专利摘要

本发明涉及一种蔬菜提取物抑制黄嘌呤氧化酶的用途及在制备预防和治疗高尿酸血症或痛风食品中的应用，蔬菜粗提物的制备步骤如下：甲醇提取过程：新鲜蔬菜去除杂质置于40℃电热鼓风干燥箱中去除水分，用粉碎机将其粉碎成粉末状，称取一定量蔬菜干品于三角瓶中并用甲醇超声波提取45min，提取两次，过滤去除滤渣，滤液用旋转蒸发器回收溶剂，剩余物在电热真空干燥箱中干燥成浸膏状；蔬菜甲醇提取物被用于体外XO抑制试验，筛选出对黄嘌呤氧化酶具有抑制效果的蔬菜粗提物，本发明可为痛风或高尿酸血症疾病的预防或治疗提供饮食上的参考。

说明书

技术领域

本发明属于天然提取物领域，尤其是一种蔬菜提取物抑制黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)的用途。

背景技术

由于蔬菜中含有人体所需要的多种维生素、矿物质、碳水化合物、纤维素、有机酸、芳香物质等营养成分，因此，它是维持人体正常代谢，增强体质必不可少的营养物质，具有重要的营养功能，蔬菜生产也是农业生产中不可缺少的组成部分。许多研究表明，蔬菜摄取不足是慢性疾病的重要成因，甚至与多种癌症的成因有关，多吃蔬菜可降低胆固醇，减低罹患心血管疾病的危险，降低各种癌症发生率，提高免疫力，目前，蔬菜的保健价值正逐渐被人们所重视。随着研究的不断深入，蔬菜中一些对生命现象具有影响的微量或少量物质也被越来越多地挖掘出来，尤其是一些对人体有益的生物活性物质，成为开发植物性功能食品的研究热点之一。

近年来，随着人们生活水平的提高以及生活方式的改变，嘌呤类食物摄入量不断增加，高尿酸血症/痛风的患病率也逐年上升，黄嘌呤氧化酶(XO)是形成痛风和高尿酸血症的一个关键因素，也是治疗高尿酸血症的重要靶点，非嘌呤类前体物质在体内经过一系列的转化生成嘌呤类核苷酸，继续分解生成次黄嘌呤和黄嘌呤，最终经过黄嘌呤氧化酶的连续氧化而生成尿酸，因此，黄嘌呤氧化酶直接调控着体内尿酸水平的高低。别嘌呤醇作为唯一上市的黄嘌呤氧化酶抑制剂，对治疗高尿酸血症具有一定效果，但因其诸多副作用的存在，其应用受到一定程度的限制，因此，从天然产物中获得能够抑制黄嘌呤氧化酶的活性物质越来越受到人们的关注。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，发现蔬菜提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用，提供抑制黄嘌呤氧化酶的蔬菜粗提物，为痛风或高尿酸血症疾病的预防或治疗提供饮食上的参考。

本发明实现的技术方案如下：

蔬菜提取物抑制黄嘌呤氧化酶的用途。

而且，所述蔬菜为胡萝卜、香芹、大白菜、白萝卜、蚕豆、黄瓜、青椒、山药、生姜、 蒜、茼蒿、西葫芦、西芹、洋葱之一或混合物。

而且，所述蔬菜为山药，生姜或蒜。

而且，蔬菜提取物的制备工艺路线为：蔬菜鲜品→烘干→粉碎→甲醇超声波提取→过滤→浓缩→真空干燥→蔬菜提取物。

而且，所述蔬菜甲醇提取物的工艺条件为：固液比为1∶20(m/m)，提取时间为45min，提取2-4次，甲醇浓度为100％。

而且，蔬菜提取物的制备工艺路线为：蔬菜鲜品→烘干→粉碎→水回流提取→过滤→浓缩→冷冻干燥→蔬菜提取物。

蔬菜提取物在制备预防和治疗高尿酸血症或痛风食品中的应用。

本发明的优点和效果是：

1.本发明通过蔬菜粗提物对黄嘌呤氧化酶的抑制效果分析，得到对黄嘌呤氧化酶抑制效果最好的三种蔬菜样品，为这些蔬菜的保健价值及药食同源性提供理论基础，对开发天然产物作为黄嘌呤氧化酶抑制剂具有指导意义。

2.本发明在制备蔬菜提取物时采用水和极性较强的甲醇作为提取溶剂，对蔬菜的有效成分提取更加充分，其中用水作为提取剂，提取产物更适合作为食品或药品使用。

附图说明

图1为本发明动物分组及观察各组小鼠血清尿酸水平变化；

图2为本发明粗提物对高尿酸血症小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方案对本发明做进一步说明，以助于理解本发明的内容，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。

本发明思想为：以甲醇为溶剂对蔬菜进行提取，以提取时间、甲醇浓度、固液比进行单因素试验并以其结果为依据，设计4因素3水平(L9(34))的正交试验，重复3次，以蔬菜提取物得率衡量提取效果。以对黄嘌呤氧化酶抑制率为指标，以IC₅₀为评价依据，从获得的14种蔬菜粗提物中筛选出抑制效果最佳的几种蔬菜样品。

蔬菜提取物的制备流程如下：

甲醇提取流程：蔬菜鲜品→烘干→粉碎→甲醇超声波提取(45min，两次)→过滤→旋蒸浓缩→真空干燥→蔬菜提取物。

水提取流程：蔬菜鲜品→烘干→粉碎→水回流提取(4h，90℃)→过滤→浓缩→冷冻干燥→蔬菜提取物。

蔬菜提取物的制备方法如下，制备步骤以山药为例，生姜和蒜以及其他蔬菜提取物的制备方法同下：

1.以山药为例的甲醇提取过程如下：新鲜山药去除杂质，置于40℃电热鼓风干燥箱中去除水分，用粉碎机将其粉碎成粉末状，称取15g山药干粉于三角瓶中，加入无水甲醇150-300mL，超声波处理45min，提取两次，期间摇晃数次以便提取完全，过滤去除滤渣，滤液用旋转蒸发器回收溶剂，剩余物在电热真空干燥箱中干燥成浸膏状，得到山药甲醇粗提物；

各种蔬菜甲醇提取最佳工艺条件为：固液比为1∶10-20，提取时间为45min，甲醇浓度为100％。

2.水提取过程：新鲜山药去除杂质，置于40℃电热鼓风干燥箱中去除水分，用粉碎机将其粉碎成粉末状，称取15g置于旋蒸瓶中，加入300mL水，在90℃水浴锅中回流提取4h，过滤去除滤渣，在40℃干燥箱中去除大部水份，浓缩后进行冷冻干燥，得到浸膏状甲醇提取物。

3.配制200mmol/L pH 7.5磷酸盐缓冲液，0.1U/mL的酶液(黄嘌呤氧化酶)，1.5mmol/L黄嘌呤溶液，1mol/L HCl及不同浓度的样品溶液。

4.在1.5mL离心管中依次加入125μL样品液，150μL缓冲液(pH＝7.5)和100μL酶液(0.1U/mL)，充分混匀，25℃下静置15min，加入125μL黄嘌呤溶液(1.5mmol/L)使反应开始，反应30min，加入100μL HCl(1mol/L)使反应终止。

5.不同浓度的蔬菜甲醇提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制效果

分别选择浓度为25，50，100和200μg/mL蔬菜甲醇提取物进行XO抑制实验。其结果见表1。

表1不同浓度的蔬菜甲醇提取物对XO的抑制效果

从表1可以看出，在所测定的粗提物中，14种样品在200μg/mL浓度下全部对XO有抑制效果，其中有5种提取物抑制率超过50％，分别是蚕豆、黄瓜、山药、生姜和蒜；在100μg/mL和50μg/mL浓度下，14种样品中，只有西芹提取物对XO没有抑制效果，生姜提取物对XO的抑制率超过50％；在25μg/mL下，白萝卜、青椒、山药和茼蒿对XO没有显示抑制效果。

IC₅₀是抑制率为50％的样品浓度，是一个重要的参考指标，IC₅₀值越小，说明样品的抑制效果越强。从实验结果可以看出，IC₅₀值最小的三种蔬菜提取物分别是山药、生姜和蒜，IC₅₀值分别为142.3μg/mL、82.7μg/mL和86.1μg/mL，因此，选择这三种粗提物用于体内对高尿酸血症影响试验(见表3)。

6.不同浓度的蔬菜水提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制效果

分别选择浓度为25，50，100和200μg/mL蔬菜水提取物进行XO抑制实验。其结果见表2。

表2不同浓度的蔬菜水提取物对XO的抑制效果

从表2可知，在所测定的粗提物中，11种样品在200μg/mL浓度下全部对XO有抑制效果，但没有抑制率超过50％的样品；在100μg/mL浓度下，豆角、胡萝卜和油菜水提取物对XO没有抑制效果；在50μg/mL浓度下，豆角、西芹、胡萝卜和油菜水提取物对XO没有抑制效果；在25μg/mL浓度下，只有生菜、蚕豆、白菜和生姜显示了微弱的抑制效果，但抑制率都在10％以下。此外，所有样品的IC₅₀值都在300μg/mL以上，因此，蔬菜水提取物没有甲醇提取物对XO的抑制效果好。

以下通过动物实验说明蔬菜提取物对体内对小鼠高尿酸血症影响实验，具体方法如下：

1.药品溶液配制

样品溶液配制：精密称取三种蔬菜甲醇提取物(生姜或蒜或山药)，用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制混悬液，其浓度为30mg/mL和60mg/mL。分别按300mg/kg和600mg/kg剂量给药。

0.5％CMC-Na溶液：准确称取1mg CMC-Na，加入200mL灭菌蒸馏水。

氧嗪酸钾(potassium oxonic acid，POA)：用CMC-Na配成30mg/mL浓度的混悬液。

别嘌呤醇：将药片压碎，加0.5％CMC-Na溶液溶解，混匀，配成1mg/mL，按10mg/kg给药。

2.动物分组及观察指标

ICR雄性小鼠63只，试验前在实验室饲养一周以适应环境，体重达到25-28g，随机分成9组，每组7只，分别为正常组、模型组、别嘌呤醇组、三种蔬菜提取物(生姜，蒜，山药)高剂量组和低剂量组。

各组每天灌胃给药1次，连续给药7d，正常对照组和模型对照组分别给等剂量的0.5％CMC-Na；别嘌呤醇作为阳性对照组按10mg/(kg.d)给药；蔬菜提取物高、低剂量组分别按600mg/(kg.d)、300mg/(kg.d)给药。末次给药1h前，除正常组外，其余各组动物腹腔注射氧嗪酸钾盐300mg/kg造成小鼠高尿酸血症，正常组注射等量0.5％CMC-Na。1h后，各组动物摘眼球取血并取肝脏。血液在室温凝结0.5h，3500r·min^-1离心10min，得血清，肝脏冻存。测定血清尿酸，血清肌酐，血清尿素氮水平和肝脏中黄嘌呤氧化酶(XO)活性。各组粗提物对高尿酸血症小鼠的血清尿酸影响结果见表3。

表3各组小鼠血清尿酸水平变化

所测数据以均值士标准差(x±s)表示，用药前后比较、组间比较采用t检验。

a：P＜0.05，b：P＜0.01与模型组比较；c：P＜0.05，d：P＜0.01与正常组比较

由表3可以看出，正常小鼠的血清尿酸值为232.3±26.2μmol/L，腹腔注射尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾(PO)2h后血清尿酸值为298.0±31.2μmol/L，与正常组比较有显著升高(P＜0.01)。连续灌胃山药提取物7d并在最后1d腹腔注射PO后，高低剂量组的血清尿酸水平分别是207.1±16.2和184.1±28.3μmol/L，与模型组比较有极显著地降低(P＜0.01)；相同条件下，生姜和蒜的高剂量组测得尿酸水平分别为236.0±20.2和228.5±20.2μmol/L，低剂量组为245.6±21.6和238.3±20.9μmol/L，与模型组相比尿酸值下降显著(P＜0.05)。别嘌呤醇按照10mg/(kg.d)剂量给药，尿酸值为114.6±24.7μmol/L，极显著地降低高尿酸血症小鼠血清尿酸水平(P＜0.01)，并降至正常值以下。

图1为各组小鼠血清尿酸水平变化。从图1中可以看出，别嘌呤醇的降尿酸效果最好，而从其他三组粗提物组的降尿酸效果来看，山药粗提物的降尿酸效果优于其他两组。

3.粗提物对高尿酸血症小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响

三种蔬菜粗提物对高尿酸血症小鼠肝脏中XO活力的影响结果如表4所示。

表4粗提物对高尿酸血症小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响

所测数据以均值士标准差(x±s)表不，用药前后比较，采用t检验。

a：P＜0.05，b：P＜0.01与模型组比较。

由表4可以看出，高尿酸血症模型组中肝脏匀浆液XO活性与正常组相比有极显著的提高(XO活力由23.2±4.8U/gprot升高到28.9±3.9U/gprot，P＜0.01)，别嘌呤醇能极显著抑制模型小鼠肝脏匀浆液XO活性(XO活力降低到17.9±1.8U/gprot，P＜0.01)，与模型组相比，抑制率为38％；山药粗提物能够显著抑制XO活性(P＜0.05)，与模型组相比，高低剂量组的XO活力分别降低到23.3±3.2U/gprot和25.0±1.4U/gprot，对XO的抑制率分别是19％和13％；生姜和蒜粗提物在浓度为600mg/kg时才具有显著的抑制作用(P＜0.05)，XO活力分别降低到24.9±4.2U/gprot和24.4±3.2U/gprot，对XO的抑制率分别是13％和16％；而 在低浓度时抑制效果不明显(P＞0.05)。

图2为各组小鼠肝脏内黄嘌呤氧化酶的变化。结果表明，别嘌呤醇对黄嘌呤氧化酶的抑制效果最好，而从其他三种粗提物的酶抑制效果来看，山药粗提物的酶抑制效果优于其他两组，生姜和蒜粗提物的高剂量组才显示其对XO有抑制作用，该结果与其粗提物的降尿酸水平呈正相关，说明抑制XO可以起到降低尿酸的效果。

4.蔬菜粗提物对小鼠肾功能的影响

选择血清肌酐和尿素氮作为说明动物肾功能的两个指标，结果见表5。

表5各组小鼠血肌酐和尿素氮水平变化

a：P＜0.05，b：P＜0.01，与模型组比较；

c：P＜0.05，d：P＜0.01，与别嘌呤醇组比较

从表5可知，模型组、各给药组与正常组比较，血肌酐和血尿素氮均明显增高，说明造模药对大鼠肾功能有损害。别嘌呤醇组的血肌酐值和血尿素氮值与模型组相比，差异极显著(P＜0.01)，样品给药组与模型组相比无明显差别，说明别嘌呤醇可引起明显的肾功能损害。而蔬菜粗提物给药组的血肌酐值和血尿素氮值与别嘌呤醇组相比，差异极显著(P＜0.01)，说明蔬菜提取物高、低剂量组对高尿酸血症小鼠的肾功能无损伤危害。每种提取物高、低组之间进行比较，差异无显著性意义(P＞0.05)，结果表明，生姜、蒜和三药提取物各剂量组均没有使高尿酸血症小鼠血肌酐值及血尿素氮值升高，对小鼠肾脏均无损伤。

蔬菜提取物抑制黄嘌呤氧化酶的用途及在制备预防和治疗高尿酸血症或痛风食品中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。