专利摘要
本发明提供一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，涉及生物技术领域。所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，以甘草渣为碳源，采用里氏木霉、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌混合发酵，制备高活性的纤维素酶。将TrichodermareeseiATCC56764、FusariumoxysporumBN和AspergillusfumigatusHY混合发酵，不仅能够显著缩短发酵时间，而且能够显著提高纤维素酶活力。三种菌株混合发酵后，产生的纤维素酶活性大于各菌株单独发酵产生的纤维素酶活性之和，即三种菌株混合发酵产生了协同增效作用。
权利要求
1.一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于以甘草渣为碳源，采用里氏木霉、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌混合发酵，制备高活性的纤维素酶；所述里氏木霉为
2.根据权利要求1所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于所述
3.根据权利要求1-2之一所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于将
4.根据权利要求3所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于所述发酵培养基含有如下成分：甘草渣5-15g/l，葡萄糖0.5-2.0g/l，(NH4)2SO4 2-5 g/l，KH2PO41-4 g/l，MgSO4·7H2O 0.4-0.6 g/l，大豆粉7-10 g/l，pH 4.0-5.0。
5.根据权利要求4所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于发酵温度为25-35℃，发酵时间67-77 h。
6.根据权利要求5所述以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，其特征在于将发酵液离心，取上清液作为纤维素酶液。
说明书
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法。
背景技术
随着经济的发展，人类对石油、天然气、煤炭等不可再生化石能源的需求越来越大，由此产生了能源安全、石油消耗、全球变暖等诸多问题。这些问题促使世界各国加快了对安全、清洁、可再生的替代能源的研究。燃料乙醇是当前研究和应用都取得很大进展的一种清洁的可替代能源，但目前其生产主要依赖于淀粉和糖类原料，这两种原料利用涉及到与人畜争粮争地的问题，由此带来的粮食价格上涨问题已经显现。开发粮食以外的廉价原料对制取燃料乙醇技术意义重大。
木质纤维素原料生产燃料乙醇的工艺流程主要包括预处理、纤维素酶水解以及发酵菌种和发酵工艺三步。纤维素酶是使纤维素降解生成葡萄糖的一组酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶的三个组分经过协同作用，将大分子的纤维素降解为低分子量的寡糖、双糖或多糖。纤维素酶广泛的应用于食品加工业、酿造业、造纸工业、饲料添加剂、纺织工业、医药领域、植物细胞融合等方面。纤维素酶的产生菌包括细菌、真菌、酵母菌等，但目前主要用于纤维素酶生产的菌种主要为丝状真菌。丝状真菌产生的纤维素酶酶系较全，且其产生的酶多为胞外酶，便于后期的分离提取。目前传统工艺均采用单种菌株发酵产纤维素酶，酶活力较低，发酵生产时间过长。
甘草( Glycyrrhiza ) 属豆科甘草属的一种多年生草本植物，在我国集中分布在新疆、内蒙古、宁夏和甘肃等地区，中心区在新疆塔里木河流域和内蒙古西鄂尔多斯高原。目前，对甘草其药理方面的研究较多，主要是提取甘草中有药效作用的部分，如甘草酸，甘草黄酮等。甘草渣是甘草在提取甘草浸膏、甘草酸等产品后的残渣，通常作为废弃物遗弃，会对环境造成一定的危害。甘草渣营养成分非常丰富，据分析，每千克干甘草渣含粗蛋白75克、粗纤维43 克、粗脂肪8 克，除此之外还含有许多甘草产生的生物活性成份。若能有效利用甘草渣，变废为宝，对于可持续发展有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种以低廉碳源—废弃甘草渣为原料，巧妙通过菌种的协同效应制备纤维素酶的方法，能够在较短的时间内获得较高的纤维素酶活力。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法，以甘草渣为碳源，采用里氏木霉、尖孢镰刀菌、烟曲霉菌混合发酵，制备高活性的纤维素酶。
在本发明中，所述里氏木霉为
优选的技术方案中，所述Trichoderma reesei ATCC 56764、
优选的技术方案中，将Trichoderma reesei ATCC 56764、
在本发明中，所述发酵培养基含有如下成分：甘草渣8-11g/l，葡萄糖0.5-2.0g/l，( NH4)2SO4 2-5 g/l，KH2PO4 1-4 g/l，MgSO4·7H2O 0.4-0.6 g/l，大豆粉7-10 g/l，pH4.0-5.0 。
优选的技术方案中，发酵温度为25-35℃，发酵时间90-100 h。
优选的技术方案中，将发酵液离心，取上清液作为纤维素酶液。
申请人通过大量筛选实验，发现将
附图说明
图1显示了反应pH对纤维素酶活力的影响。
图2显示了反应温度对纤维素酶活力的影响。
具体实施方式
实施例一
采用
1.菌株来源
2.种子液的获得
种子液的获得：将
3.制备纤维素酶
发酵培养基含有如下成分：甘草渣（含水率为5%，粉碎至200目-300目）10g/l， 葡萄糖 1g/l, ( NH4)2SO4 4 g/l，KH2PO4 2 g/l，MgSO4·7H2O 0. 5 g/l，大豆粉8 g/l，pH4.5。
采用本发明方法制备纤维素酶，包括如下步骤：将1ml种子液接种至100ml发酵培养基中，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，每隔24小时，取发酵液，离心取上清液作为纤维素酶液。检测纤维素酶液的活力（滤纸酶活力）。
滤纸酶活力(FPA)按照国际理论和应用化学协会推荐的标准方法测定（Ghose TK.Measurement of cellulase activities.Pure &Appl.chem ., 1987 , 59(2):257～268） , 以国际单位(IU)表示。一个国际滤纸酶活力单位(IU)等于酶水解反应中每分钟由滤纸(Whatman No .1)生成1 μmol葡萄糖的酶量。
对比试验1：将1ml的
对比试验2：将1ml的
对比试验3：将1ml的
对比试验4：将1ml的
对比试验5：将1ml的
对比试验6：将1ml的
表1 本发明方法发酵不同时间的纤维素酶活力（IU/ml）
表2 对比试验不同发酵时间的纤维素酶活力（IU/ml）
从表1和2可以看到，采用本发明方法以
实施例二
采用
1.种子液的获得
将
2.制备纤维素酶
发酵培养基含有如下成分：甘草渣（含水率为5%，粉碎至200目-300目）15g/l， 葡萄糖 0.5g/l, ( NH4)2SO4 3 g/l，KH2PO4 3 g/l，MgSO4·7H2O 0. 6 g/l，大豆粉9 g/l，pH5.0。
将1ml种子液接种至100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，每隔24小时，取发酵液，离心取上清液作为纤维素酶液。按照实施例1中相同方法，检测纤维素酶液的活力（滤纸酶活力）。
表3 发酵不同时间的酶活（IU/ml）
从表3中可见，采用
实施例3
采用
1.种子液的获得
将
2.制备纤维素酶
发酵培养基含有如下成分：甘草渣（含水率为5%，粉碎至200目-300目）8 g/l， 葡萄糖 2 g/l, ( NH4)2SO4 2 g/l，KH2PO4 1 g/l，MgSO4·7H2O 0. 5 g/l，大豆粉10 g/l，pH4.5。
将1ml种子液接种至100ml发酵培养基，在30℃、180rpm条件下震荡培养6天，每隔24小时，取发酵液，离心取上清液作为纤维素酶液。按照实施例1中相同方法，检测纤维素酶液的活力（滤纸酶活力）。
表4 发酵不同时间的酶活（IU/ml）
从表4中可见，采用
实施例4 纤维素酶的性质
1.最适反应pH
检测实施例1中采用本发明方法制备的纤维素酶的最适反应pH，结果如图1。从图1可以看出，该纤维素酶的最适反应pH为5.0。
2.最适反应温度及温度稳定性
检测实施例1中采用本发明方法制备的纤维素酶的最适反应温度，结果如图2。从图2可以看，该纤维素酶的最适反应温度为60℃。
另外，检测了实施例1采用本发明方法制备的纤维素酶在60℃下放置不同时间后的滤纸酶活。结果如下：在60℃下放置42小时，仍然能够达到初始酶活力（在60℃处理前的酶活力）的80%。说明本发明方法制备的纤维素酶能够耐受高温，且在高温下稳定，因此在用于降解纤维素时，非常有利。
实施例5 纤维素酶的应用
采用实施例1中本发明方法制备的纤维素酶降解玉米芯。将玉米芯粉碎至小于1cm，利用0 .3wt%硫酸165℃处理1h，抽滤得到滤渣。将滤渣以干剂质量算，以5%的质量比加入水中，利用1M氢氧化钠溶液调节pH为4.8，置于60℃、130prm恒温水浴摇床中。按每克滤渣干剂加入10IU纤维素酶。酶解反应30h后取上清液利用高效液相色谱测定葡萄糖浓度。经检测，反应液中葡萄糖浓度为40.1g/L。
一种以低廉碳源快速制备高活性纤维素酶的方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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