专利摘要

本发明涉及一种高产胞外多糖的乳酸菌及其用途及所产生的胞外多糖，WG3-9菌株的分类名称：乳酸乳球菌乳脂亚种Lactococcus.Lactis subsp cremaris，保藏编号为：CGMCC No.5260。本发明筛选出的高产胞外多糖乳酸菌WG3-9能够高产胞外多糖，其含量达434.3mg/L，显著高于其它乳酸菌。实验测得本菌株WG3-9发酵所得的酸乳酸度为78°T，酸乳粘度为8600mPa·s，凝乳时间为5.5h，酸乳持水力为29.5％，脱水收缩敏感性为20％。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种新筛选的微生物，尤其是一种高产胞外多糖的乳酸菌及其用途及所产生的胞外多糖。

背景技术

发酵乳是指用脱脂乳或全脂乳经特殊微生物发酵而成的制品，在销售前必须保持微生物的活性，不得含有任何致病菌。美国、日本、欧洲及我国食品市场的信息显示，酸乳正朝着保健功能强、风味更饱满、柔和的方向发展。具有功能性的乳酸菌应用广泛，但我国具有自主知识产权的菌株较少，因此，我国急需开发风味优良、功能性强的乳酸菌。

乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一类糖类化合物，有的依附于微生物细胞壁形成荚膜，称为荚膜多糖；有的则进入培养基形成粘液，称为粘液多糖，是微生物适应环境的产物。乳酸菌EPS具有显著的生理功能：(1)抗癌、抗肿瘤作用；(2)促进益生菌在肠道粘膜上的吸附。(3)对免疫系统的调节有促进作用。(4)对细胞的保护作用。另外，乳酸菌EPS能够显著改善乳制品的结构与质地。在酸乳生产过程中，常出现粘度低、凝块破碎和大量乳清析出等问题，这些问题可以通过使用产EPS的乳酸菌解决。利用高产EPS的乳酸菌可以提高酸乳粘度，减少乳清析出和颗粒感，在大规模生产搅拌型酸乳时，有利于保持产品的均匀性。含有EPS的酸乳在经泵抽、搅拌和灌装时，可降低机械破坏程度，对热和物理应激的抵抗能力增强，使酸乳生产不添加或少添加稳定剂，满足消费者对纯天然食品的需求。此外，乳酸菌胞外多糖还可作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、胶凝剂、填充剂和持水剂，广泛用于食品、制药、石油化工以及生化产品等领域。

发酵酸乳按发酵温度可分为两个主要类型：嗜热型乳酸菌发酵和嗜温型乳酸菌发酵。目前，在市售酸乳中，主要以嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌作为主要发酵剂，在40℃左右进行发酵的高温发酵型酸乳，而由嗜温型乳酸菌发酵的酸乳主要以手工作坊的形式流传于民间，尤其在少数民族聚居的偏远牧区，因此，嗜温型乳酸菌发酵产品亟待开发。嗜温型乳酸菌最适生长温度介于20～30℃之间，常用菌种包括乳球菌和明串珠菌等，与高温发酵酸乳相比，中温发酵酸乳的发酵时间较长，酸度温和，挥发性风味物质更多，表观粘度更大，脱水收缩作用敏感性小，这就决定了中温发酵乳具有广阔的发展前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高产胞外多糖的乳酸菌及其用途及所产生的胞外多糖，本菌种在中温条件下发酵能够延缓乳酸菌产酸过程，发酵后所得发酵乳的酸度柔和，产生更多典型酸乳挥发性风味物质，产品风味饱满；此外，中温发酵工艺可降低生产能耗。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种高产胞外多糖的乳酸菌，名称为WG3-9，菌株的分类名称：乳酸乳球菌乳脂亚种Lactococcus.Lactis subsp cremaris，保存编号为：CGMCC No.5260，保藏日期为：2011年09年20日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

而且，所述乳酸菌高产胞外多糖，其胞外多糖产量为：434.3mg/L。

而且，所述乳酸菌发酵酸乳的最适发酵温度为30℃。

一种高产胞外多糖的乳酸菌作为酸乳发酵剂的用途。

一种高产胞外多糖的乳酸菌发酵酸乳的方法，方法如下：将乳酸菌按5％--10％的接种量接种于含全脂牛乳的容器中，30℃静置培养至牛乳凝固，4℃保持16h，得到酸乳。

而且，所述乳酸菌为先活化的乳酸菌。

而且，所述乳酸菌的活化方法为：将保藏于脱脂牛乳培养基中的乳酸菌，按5％接种量接入灭菌脱脂牛乳培养基中，30℃静置培养48h进行活化。

一种胞外多糖，由上述的高产胞外多糖的乳酸菌发酵得到。

本发明的优点和积极效果如下：

1.本发明筛选出的高产胞外多糖乳酸菌WG3-9能够高产胞外多糖，其含量达434.3mg/L，显著高于其它乳酸菌。实验测得菌株WG3-9发酵所得的酸乳酸度为78°T，酸乳粘度为8600mPa·s，凝乳时间为5.5h，酸乳持水力为29.5％，脱水收缩敏感性为20％。

2.本发明筛选出的高产胞外多糖乳酸菌WG3-9，可在30℃发酵酸乳，是一种中温型发酵菌株，在中温条件下发酵能够延缓乳酸菌产酸过程，发酵后所得发酵乳的酸度柔和，产生更多典型酸乳挥发性风味物质，产品风味饱满；此外，中温发酵工艺可降低生产能耗。

3.本发明筛选出的高产胞外多糖乳酸菌WG3-9发酵所得发酵酸乳粘稠，本菌株产生的胞外多糖能够显著改善乳制品的结构与质地，使产品无需添加稳定剂，满足消费者对纯天然食品的需求。

附图说明：

图1为本发明乳酸菌WG3-9的菌落照片；

图2为本发明乳酸菌WG3-9的电子显微镜照片。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

M17固体培养基：多聚蛋白胨5g/L，植物蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏2.5g/L，β-甘油磷酸二钠19g/L，抗坏血酸0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，乳糖5g/L，琼脂15g/L，调节pH至7.1。

MRS固体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物5g/L，K₂HPO₄ 2g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，葡萄糖20g/L，吐温80 1mL，MgSO₄·7H₂O 0.58g/L，MnSO₄·4H₂O 0.25g/L，琼脂20g/L，调节pH至6.4。

牛乳营养琼脂培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，NaCl 5g/L，牛乳200g/L，琼脂25g/L，调节pH至5.5。

全脂牛乳：全脂乳粉溶于蒸馏水中，浓度为100g/L。

Sevage试剂：氯仿与正丁醇以4∶1混合(体积比)。

一、菌株的分离与鉴定

1.样品稀释液制备及菌株分离

菌株分离样品为新疆伊犁地区哈萨克族牧民自制传统发酵乳制品，酸奶酪。

以无菌操作称取25g样品，放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶中(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)，充分振摇，制成1∶10的样品悬浮液。

吸取1∶10样品悬浮液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1∶100的样品悬浮液。另吸取1mL1∶10样品悬浮液液，按上述操作顺序，做10倍递增样品悬浮液。

根据待检样品活菌总数的估计，选择2～3个稀释度样品，每个稀释度吸取0.1mL样品悬浮液分别置于MRS固体培养基、M17固体培养基、牛乳营养琼脂培养基进行表面涂布，30℃培养48h。

2.菌株初筛

用接种针挑取上述平板上的单菌落，再进行划线或涂布分离纯化，对单菌落顺序编号，分别接入牛乳营养琼脂培养基/全脂牛乳培养基中，30℃培养24-48h。

形态观察：观察平板上菌落形态，挑取少量菌泥进行革兰氏染色，进行显微镜观察。

3.菌株复筛

3.1凝乳实验

将保藏于脱脂牛乳培养基中的乳酸菌，按5％接种量接入灭菌脱脂牛乳培养基中，30℃培养48h进行活化，活化后的菌株接种于含5mL全脂牛乳培养基试管中，30℃静置培养至牛乳凝固，按5％--10％的接种量接种于含100mL全脂牛乳三角瓶中，30℃静置培养至牛乳凝固，观察并记录凝乳状态。

3.2粘度的测定

粘度的测定：采用流变仪(博力飞公司DV-III+型)。在4℃下测试粘度，转子型号为RV5，分别在16r/min的速度下测定三次，每15s取值一次，每个样品做两个平行试样，结果计算算术平均值。

3.3感官评定

如表1所示，通过感官评定，得到一株凝乳快、质地粘稠并且风味优良的菌株，编号为WG3-9。

表1复筛菌株特性评价结果

注：感官评价总分为口感，气味和滋味，组织状态评分之和，感官评价值为10名评价员评价的平均值。粘度值为三次测定的平均值。

乳酸乳球菌乳脂亚种Lactococcus.Lactis subsp cremaris，保存编号为：CGMCC No.5260，保藏日期为：2011年09年20日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

4.菌株的鉴定

4.1形态观察

观察平板上菌落形态，挑取少量菌泥进行革兰氏染色，用光学显微镜及电子显微镜进行观察。结果显示：菌落为乳白色，圆形，有拉丝感，边缘光滑(图1)，光学显微镜观察显示：革兰氏染色呈阳性球菌，菌体成链或片状，电子显微镜显示：WG3-9为球菌，链状(图2)。

4.2生理生化鉴定

(1)葡萄糖产气实验

在装有MRS液体培养基的试管中倒置一个杜氏管，接入WG3-9，37℃培养24h，观察杜氏管中有无气泡生成。结果显示，WG3-9为葡萄糖产气，阴性。

(2)葡萄糖产酸实验

在装有MRS液体培养基的试管中加入1.4mL浓度为1.6g/100mL的溴甲酚紫作为指示剂，接入WG3-9，37℃培养24h，观察培养基颜色变化。

结果显示，WG3-9为葡萄糖产酸，阳性。

(3)过氧化氢酶实验

用接种环挑取M17培养基上的WG3-9，涂于干净的载玻片上，在其上滴加3％的过氧化氢溶液2mL，观察有无气泡生成。

结果显示，WG3-9为过氧化氢酶阴性。

4.316s rDNA鉴定

挑取WG3-9菌适量，加入M17培养基中，37℃培养过夜，取1mL菌液，5000×g离心5min，弃上清液，在沉淀中加入300μL细胞裂解液，加入10μL蛋白酶K，56℃水浴1h。100℃煮10min后，12000×g离心10min，取上清液进行PCR反应。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。引物序列如下：

上游引物：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

下游引物：GGTTACCTTGTTACGACTT

PCR产物纯化后送交英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。

测得菌株WG3-9的16s rDNA序列如序列3所示。

测序结果用BLAST程序与美国国立生物技术信息中心数据库中已报道的细菌16s rDNA进行比对，结果显示，WG3-9菌株的16s rDNA序列与乳酸乳球菌乳脂亚种Lactococcus.Lactissubsp cremaris的同源性大于99％。

由以上鉴定结果可得，菌株WG3-9为乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus.Lactis subspcremaris)，该菌已于2011年09月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC No.5260。

二、乳酸菌WG3-9制备功能性酸乳

1.功能性酸乳的制备

将保藏于脱脂牛乳培养基中的乳酸菌，按5％接种量接入灭菌脱脂牛乳培养基中，30℃培养48h进行活化。活化后的菌接种入5mL全脂牛乳试管中，30℃静置培养至牛乳凝固，按5％--10％的接种量接种于100mL全脂牛乳三角瓶中，30℃静置培养至牛乳凝固，4℃保持16h，得到不需添加增稠剂的酸乳。

2.酸乳理化指标测定

2.1酸乳凝乳时间的测定

活化后的菌接种于含5mL全脂牛乳的试管中，30℃静置培养至牛乳凝固，记录凝乳时间，做三组平行实验，取平均值。

实验测得菌株WG3-9凝乳时间为5.5h。

2.2酸乳粘度的测定

采用流变仪(博力飞公司DV-III+型)。在4℃下测试粘度，转子型号为RV5，分别在16r/min的速度下测定三次，每15s取值一次，每个样品做两个平行试样，结果计算算术平均值。

实验测得菌株WG3-9发酵所得的酸乳粘度为8600mPa·s。

2.3酸乳滴定酸度的测定

根据GB/T5009.46-1996，称量10g酸乳样品，置于100mL三角瓶中，加入20mL水，再加入0.5mL 0.5％的酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用0.1mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至微红色在1min内不消失为止。消耗的0.1mol/L的氢氧化钠标准溶液的毫升数乘以10，即得酸度(°T)，取三次测定的算术平均值。

实验测得菌株WG3-9发酵所得的酸乳酸度为78°T。

2.4持水力的测定

取酸乳样品20g，在10℃下，10000g离心30min，倾去上清物，使离心管保持倒置状态10min，结束后立即称重，每个样品做三个平行试样，结果取算术平均值。

酸乳的持水力＝离心沉淀物重量/样品重量×100％

实验测得菌株WG3-9发酵所得的酸乳持水力为29.5％。

2.5酸乳脱水收缩敏感性的测定

在6℃下，将50g凝固成熟后的酸乳小心倾入带有120目不锈钢丝网的大漏斗中，用100mL量筒收集沥出的乳清。收集时间为2h，最后对收集的乳清称重，每个样品做三个平行试样，结果取算术平均值。

酸乳胶体脱水收缩作用敏感性＝乳清析出量/样品重量×100％。

实验测得菌株WG3-9发酵所得的酸乳脱水收缩敏感性为20％。

三、乳酸菌WG3-9的胞外多糖的制备

1.酸乳的制备

见实施例步骤二“1.功能性酸乳的制备”部分的记载。

2.胞外多糖的提取

(1)等电点法除酪蛋白：用饱和NaOH调样液pH至8.0，4000r/min，离心15min，上清液用HCL调节pH至4.6，3000×g离心15min。

(2)酶解：调pH至7.5，加入1/10体积的胰酶液(浓度为3g/L，现配现用)，40℃水浴，酶解2.5h后，2000×g离心15min。

(3)Sevag脱蛋白：加入1/3体积的Sevag液振荡30min，3000×g离心15min，去除沉淀，重复三次。

(4)乙醇沉淀：加入3-5倍体积的95％的乙醇，充分振荡(多糖称絮状沉淀析出)，3000×g离心15min，收集沉淀。

(5)洗涤干燥：将沉淀用丙酮洗涤脱水两次，真空干燥得粗多糖。

3.粗多糖纯度测定

采用苯酚-浓硫酸法测定EPS含量，用葡萄糖作标准曲线。

准确吸取葡萄糖标准溶液(1mg/mL)，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.1，0.12mL(相当于葡萄糖0.0，50，60，70，80，90，100，120μg)，及各样品备用液0.1mL置于10mL比色管中，用蒸馏水补足1.0mL，分别加入1.0mL 5.0％苯酚水溶液，摇匀后静止2min，迅速加入5mL浓硫酸，静止10min后置于30℃水浴中加热15min，取出，置冷水中冷却，以空白管为对照，用紫外分光光度计在波长490nm处测定光密度。以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线，计算胞外多糖含量。

测得该菌株胞外多糖产量为434.3mg/L。

一种高产胞外多糖的乳酸菌及其用途及所产生的胞外多糖专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。