物；

(2)玻碳电极分别用0.05μm和0.3μm的三氧化二铝粉打磨成镜面后，用二次水清洗2min，再依次在乙醇和二次水中超声清洗2min，室温晾干；1mg石墨烯分散在0.5mL质量分数为0.1wt％的壳聚糖溶液中，其中壳聚糖溶解在质量分数为0.5％的醋酸溶液中，超声共混，形成CS-GR复合物；将3μL CS-GR复合物滴涂在玻碳电极GCE上，室温晾干，制得壳聚糖-石墨烯/玻碳电极，即电极CS-GR/GCE；

(3)电极CS-GR/GCE在质量分数为1.5％的戊二醛溶液中浸泡1小时，用0.1mol/L NaOH溶液和10mmol/L pH 7.4的Tris-HCl依次清洗2min；将清洗后的电极浸在30μL 0.5μmol/L连接探针2中1小时，用10mmol/L pH 7.4的Tris-HCl缓冲液清洗2min后，制得连接探针2/壳聚糖-石墨烯/玻碳电极，即S2/CS-GR/GCE；

(4)将S2/CS-GR/GCE浸在30μL S1-CP-AuNPs中40℃0.5小时，通过S1和S2间碱基互补配对，将S1-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/GCE上，清洗液清洗后制得传感器S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。

如图1所示，石墨烯与壳聚糖非共价结合，石墨烯-壳聚糖共同修饰的玻碳电极能提供大的比表面积供更多的连接探针2固定；发夹结构的捕获探针和连接探针1通过Au-S键固定在金纳米粒子上；由于金纳米粒子大的比表面积，更多的捕获探针和连接探针1可以被固定；连接探针1和连接探针2之间碱基互补配对，从而将固定有捕获探针和连接探针1的金纳米粒子固定在电极上。切刻内切酶N.BstNB I识别双链DNA中特定碱基序列并切刻其中一条链。在没有p53存在的情况下，N.BstNB I不能切割发夹捕获探针(酶识别位点处在环处，不是双链结构)，因此发夹捕获探针茎中的富鸟嘌呤序列不能在氯高血红素和钾离子存在下形成DNA酶(DNAzyme)。当p53存在时，p53与发夹捕获探针互补配对形成双链结构，发夹的茎部打开，酶识别位点处是双链结构，被N.BstNB I识别并切割捕获探针。捕获探针被切割后富G结构的链留在金纳米粒子上即留在电极上，p53基因释放与其他发夹捕获探针结合形成双链结构供酶识别切割，从而形成更多留在纳米金上的富G结构，并且在氯高血红素和钾离子的存在下形成DNAzyme。因此，一个p53可以循环利用引发多个DNAzyme的形成。在静电作用下，荷正电的亚甲基蓝嵌入到DNA结构中，作为电子媒介体产生电化学信号，同时，DNAzyme能催化双氧水还原并促进亚甲基蓝的氧化还原反应，使信号进一步增强。

实施例2：电化学传感器的制备

一种多重信号放大的免标记电化学传感器，制备方法如下：

(1)连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定：

6μL 100μmol/L S1和24μL 100μmol/L CP中分别加入0.3μL 3mmol/L和1.2μL 3mmol/L三(2-氯乙基)磷酸酯(TCEP)，室温避光处理1小时；将上述两溶液混合加入到1mL搅拌速率为1r/s的AuNPs中，室温避光搅拌12小时；搅拌的过程中逐滴加入10μL 500μmol/L pH 7.4的Tris-HCl缓冲液，再逐滴加入115μL 1mol/L NaCl溶液，室温避光搅拌12小时；上述溶液在16000r/min的转速下离心20min，将沉淀重新分散在200μL 100mmol/L Tris-HCl和100mmol/L NaCl的混合液中；再次离心速度为16000r/min，时间20min，将沉淀重新分散在500μL pH 7.4的100mmol/L Tris-HCl和300mmol/L NaCl的混合液中，制得连接探针1-捕获探针-金纳米粒子聚合物，即S1-CP-AuNPs聚合物；

(2)玻碳电极分别用0.05μm和0.3μm的三氧化二铝粉打磨成镜面后，用二次水清洗3min，再依次在乙醇和二次水中超声清洗3min，室温晾干；3mg石墨烯分散在1.5mL质量分数为0.2wt％的壳聚糖溶液中，其中壳聚糖溶解在质量分数为1％的醋酸溶液中，超声共混，形成CS-GR复合物；将6μL CS-GR复合物滴涂在玻碳电极GCE上，室温晾干，制得壳聚糖-石墨烯/玻碳电极，即电极CS-GR/GCE；

(3)电极CS-GR/GCE在质量分数为2.5％的戊二醛溶液中浸泡2小时，用0.1mol/L NaOH溶液和10mmol/L pH 7.4的Tris-HCl依次清洗2min；将清洗后的电极浸在50μL 0.5μmol/L连接探针2中1小时，用10mmol/L pH 7.4的Tris-HCl缓冲液清洗2min后，制得连接探针2/壳聚糖-石墨烯/玻碳电极，即S2/CS-GR/GCE；

(4)将S2/CS-GR/GCE浸在30μL S1-CP-AuNPs中40℃1小时，通过S1和S2间碱基互补配对，将S1-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/GCE上，清洗液清洗后制得传感器S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。

实施例3：电化学传感器的制备

一种多重信号放大的免标记电化学传感器，制备方法如下：

(1)连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定：

10μL 100μmol/L S1和40μL 100μmol/L CP中分别加入0.5μL 3mmol/L和2.0μL3mmol/L三(2-氯乙基)磷酸酯(TCEP)，室温避光处理2小时；将上述两溶液混合加入到1.6mL搅拌速率为1r/s的AuNPs中，室温避光搅拌16小时；搅拌的过程中逐滴加入16μL 500μmol/L pH 7.4的Tris-HCl缓冲液，再逐滴加入200μL 1mol/L NaCl溶液，室温避光搅拌16小时；上述溶液在20000r/min的转速下离心30min，将沉淀重新分散在300μL 100mmol/LTris-HCl和100mmol/L NaCl的混合液中；再次离心速度为20000r/min，时间30min，将沉淀重新分散在800μL pH 7.4的100mmol/L Tris-HCl和300mmol/L NaCl的混合液中，制得连接探针1-捕获探针-金纳米粒子聚合物，即S1-CP-AuNPs聚合物；

(2)玻碳电极分别用0.05μm和0.3μm的三氧化二铝粉打磨成镜面后，用二次水清洗5min，再依次在乙醇和二次水中超声清洗5min，室温晾干；6mg石墨烯分散在3.0mL质量分数为0.5wt％的壳聚糖溶液中，其中壳聚糖溶解在质量分数为2％的醋酸溶液中，超声共混，形成CS-GR复合物；将8μL CS-GR复合物滴涂在玻碳电极GCE上，室温晾干，制得壳聚糖-石墨烯/玻碳电极，即电极CS-GR/GCE；

(3)电极CS-GR/GCE在质量分数为5％的戊二醛溶液中浸泡3小时，用0.1mol/L NaOH溶液和10mmol/L pH 7.4的Tris-HCl依次清洗5min；将清洗后的电极浸在80μL 0.5μmol/L连接探针2中1小时，用10mmol/L pH 7.4的Tris-HCl缓冲液清洗5min后，制得连接探针2/壳聚糖-石墨烯/玻碳电极，即S2/CS-GR/GCE；

(4)将S2/CS-GR/GCE浸在80μL S1-CP-AuNPs中40℃3小时，通过S1和S2间碱基互补配对，将S1-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/GCE上，清洗液清洗后制得传感器S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。

实施例4：可行性分析

实施例1制备的传感器S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE在浸入亚甲基蓝后并利用10mL pH7.4的100mmol/L Tris-HCl、0.1mol/L KCl和2mmol/L H₂O₂的混合液进行清洗，进行DPV检测，如图2所示，研究了传感器在信号放大过程的不同阶段的电信号。发现传感器S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE在与p53作用前(a)，与1nmol/L p53作用后(b)，再与酶反应后(c)时都在-0.244V处出现氧化峰(亚甲基蓝特征峰)，并且峰高之间差别不大；而当电极与氯高血红素作用后(d)，亚甲基蓝的氧化峰电流明显增强，这是由于形成的DNAzyme催化双氧水还原并促进亚甲基蓝的氧化还原，使信号增强，以上结果显示本方法提出的信号放大策略是可行的。

实施例5：电化学传感器在检测核酸含量的应用，包括以下步骤：

(1)标准溶液配制：配制一组含有不同浓度p53基因的pH为7.4的100mmol/L Tris-HCl缓冲溶液为标准液；

(2)建立工作曲线：将所述传感器分别浸入标准溶液中40℃孵育80分钟，孵育后用10mmol/L Tris-HCl缓冲液冲洗，再将所述传感器浸入含有0.5unit/μL N.BstNB I的50μL NEBuffer 3中55℃反应1小时，将溶液加热到90℃，保持10分钟使酶失活，冷却到室温后，用10mmol/L Tris-HCl缓冲液清洗传感器，再将所述传感器浸泡在50μL 0.2mmol/L氯高血红素(hemin)中，室温反应30分钟，用10mmol/L Tris-HCl缓冲液清洗传感器，再将所述传感器浸泡在50μL 0.5mmol/L亚甲基蓝(MB)溶液中，室温反应50分钟，用10mmol/L Tris-HCl缓冲液清洗传感器，在10mL pH 7.4的100mmol/L Tris-HCl、0.1mol/L KCl和2mmol/L H₂O₂混合液中进行差分脉冲伏安法(DPV)扫描(-0.5～0V)，记录响应电流I，如图3所示，该传感器利用以上步骤对(10^-15，10^-14，10^-13，10^-12，10^-11，10^-10，10^-9mol/L)不同浓度的标准溶液进行检测的DPV图，结果表明，随着基因p53核酸浓度的增加，DPV峰电流增大；所述I值与标准溶液中p53基因浓度c的对数(log c)成正比，绘制I-log c标准曲线，或采用线性回归法得到I-log c线性回归方程；如图4所示，线性回归方程为：Y＝82.71+4.417X，R＝0.9930。该传感器对p53基因检测范围10^-15～10^-9mol/L，检测限0.3×10^-15mol/L。

(3)p53基因含量测定：按照与步骤(2)相同的方法对所述传感器进行孵育和进一步反应后进行差分脉冲伏安扫描，记录响应电流；根据响应电流I和I-log c线性回归方程，得到p53基因含量。

实施例6：p53基因浓度的检测

配制含有未知p53基因浓度的检测液(pH为7.4的100mmol/L Tris-HCl缓冲溶液)；将实施例1制备的传感器浸入上述溶液中40℃孵育80分钟，孵育后用10mmol/L Tris-HCl冲洗，再将传感器分别浸入含有0.5unit/μL N.BstNB I的50μL NEBuffer 3中55℃反应1小时，将溶液加热到90℃，保持10分钟使酶失活，冷却到室温后，用10mmol/L Tris-HCl缓冲液清洗传感器，再将传感器分别浸泡在50μL 0.2mmol/L氯高血红素(hemin)中室温反应30分钟，用10mmol/L Tris-HCl缓冲液清洗传感器，再将传感器分别浸泡在50μL 0.5mmol/L亚甲基蓝(MB)溶液中室温50分钟，用10mmol/L Tris-HCl缓冲液清洗传感器。在在10mL pH7.4的100mmol/L Tris-HCl、0.1mol/L KCl和2mmol/L H₂O₂混合液中进行差分脉冲伏安法(DPV)扫描(-0.5～0V)，记录响应电流I，结果如图5所示，根据实施例3得到的I-log c线性回归方程Y＝82.71+4.417X，R＝0.9930，计算得p53基因浓度为10^-15mol/L。

实施例5：传感器对p53基因特异性的检测

配制p53基因(5’-TCA TCA CAC TGG AAG ACT C-3’)及单碱基错配(5’-TCA TCA CAC TGG AAG AAT C-3’)、全部碱基错配(5’-GAC GTC AGA CTT CCT GCG A-3’)的检测液，以上所述检测液均为基因含量为10^-9mol/L，pH为7.4的100mmol/L Tris-HCl缓冲溶液，同时设有空白液，即pH为7.4的100mmol/L Tris-HCl缓冲溶液，将实施例1制备的传感器分别浸入上述溶液中40℃孵育80分钟，孵育后用10mmol/L Tris-HCl缓冲液冲洗，再将传感器分别浸入含有0.5unit/μL N.BstNB I的50μL NEBuffer 3中55℃反应1小时，将溶液加热到90℃10分钟使酶失活，冷却到室温后，用10mmol/L Tris-HCl缓冲液清洗传感器，再将传感器分别浸泡在50μL 0.2mmol/L氯高血红素(hemin)中室温反应30分钟，用10mmol/L Tris-HCl缓冲液清洗传感器，再将传感器分别浸泡在50μL 0.5mmol/L亚甲基蓝(MB)溶液中室温50分钟，用10mmol/L Tris-HCl缓冲液清洗传感器。10mL pH 7.4的100mmol/L Tris-HCl、0.1mol/L KCl和2mmol/L H₂O₂混合液中进行差分脉冲伏安法(DPV)扫描(-0.5～0V)，记录响应电流I。由图6可见，该传感器对单碱基错配和全部碱基错配的p53基因的电化学响应远低于传感器对p53基因的电化学响应，因此，该传感器对p53基因的检测有特异性，这是由于发夹捕获探针CP对p53基因具有特异性，捕获探针CP只能与p53基因互补配对，打开发夹捕获探针CP暴露N.BstNB I的识别位点，从而剪切CP释放p53基因参与下一个循环，而留在纳米金上的部分捕获探针CP在钾离子存在下与hemin形成DNA酶结构，一系列的反应变化实现信号有效放大，而单碱基错配和全部碱基错配的基因不能与捕获探针CP互补配对，从而不能发生接下来一系列的反应。

一种多重信号放大的免标记电化学传感器及对核酸的检测专利购买费用说明