专利摘要

本发明涉及一种白黄链霉菌及利用该微生物制备生防微生物菌剂的方法和应用，制备方法步骤为：将白黄链霉菌置于保藏培养基中，于28～32℃活化5～7d后置于种子培养基中，30℃、160～180r/min培养36～48h，得到种子菌液；将所述种子菌液接种至发酵培养基中，于30℃恒温培养箱中发酵培养7d，再将发酵培养好的基质放置于25～35℃通风烘箱和/或空气能热泵烘干机中干燥或常温下自然干燥，然后进行粉碎，即得到生防微生物菌剂。本方法制得的生防微生物菌剂能够应用在对青枯菌拮抗作用中，能够应用在耐盐、耐旱、溶解土壤无机磷中，能够应用在合成铁载体和生长激素吲哚乙酸中，也能够应用在促进植物番茄种子萌发和促进生长中。

权利要求

1.一种利用白黄链霉菌（Streptomyces alboflavus）制备生防微生物菌剂的方法，其特征在于：步骤如下：

（1）菌种活化

将白黄链霉菌（Streptomyces alboflavus）TD-1 转接至斜面培养基，置于恒温培养箱中，30℃培养5~7d；

（2）种子培养

将生长良好的活化斜面菌种接种于含有100mL培养基装有种子培养基的三角瓶中，于30℃、180 r/min摇床振荡培养48h；

（3）发酵培养

在发酵培养基中接入4mL种子菌液，然后将其放置在30℃的恒温培养箱中发酵培养7d，之后将培养好的发酵物放置在25~35℃通风烘箱和/或空气能热泵烘干机中干燥或常温下自然干燥，经粉碎成粉状即为生防微生物菌剂；

所述种子培养基：葡萄糖，65 g；黄豆粉，10 g；硝酸钾，0.3 g；硫酸镁，1 g；磷酸氢二钾，1 g；氯化钠，0.5 g；氯化钾，0.2 g；硫酸亚铁，0.01 g；自来水1000mL，pH 7.2；

所述发酵培养基：自来水浸泡6-8h的低值谷物，所述低值谷物为放置时间超过一年或更长时间的陈大米、陈玉米、陈高粱、陈小麦，250mL的三角瓶内装30g浸泡过的低值谷物，分别加入pH为7含无机盐浓度C的水4mL；

其中，所述无机盐浓度C的水的配方如下：硝酸钾，1 g；磷酸氢二钾，0.5 g；氯化钠，0.5g；硫酸镁，0.5 g；硫酸亚铁，0.01g；自来水1000 mL；

其中，所述白黄链霉菌TD-1的保藏编号为：CGMCC No.4666。

2.根据权利要求1所述的生防微生物菌剂的方法，其特征在于：所述生防微生物菌剂中的活菌数为7.1×1011cfu/g。

3.根据权利要求1或2所述的生防微生物菌剂的方法，其特征在于：所述生防白黄链霉菌菌剂的有效成分为白黄链霉菌TD-1活菌孢子和/或白黄链霉菌TD-1的发酵液。

4.如权利要求1至3任一项所述的生防微生物菌剂的方法制得的生防微生物菌剂在对植物青枯菌拮抗作用中的应用。

5.如权利要求1至3任一项所述的生防微生物菌剂的方法制得的生防微生物菌剂在溶解土壤无机磷中的应用。

6.如权利要求1至3任一项所述的生防微生物菌剂的方法制得的生防微生物菌剂在合成铁载体和生长激素吲哚乙酸中的应用。

7.如权利要求1至3任一项所述的生防微生物菌剂的方法制得的生防微生物菌剂在促进植物番茄种子萌发和促进生长中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，尤其是一种白黄链霉菌及利用该微生物制备生防微生物菌剂的方法与应用。

背景技术

随着人民生活水平的日益提高，尤其是人们对生活质量提高的要求，全球都在积极发展绿色、有机生态农业，在其过程中就要求不用或限量使用化学肥料、化学农药和其它化学物质等。但是，目前有关植物病害的防治大多还是依赖化学药剂进行防控，对生态环境产生影响，病原微生物抗药性越来越大，还严重影响着农产品品质和人民的身体健康，不利于国民健康和我国农业可持续发展。

针对化学药剂治标不治本等防控方法的不足，采用生物防治是有效的途径之一。在植物病害的防治中，部分替代或者完全替代化学药剂，既能满足现代农业对环境保护的要求，也能避免化学农药残留导致的食品安全等问题。因此，生物防治技术作为农业可持续发展的有效方法之一，越来越受到人们的关注。

链霉菌(Streptomycete sp.)是抗生素类物质的主要生产菌，在微生物产生的20000多种活性物质中，链霉菌占到60％以上，是一类具有较大开发潜力的微生物资源，而且，多数链霉菌对人体无害，在农业植物病害的生物防治上具有广阔的应用前景。目前，在市场上推广的主要微生物菌剂主要集中在芽孢杆菌属和假单胞菌属等，有关放线菌尤其是链霉菌作为生产微生物菌剂的微生物菌属较少，因此，链霉菌属有望成为继芽孢杆菌属和假单胞菌属后的另一类在生物防治领域广泛应用的微生物。

青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的以土壤传播为主的毁灭性土传细菌性枯萎病害。它是一种杆状蛋白植物细菌病原体，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，寄主范围广泛、种类复杂、传播能力强，可危害番茄、烟草、马铃薯、香蕉和花生等多种重要经济作物。目前，对青枯菌(Ralstonia solanacearum)的生物防治主要集中在利用芽孢杆菌、假单胞菌等细菌，利用放线菌尤其是链霉菌抑制番茄青枯菌的报道较少。

通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

1、抗番茄青枯病复合微生物菌剂的生产工艺(CN107857627A)，提出一种抗番茄青枯病的复合微生物菌剂的生产工艺，所述肥料的原材料包括以下成分：胶质芽孢杆菌15～20份、哈茨木霉菌15～20份、细黄链霉菌15～20份、壳寡糖10～35份、植物油泥10～15份、草木灰10～15份，采用菌体制备、配料、复合菌制粒、第一层粘涂植物油泥、第二次粘涂草木灰、第三次粘涂壳寡糖生产工艺，将三种益生菌结合在一起，同时又与抗菌成分壳寡糖形成分离，最大程度发挥各自的功效。本发明利用微生物对青枯病菌的拮抗、杀灭作用及壳寡糖对番茄诱导抗性达到对此病的防治，具有无污染、环境友好、成本低廉、效果持久的优点。

2、抗马铃薯青枯病复合微生物菌剂的生产工艺(CN107446835A)，提出一种抗马铃薯青枯病的复合微生物菌剂的生产工艺，所述肥料的原材料包括以下成分：胶质芽孢杆菌15～20份、哈茨木霉菌15～20份、细黄链霉菌15～20份、壳寡糖10～35份、植物油泥10～15份、草木灰10～15份，采用菌体制备、配料、复合菌制粒、第一层粘涂植物油泥、第二次粘涂草木灰、第三次粘涂壳寡糖生产工艺，将三种益生菌结合在一起，同时又与抗菌成分壳寡糖形成分离，最大程度发挥各自的功效。本发明利用微生物对青枯病菌的拮抗、杀灭作用及壳寡糖对马铃薯诱导抗性达到对此病的防治，具有无污染、环境友好、成本低廉、效果持久的优点。

3、抗辣椒青枯病复合微生物菌剂的生产工艺(CN107446836A)，提出一种抗辣椒青枯病的复合微生物菌剂的生产工艺，所述肥料的原材料包括以下成分：胶质芽孢杆菌15～20份、哈茨木霉菌15～20份、细黄链霉菌15～20份、壳寡糖10～35份、植物油泥10～15份、草木灰10～15份，采用菌体制备、配料、复合菌制粒、第一层粘涂植物油泥、第二次粘涂草木灰、第三次粘涂壳寡糖生产工艺，将三种益生菌结合在一起，同时又与抗菌成分壳寡糖形成分离，最大程度发挥各自的功效。本发明利用微生物对青枯病菌的拮抗、杀灭作用及壳寡糖对辣椒诱导抗性达到对此病的防治，具有无污染、环境友好、成本低廉、效果持久的优点。

4、抗烟草青枯病复合微生物菌剂的生产工艺(CN107446837A)，提出一种抗烟草青枯病的复合微生物菌剂的生产工艺，所述肥料的原材料包括以下成分：胶质芽孢杆菌15～20份、哈茨木霉菌15～20份、细黄链霉菌15～20份、壳寡糖10～35份、植物油泥10～15份、草木灰10～15份，采用菌体制备、配料、复合菌制粒、第一层粘涂植物油泥、第二次粘涂草木灰、第三次粘涂壳寡糖生产工艺，将三种益生菌结合在一起，同时又与抗菌成分壳寡糖形成分离，最大程度发挥各自的功效。本发明利用微生物对青枯病菌的拮抗、杀灭作用及壳寡糖对烟草诱导抗性达到对此病的防治，具有无污染、环境友好、成本低廉、效果持久的优点。

5、抗茄子青枯病复合微生物菌剂的生产工艺(CN107439598A)，提出一种抗茄子青枯病的复合微生物菌剂的生产工艺，所述肥料的原材料包括以下成分：胶质芽孢杆菌15～20份、哈茨木霉菌15～20份、细黄链霉菌15～20份、壳寡糖10～35份、植物油泥10～15份、草木灰10～15份，采用菌体制备、配料、复合菌制粒、第一层粘涂植物油泥、第二次粘涂草木灰、第三次粘涂壳寡糖生产工艺，将三种益生菌结合在一起，同时又与抗菌成分壳寡糖形成分离，最大程度发挥各自的功效。本发明利用微生物对青枯病菌的拮抗、杀灭作用及壳寡糖对茄子诱导抗性达到对此病的防治，具有无污染、环境友好、成本低廉、效果持久的优点。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种白黄链霉菌及利用该微生物制备生防微生物菌剂的方法与应用，该方法制得的生防微生物菌剂能够应用在对青枯菌(Ralstonia solanacearum)拮抗作用中，能够应用在耐盐、耐旱、溶解土壤无机磷中，能够应用在合成铁载体和生长激素吲哚乙酸中，也能够应用在促进植物番茄种子萌发和促进生长中。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种白黄链霉菌，所述白黄链霉菌为白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1，该白黄链霉菌具有耐盐、耐旱特性，对植物青枯菌(Ralstonia solanacearum)具有抑制作用，同时也具有溶解土壤难溶无机磷的能力，还能够合成促进植物生长的铁载体和生长激素吲哚乙酸；

其中，所述白黄链霉菌TD-1已于2011年3月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.4666，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。

一种利用如上所述的白黄链霉菌制备生防微生物菌剂的方法，步骤如下：

将白黄链霉菌置于保藏培养基中，于28～32℃活化5～7d后置于种子培养基中，30℃、160～180r/min培养36～48h，得到种子菌液；将所述种子菌液接种至发酵培养基中，于30℃恒温培养箱中发酵培养7d，再将发酵培养好的基质于25～35℃通风烘箱和/或空气能热泵烘干机中干燥或常温下自然干燥，然后进行粉碎，即得到生防微生物菌剂。

而且，所述保藏培养基的配方如下：硝酸钾，1g；可溶性淀粉，20g；黄豆粉，10g；磷酸氢二钾，0.5g；氯化钠，0.5g；硫酸镁，0.5g；硫酸亚铁，0.01g；琼脂，20g；自来水1000mL，pH7.2，混合后，121℃高压蒸汽灭菌20min，即得；

所述种子培养基的配方如下：葡萄糖，65g；黄豆粉，10g；硝酸钾，0.3g；硫酸镁，1g；磷酸氢二钾，1g；氯化钠，0.5g；氯化钾，0.2g；硫酸亚铁，0.01g；自来水1000m L，pH 7.2，混合后，121℃高压蒸汽灭菌20min，即得。

而且，所述发酵培养基为：自来水浸泡6-8h的低值谷物，所述低值谷物为放置时间超过一年或更长时间的谷物，向浸泡过的低值谷物中加入含无机盐浓度C的水，湿的低值谷物：含无机盐浓度C的水的比例g：mL为15：2，混合后，121℃高压蒸汽灭菌20min，即得发酵培养基；

其中，所述无机盐浓度C的水的配方如下：硝酸钾，1g；磷酸氢二钾，0.5g；氯化钠，0.5g；硫酸镁，0.5g；硫酸亚铁，0.01g；自来水1000mL；

或者，所述种子菌液接种至发酵培养基中时，种子菌液：发酵培养基中的无机盐浓度C的水的体积比为1：1。

而且，所述生防微生物菌剂中的活菌数为7.1×1011cfu/g。

而且，所述生防白黄链霉菌菌剂的有效成分为白黄链霉菌Streptomycesalboflavus TD-1活菌孢子和/或菌丝体和/或白黄链霉菌Streptomyces alboflavus TD-1的代谢产物。

如上所述的生防微生物菌剂的制备方法制得的生防微生物菌剂在对植物青枯菌拮抗作用中的应用。

如上所述的生防微生物菌剂的制备方法制得的生防微生物菌剂在耐盐、耐旱、溶解土壤无机磷中的应用。

如上所述的生防微生物菌剂的制备方法制得的生防微生物菌剂在合成铁载体和生长激素吲哚乙酸中的应用。

如上所述的生防微生物菌剂的制备方法制得的生防微生物菌剂在促进植物番茄种子萌发和促进生长中的应用。

本发明取得的优点和积极效果是：

1、本发明方法制得的生防微生物菌剂能够应用在对青枯菌(Ralstoniasolanacearum)拮抗作用中，能够应用在耐盐、耐旱、溶解土壤无机磷中，能够应用在合成铁载体和生长激素吲哚乙酸中，也能够应用在促进植物番茄种子萌发和促进生长中；且该微生物菌剂制备工艺简单，发酵培养周期较短，并能够在土壤中快速定殖，适合工业大规模生产，具有很好的应用前景。

2、本发明方法将首次从土壤中筛选分离得到的白黄链霉菌(Streptomycesalboflavus)TD-1用来制备生防微生物菌剂，该生防微生物菌剂的有效成分为白黄链霉菌TD-1活菌孢子和/或/菌丝体和/或白黄链霉菌TD-1的代谢产物，该白黄链霉菌TD-1能够抑制番茄青枯菌的生长，具有耐盐、耐旱和溶解土壤难溶无机磷能力等特性，同时还能够合成促进植物生长的铁载体和生长激素吲哚乙酸，因此，该生防微生物菌株可用于制备防治青枯菌土传病害和促进植物生长的生防微生物菌剂。

附图说明

图1为本发明中白黄链霉菌TD-1的形态特征图(菌落、孢子、菌丝等)；

图2为本发明中白黄链霉菌TD-1的系统进化树；

图3为本发明中白黄链霉菌TD-1对青枯菌的抑制作用效果图；

图4为本发明中白黄链霉菌TD-1溶磷效果图；

图5为本发明中白黄链霉菌TD-1产铁载体活性图；

图6为本发明中白黄链霉菌TD-1产生长激素吲哚乙酸图；

图7为本发明方法制得的生防微生物菌剂；

图8为本发明方法制得的生防微生物菌剂浸提液对番茄种子萌发的测定图；

图9为本发明方法制得的生防微生物菌剂对番茄苗期的促生作用图。

具体实施方式

下面结合通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

一种生防微生物菌剂的制备方法，步骤如下：

(1)培养基的配制

保藏培养基：硝酸钾，1g；可溶性淀粉，20g；黄豆粉，10g；磷酸氢二钾，0.5g；氯化钠，0.5g；硫酸镁，0.5g；硫酸亚铁，0.01g；琼脂，20g；自来水1000mL，pH7.2。

种子培养基：葡萄糖，65g；黄豆粉，10g；硝酸钾，0.3g；硫酸镁，1g；磷酸氢二钾，1g；氯化钠，0.5g；氯化钾，0.2g；硫酸亚铁，0.01g；自来水1000m L，pH7.2。

无机盐浓度C配制：硝酸钾，1g；磷酸氢二钾，0.5g；氯化钠，0.5g；硫酸镁，0.5g；硫酸亚铁，0.01g；自来水1000mL。其它不同浓度的无机盐浓度在此基础上进行调整。

发酵培养基：自来水浸泡6-8h的低值谷物(放置时间超过一年或更长时间的陈大米、陈玉米、陈高粱、陈小麦等谷物)，250mL的三角瓶内装30g浸泡过的低值谷物，分别加入含不同无机盐浓度的水4mL。

将上述培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min，待用。

(2)菌种活化

将白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1转接至斜面培养基，置于恒温培养箱中，30℃培养5～7d。

(3)种子培养

将生长良好的活化斜面菌种接种于装有步骤(1)中制得的种子培养基三角瓶(250mL三角瓶内装100mL培养基)中，于30℃、180r/min摇床振荡培养48h。

(4)发酵培养

将步骤(1)中的发酵培养基，在121℃条件下灭菌20min，灭菌后待冷却至室温时，在添加不同无机盐浓度(3/C、2/C、C、2C、3C)的发酵培养基中接入10mL预先活化好的种子菌液，将其放置在30℃的恒温培养箱中发酵培养7d，之后将培养好的发酵物放置在25～35℃通风烘箱和/或空气能热泵烘干机中干燥或常温下自然干燥，经粉碎成粉状即为生防微生物菌剂，通过平板计数检测菌剂中的活菌数如下表4所示：

表4无机盐浓度对白黄链霉菌固态发酵生产生防微生物菌剂的影响

“+++”“++”“+”分别表示菌丝生长“较好”“好”“一般”

注：不同字母表示经邓肯氏新复极差法检验差异显著(P<0.05)。

由表4可知，无机盐浓度为C有利于白黄链霉菌固态发酵生产生防微生物菌剂。

实施例2

一种生防微生物菌剂的制备方法，步骤如下：

(1)培养基的配制

保藏培养基：硝酸钾，1g；可溶性淀粉，20g；黄豆粉，10g；磷酸氢二钾，0.5g；氯化钠，0.5g；硫酸镁，0.5g；硫酸亚铁，0.01g；琼脂，20g；自来水1000mL，pH7.2。

种子培养基：葡萄糖，65g；黄豆粉，10g；硝酸钾，0.3g；硫酸镁，1g；磷酸氢二钾，1g；氯化钠，0.5g；氯化钾，0.2g；硫酸亚铁，0.01g；自来水1000m L，pH7.2。

无机盐浓度C配制：硝酸钾，1g；磷酸氢二钾，0.5g；氯化钠，0.5g；硫酸镁，0.5g；硫酸亚铁，0.01g；自来水1000mL。

发酵培养基：自来水浸泡6-8h的低值谷物(放置时间超过一年或更长时间的陈大米、陈玉米、陈高粱、陈小麦等谷物)，250mL的三角瓶内装30g浸泡过的低值谷物，分别加入含无机盐浓度C的水4mL。

将上述培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min，待用。

(2)菌种活化

将白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1转接至斜面培养基，置于恒温培养箱中，30℃培养5～7d。

(3)种子培养

将生长良好的活化斜面菌种接种于装有步骤(1)中制得的种子培养基三角瓶(250mL三角瓶内装100mL培养基)中，于30℃、180r/min摇床振荡培养48h。

(4)发酵培养

将步骤(1)中的发酵培养基，在121℃条件下灭菌20min，灭菌完成完后待冷却至室温时，在发酵培养基中分别接入4mL、6mL、8mL、10mL、12mL预先活化好的种子菌液，然后将其放置在30℃的恒温培养箱中发酵培养7d，之后将培养好的发酵物放置在25～35℃通风烘箱和/或空气能热泵烘干机中干燥或常温下自然干燥，经粉碎成粉状即为生防微生物菌剂，通过平板计数检测菌剂中的活菌数如下表5所示：

表5种子菌液接种量对白黄链霉菌固态发酵生产生防微生物菌剂的影响

“+++”“++”“+”分别表示菌丝生长“较好”“好”“一般”，

注：不同字母表示经邓肯氏新复极差法检验差异显著(P<0.05)。

由表5可知，种子菌液接种量为4mL有利于白黄链霉菌固态发酵生产生防微生物菌剂。

实施例3

一种生防微生物菌剂的制备方法，步骤如下：

(1)培养基的配制

保藏培养基：硝酸钾，1g；可溶性淀粉，20g；黄豆粉，10g；磷酸氢二钾，0.5g；氯化钠，0.5g；硫酸镁，0.5g；硫酸亚铁，0.01g；琼脂，20g；自来水1000mL，pH7.2。

种子培养基：葡萄糖，65g；黄豆粉，10g；硝酸钾，0.3g；硫酸镁，1g；磷酸氢二钾，1g；氯化钠，0.5g；氯化钾，0.2g；硫酸亚铁，0.01g；自来水1000mL，pH7.2。

无机盐浓度C配制：硝酸钾，1g；磷酸氢二钾，0.5g；氯化钠，0.5g；硫酸镁，0.5g；硫酸亚铁，0.01g；自来水1000mL。

发酵培养基：自来水浸泡6-8h的低值谷物(放置时间超过一年更长时间的陈大米、陈玉米、陈高粱、陈小麦等谷物)，250mL的三角瓶内装30g浸泡过的低值谷物，分别加入不同pH含无机盐浓度C的水4mL。其中不同pH(5、6、7、8、9)无机盐浓度为C的水通过pH计调整，调节pH所用溶剂为1mol/L盐酸或氢氧化钠溶液。

将上述培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min，待用。

(2)菌种活化

将白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1转接至斜面培养基，置于恒温培养箱中，30℃培养5～7d。

(3)种子培养

将生长良好的活化斜面菌种接种于装有步骤(1)中制得的种子培养基三角瓶(250mL三角瓶内装100mL培养基)中，于30℃、180r/min摇床振荡培养48h。

(4)发酵培养

将步骤(1)中的发酵培养基，在121℃条件下灭菌20min，灭菌完成完后待冷却至室温时，在添加不同pH(5、6、7、8、9)无机盐浓度为C的发酵培养基中接入4mL预先活化好的种子菌液，将其放置在30℃的恒温培养箱中发酵培养7d，之后将培养好的发酵物放置在25～35℃通风烘箱和/或空气能热泵烘干机中干燥或常温下自然干燥，经粉碎成粉状即为生防微生物菌剂，通过平板计数检测菌剂中的活菌数如下表6所示：

表6初始pH对白黄链霉菌固态发酵生产生防微生物菌剂的影响

“+++”“++”“+”分别表示菌丝生长“较好”“好”“一般”

注：不同字母表示经邓肯氏新复极差法检验差异显著(P<0.05)

由表6可知，初始pH为7有利于白黄链霉菌固态发酵生产生防微生物菌剂。

实施例4

一种生防微生物菌剂的制备方法，步骤如下：

(1)培养基的配制

保藏培养基：硝酸钾，1g；可溶性淀粉，20g；黄豆粉，10g；磷酸氢二钾，0.5g；氯化钠，0.5g；硫酸镁，0.5g；硫酸亚铁，0.01g；琼脂，20g；自来水1000mL，pH7.2。

种子培养基：葡萄糖，65g；黄豆粉，10g；硝酸钾，0.3g；硫酸镁，1g；磷酸氢二钾，1g；氯化钠，0.5g；氯化钾，0.2g；硫酸亚铁，0.01g；自来水1000mL，pH 7.2。

无机盐浓度C配制：硝酸钾，1g；磷酸氢二钾，0.5g；氯化钠，0.5g；硫酸镁，0.5g；硫酸亚铁，0.01g；自来水1000mL。

发酵培养基：自来水浸泡6-8h的低值谷物(放置时间超过一年或更长时间的陈大米、陈玉米、陈高粱、陈小麦等谷物)，250mL的三角瓶内装30g浸泡过的低值谷物，分别加入pH为7含无机盐浓度C的水4mL。

将上述培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min，待用。

(2)菌种活化

将白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1转接至斜面培养基，置于恒温培养箱中，30℃培养5～7d。

(3)种子培养

将生长良好的活化斜面菌种接种于装有步骤(1)中制得的种子培养基三角瓶(250mL三角瓶内装100mL培养基)中，于30℃、180r/min摇床振荡培养48h。

(4)发酵培养

将步骤(1)中的发酵培养基，在121℃条件下灭菌20min，灭菌完成完后待冷却至室温时，在其发酵培养基中接入4mL预先活化好的种子菌液，然后，将其放置在30℃的恒温培养箱中发酵培养7d，之后，将培养好的发酵物放置在25～35℃通风烘箱和/或空气能热泵烘干机中干燥或常温下自然干燥，经粉碎成粉状即为生防微生物菌剂，通过平板计数检测菌剂中的活菌数为7.1×1011cfu/g。

本发明生防微生物菌剂的制备方法制得的生防微生物菌剂的相关检测：

检测例1

本发明方法制得的生防微生物菌剂浸提液对番茄种子萌发的测定：

(1)优选的，种子处理：75％乙醇或2％次氯酸钠消毒2min，再用无菌水冲洗三遍，室温下自然干燥。

(2)将本发明生防微生物菌剂与无菌水以质量比为1:9的比例进行混合，振荡摇匀，浸泡2h，4000r/min离心10min，取上清液(10倍稀释液)将其分别稀释至102、103、104倍，将选好消毒过的番茄种子分别在上述稀释液浸泡12h，对照组以无菌水浸泡处理，浸泡的种子放置于培养皿内纱布上，加少量的无菌水浸湿纱布，30℃下光照培养，各处理重复3次，每皿20粒，每天定期测定其发芽情况(种子发芽露白为标准)，共培养7d。

优选的，种子发芽率计算公式：发芽率(％)＝(发芽终期全部正常发芽的种子数/供试种子数)×100；

(3)生防微生物菌剂提液对番茄种子萌发的测定结果如图8所示。由图8可知，一定浓度的本发明生防微生物菌剂能够促进番茄种子的萌发。

检测例2

本发明方法制得的生防微生物菌剂对番茄苗圃期促生作用的测定：

(1)优选的，将本发明生防微生物菌剂分别以添加质量百分数为1％、2％、3％、4％和5％的比例掺入普通育苗基质中充分混匀，以不添加微生物菌剂为对照。玻璃培养皿灭菌后每平板分别铺约1cm厚基质，在其育苗基质中移入发芽(种子露白为标准)的番茄种子，每个处理重复3次，放置于光照培养箱中(温度30℃、湿度60％、昼夜各12h)培养，每天定时浇水，15d后测定其番茄生物量。

(2)生防微生物菌剂对番茄苗圃期的生物量的影响测定如表7和图9所示。

表7本发明生防微生物菌剂对番茄苗期生物量的影响(15d)

注：不同字母表示经邓肯氏新复极差法检验差异显著(P<0.05)。

(3)由表7和图9可知，在番茄苗圃期，掺入本发明菌剂在土壤培育15d后，对番茄苗有明显的促进作用(P<0.05)。其中对番茄苗株高、株重、根鲜重、地上部分鲜重较未接入菌剂对照组明显增加。说明本发明生防微生物菌剂对番茄苗生长有明显的促进作用。

本发明中所使用的白黄链霉菌为白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1，已于2011年3月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.4666，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；该菌筛选分离自天津市宝坻区饲料厂储粮仓周围的土壤，其为天津科技大学发酵食品与生物资源开发研究室筛选鉴定保藏，其形态特征如图1所示。

对白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1进行16S rDNA序列分析，其系统进化树如图2所示，其核苷酸序列如表1所示：

表1菌株TD-116S rDNA序列

本发明中所使用的供试病原菌为青枯菌(Ralstonia solanacearum)：购买于中国微生物菌种保藏中心，编号1.2839；

上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1对青枯菌(Ralstoniasolanacearum)抑制作用的检测方法如下：

制备PDA培养基平板，采用点接喷雾培养法，在平板上以原点为中心划十字线，在中心处点接TD-1菌株，28℃培养定殖3d，然后将浓度为107-109cfu/mL青枯病菌悬液喷雾至TD-1长好的平板上，28℃培养24h后，观察其抑制作用效果，如图3。

上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1的耐盐性测定方法如下：

向PDA培养基加入一定质量的NaCl，分别制成浓度为10g/L、50g/L、100g/L、150g/L、200g/L的NaCl的培养基平板，以不加NaCl的PDA培养基(浓度为0g/L)平板为对照，接种白黄链霉菌TD-1，30℃，培养7d，观察记录菌株生长情况。

白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1在含不同浓度的NaCl的PDA培养基上生长情况如下：

表2菌株TD-1耐盐性测定

注：“+++”表示生长较好，“++”表示生长良好，“+”表示生长一般，“-”表示不生长

上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1在含50g/LNaCl的培养基平板上还能够生长(与其它文献资料对比)，说明该菌株具有较好的耐盐性。

上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1的耐旱性测定方法如下：

向高氏I号培养基中添加质量浓度为5％、10％、15％、20％和25％过滤除菌的聚乙二醇(PEG 6000)，制成渗透压分别为-0.05、-0.15、-0.30、-0.49、和-0.73MPa的培养基平板。接种链霉菌TD-1，30℃，培养7d，观察记录菌株生长情况。

白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1在含不同浓度的聚乙二醇(PEG6000)高氏I号培养基生长情况如下：

表3菌株TD-1的耐旱性测定

注：“+++”表示生长良好，“++”表示生长一般，“+”表示能够生长

上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1在含不同浓度聚乙二醇(PEG6000)高氏I号培养基上都能够生长，说明该菌株具有较好的耐旱性。

上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1的溶磷能力测定方法如下：

在含难溶无机磷培养基的平板中央滴加10μL的Streptomyces alboflavus TD-1菌悬液，30℃培养7d，观察是否在该培养基中产生透明圈(图4)。

由图4可知，上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1能在难溶无机磷培养基产生透明圈，证明其具有一定的溶解磷能力。

上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1的产铁载体检测方法如下：

将白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1接种于淀粉酪蛋白硝酸盐液体培养基(SCN)中，30℃、180r/min摇床振荡培养，定时取样，10000r/min离心10min，取上清与CAS染液等体积混合均匀，静置30min，测定其在630nm处的吸光度值。计算公式如下：

式中Ar为未接种样品液体培养基与等体积CAS染液混合时的吸光度值；

式中As为接种样品液体培养基与等体积CAS染液混合时的吸光度值；

上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1的产铁载体检测如图5所示。

由图5可知，上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1能够产生促进植物生长的铁载体。

上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1的产吲哚乙酸检测方法如下：

将链霉菌接入含有质量浓度0.2％L-色氨酸的国际链霉菌计划1号液体培养基中，30℃、180r/min摇床振荡培养。定时取样，取滤液4℃下于5000r/min离心10min，再用0.22μm滤膜的无菌细菌滤器过滤。取1mL滤液和4mL Salkowski试剂，混匀后置于25℃下避光反应30min，反应后测量其在530nm下的吸光值。以已知浓度纯品IAA(Sigma)做标样绘制标准曲线，并计算培养滤液中IAA含量(μg·mL-1)。

上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1的产吲哚乙酸检测如图6所示。

由图6可知，上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1能够产生促进植物生长的激素吲哚乙酸。

利用上述白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1制备生防微生物菌剂：将白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1进行固态发酵制备生防微生物菌剂，所得菌剂的活菌数为7.1×1011cfu/g，其有效成分为白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1活菌孢子和/或菌丝体和/或白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)TD-1的代谢产物。

因此，本发明生防微生物菌剂的制备方法制得的生防微生物菌剂能够应用在对青枯菌(Ralstonia solanacearum)拮抗作用中的应用，能够应用在耐盐、耐旱、溶解土壤无机磷中，能够应用在合成铁载体和生长激素吲哚乙酸中，也能够应用在促进植物番茄种子萌发和促进生长中。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110>天津科技大学

<120>一种白黄链霉菌及利用该微生物制备生防微生物菌剂的方法与应用

<160>1

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>1401

<212>DNA

<213>菌株TD-1 16S rDNA序列(Unknown)

<400>1

ctctaccatg cagtcgacga tgaagccctt cggggtggat tagtggcgaa cgggtgagta60

acacgtgggc aatctgccct gcactctggg acaagccctg gaaacggggt ctaataccgg 120

ataacactct ccaccgcatg gtggggggtt gaaagctccg gcggtgcagg atgagcccgc 180

ggcctatcag cttgttggtg aggtagtggc tcaccaaggc gacgacgggt agccggcctg 240

agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300

tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg 360

ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcaggg aagaagcgca agtgacggta cctgcagaag 420

aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa gcgttgtccg 480

gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gcttgtcacg tcggttgtga aagcccgggg 540

cttaaccccg ggtctgcagt cgatacgggc aggctagagt tcggtagggg agatcggaat 600

tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac accggtggcg aaggcggatc 660

tctgggccga tactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 720

tggtagtcca cgccgtaaac ggtgggcact aggtgtgggc aacattccac gttgtccgtg 780

ccgcagctaa cgcattaagt gccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa 840

ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgtggc ttaattcgac gcaacgcgaa 900

gaaccttacc aaggcttgac atacaccgga aacggccaga gatggtcgcc cccttgtggt 960

cggtgtacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc1020

cgcaacgagc gcaacccttg tcccgtgttg ccagcaagcc cttcggggtg ttggggactc1080

acgggagacc gccggggtca actcggagga aggtggggac gacgtcaagt catcatgccc1140

cttatgtctt gggctgcaca cgtgctacaa tggccggtac aatgagctgc gataccgcga1200

ggtggagcga atctcaaaaa gccggtctca gttcggattg gggtctgcaa ctcgacccca1260

tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc agcattgctg cggtgaatac gttcccgggc1320

cttgtacaca ccgcccgtca cgtcacgaaa gtcggtaaca cccgaagccg gtggcccaac1380

cccttgtggg agggagcttc a1401

一种白黄链霉菌及利用该微生物制备生防微生物菌剂的方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。