专利摘要

本发明公开了一种基于转OPN基因诱导的肝细胞体外增殖方法，即通过腺病毒载体转大鼠OPN基因从而达到体外促进大鼠原代肝细胞增殖的方法，包括步骤：（1）大鼠OPN基因的获得；（2）重组腺病毒载体的构建；（3）腺病毒的包装与扩增；（4）大鼠原代肝细胞的分离与培养；（5）腺病毒对大鼠原代肝细胞的体外侵染。本发明提供的方法成本低廉，操作简单，并且能够达到很好的促肝细胞体外增殖的效果。

权利要求

1.基于转OPN基因诱导的肝细胞体外增殖方法，其特征在于通过腺病毒载体将大鼠OPN基因导入大鼠原代肝细胞中诱导大鼠肝细胞的体外增殖，其中大鼠OPN基因序列为：

atgagactgg cagtggtttg cttttgcctg ttcggccttg cctcctgtct cccggtgaaa 60

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ctgaaattcc gcatttctca tgaattagag agttcatctt ctgaggtcaa ttaa 954；

具体步骤为：（1）大鼠OPN基因的获得，通过PCR方法从大鼠再生肝组织中获得OPN基因的开放阅读框片段，并对产物进行双酶切；（2）重组腺病毒载体的构建，对腺病毒载体pHBAd-MCMV-RFP进行双酶切，将酶切好的OPN基因的开放阅读框片段与酶切载体连接，通过转化、筛选阳性克隆和摇菌后提取含有OPN基因的重组质粒；（3）腺病毒的包装与扩增，采用脂质体法将重组OPN质粒和骨架质粒共转染293细胞后收毒并扩增，对第三代病毒进行感染性滴度测定；（4）大鼠原代肝细胞的分离与培养，采用两步灌流法分散大鼠肝脏细胞，用体积浓度为60% Percoll离心法分离、纯化肝细胞，并铺于胶原蛋白预处理的培养板上培养；（5）腺病毒对大鼠原代肝细胞的体外侵染，按照MOI=50的比例加入腺病毒颗粒侵染大鼠原代肝细胞以诱导肝细胞的体外增殖。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及肝细胞体外增殖技术，具体涉及一种基于转OPN基因诱导的肝细胞体外增殖方法。

背景技术

肝脏作为人体的重要器官，担负着合成和分泌胆汁、代谢、解毒和维持内环境稳定等多种功能。许多理化因素、生物因素等可损伤肝脏，导致肝细胞再生受阻，肝脏结构受到破坏，产生一系列肝脏疾病。晚期肝脏疾病（肝硬化、肝癌）的5年生存率仅为14%。当前治疗终末期肝脏疾病主要有肝脏整体移植和干（肝）细胞移植等途径，然而，肝移植由于肝源缺乏和免疫排斥、干细胞移植由于各种研究瓶颈和缺陷而限制其应用，但成熟肝细胞移植却为等待供肝源的患者提供了过渡性治疗，并开始应用于肝急性损伤和先天性肝脏疾病。所以，目前对功能完善的肝细胞有较高的需求，其中，肝细胞的数量及其增殖能力对其移植后肝脏疾病的恢复具有重要的意义。体外分离、培养的原代肝细胞虽具有较完整的肝细胞功能，但体外培养中难以增殖和长期维持肝细胞的功能。因此，提高肝细胞体外增殖能力是解决肝细胞来源匮乏的一个重要方向，目前实现肝细胞体外增殖的策略有在培养基中添加生长因子、激素或化学物质等。

骨桥蛋白（osteopontin, OPN），又称分泌磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1,SPP1），早期T细胞活化因子1（early T-cell activation factor, Eta-1）等，是一种带负电荷的分泌型磷酸化糖蛋白，属于Th1细胞因子成员。经对现有技术文献的检索发现：在病理过程中，OPN通过作用于自然杀伤性T细胞、中性粒细胞、肝星形细胞和肝癌细胞而参与促进炎症反应、细胞活化、增殖或迁移，从而在肝炎、肝纤维化或肝癌的发生中发挥重要作用。其中，日本的一个课题组通过体内研究发现OPN在肝再生中参与诱导卵圆细胞的活化和增殖。刘莹莹等也证实了OPN能够促进卵圆细胞的增殖。在肝损伤引起的肝纤维化中，OPN参与促进肝星形细胞的活化和增殖。此外，OPN能通过自分泌和旁分泌诱导树突状细胞的成熟。

在现有技术下检索与本发明主题相关的文献与报道发现，俞燕等公开了OPN对于化学性或药物性肝损伤具有明显的保护作用，但Sahai等在非酒精性脂肪肝的小鼠模型中发现，OPN促进肝细胞释放谷丙转氨酶（ALT）而导致肝脏受损。王晓东等人报道，重组人OPN（rhOPN）可显著抑制小鼠原代肝细胞的体外增殖，而闻衍凯等人发现不同浓度的重组大鼠OPN（rmOPN）处理对小鼠原代肝细胞的增殖没有影响。为此，我们通过腺病毒载体将大鼠OPN基因导入大鼠原代肝细胞中，并达到了体外促进肝细胞增殖的效果。

发明内容

本发明为克服体外给予重组OPN对肝细胞增殖作用不良的现状，提供了一种基于转OPN基因诱导的肝细胞体外增殖方法，即通过转OPN基因从而促进肝细胞的体外增殖，拓展了骨桥蛋白在肝细胞增殖方面的新用途，进而能够用于肝组织工程中肝细胞的扩增或进一步用于体内治疗，达到促进肝细胞增殖的效果。

本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，基于转OPN基因诱导的肝细胞体外增殖方法，其特征在于通过腺病毒载体将大鼠OPN基因导入大鼠原代肝细胞中诱导其体外增殖，其中大鼠OPN基因（GeneBank登录号AB001382）序列为：

atgagactgg cagtggtttg cttttgcctg ttcggccttg cctcctgtct cccggtgaaa 60

gtggctgagt ttggcagctc ggaggagaag gcgcattaca gcaaacactc agatgctgta 120

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gtttctgatg aacagtatcc cgatgccaca gatgaggacc tcacctcccg catgaagagc 540

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tttcacagcc atgaggacaa gctagtccta gaccctaaga gtaaggaaga tgataggtat 900

ctgaaattcc gcatttctca tgaattagag agttcatctt ctgaggtcaa ttaa 954。

本发明所述的基于转OPN基因诱导的肝细胞体外增殖方法，其特征在于具体步骤为：（1）大鼠OPN基因的获得，通过PCR方法从大鼠再生肝组织中获得OPN基因的开放阅读框（ORF）片段，并对产物进行双酶切；（2）重组腺病毒载体的构建，对腺病毒载体pHBAd-MCMV-RFP进行双酶切，将酶切好的OPN基因的ORF片段与酶切载体连接，通过转化、筛选阳性克隆和摇菌后提取含有OPN基因的重组质粒；（3）腺病毒的包装与扩增，采用脂质体法将重组OPN质粒和骨架质粒共转染293细胞后收毒并扩增，对第三代病毒进行感染性滴度测定；（4）大鼠原代肝细胞的分离与培养，采用两步灌流法分散肝脏细胞，用体积浓度为60% Percoll离心法分离、纯化肝细胞，并铺于胶原蛋白预处理的培养板上培养；（5）腺病毒对大鼠原代肝细胞的体外侵染，按照MOI=50的比例加入腺病毒颗粒侵染大鼠原代肝细胞以诱导肝细胞的体外增殖。

本发明提供的方法成本低廉，操作简单，能够达到较好的肝细胞体外增殖效果。

附图说明

图1是过表达大鼠OPN基因对肝细胞活力的影响图；

图2是过表达大鼠OPN基因对肝细胞周期分布的影响图；

图3是过表达大鼠OPN基因对肝细胞增殖能力的影响图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例

第一部分腺病毒载体的构建

1. OPN基因ORF片段的PCR扩增、回收与酶切

按照Higgins和Anderson创立的方法建立经典的大鼠2/3部分肝脏切除模型，并取72h再生肝组织为实验材料，用Invitrogen公司的Trizol试剂提取72h肝组织的总RNA，采用Promega的AMV反转录试剂盒将2μg总RNA反转录成cDNA。以合成的第一链cDNA为模板，以OPN-F: acacgcggccgcATGAGACTGGCAGTGGTTTGC（含Not I酶切位点）和OPN-R：acacatgcatTTAATTGACCTCAGAAG（含Nsi I酶切位点）为上下游引物，用TOYOBO的高保真酶KOD plus在57℃的退火温度下进行30个PCR循环，以扩增OPN基因的ORF区。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳分离检测，后用北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司的DNA快速纯化/回收试剂盒回收OPN的ORF片段。随后对≤1μg的回收产物在37℃下进行Not I和Nsi I的双酶切3h，酶切完成后对产物进行琼脂糖凝胶电泳、胶回收和纯化。

2. pHBAd-MCMV-RFP载体的酶切与回收

将≤1μg的pHBAd-MCMV-RFP质粒载体在37℃下用Not I和Nsi I进行双酶切3h，酶切完成后同样对酶切体系进行琼脂糖凝胶电泳，接着进行载体片段的胶回收和纯化。

3. 重组质粒的构建与鉴定

将酶切均完成的OPN基因ORF与载体在16℃连接过夜连接 （16-18h），通过转化DH5a感受态细胞、平板挑菌和过夜摇菌，将菌液PCR鉴定为阳性的单克隆送测序鉴定，将经鉴定成功的重组质粒简化命名为pAd-OPN，同时也做空载pHBAd-MCMV-RFP对DH5a的转化和阳性克隆筛选，并命名为pAd-RFP，作为阴性对照载体。

第二部分 OPN过表达腺病毒的生产

1. 大量制备重组质粒

将对数生长期的pAd-OPN菌液和pAd-RFP.菌液2mL分别加入100mL含100μg/mL Amp的LB培养基中，37℃ 300rpm震荡摇菌过夜，采用北京康为世纪生物科技有限公司的中提质粒试剂盒提取质粒。

2. 重组腺病毒载体的包装，收毒及扩增

转染前一天，将293细胞接种于60mm培养皿，培养基为含10%（v/v）Hyclon胎牛血清的DMEM培养基，置37℃含体积浓度为5%的CO₂培养箱中培养过夜。待细胞生长的汇合率为70%-80%（面积比）时，取腺病毒质粒pAd-OPN和pAd-RFP，分别与骨架质粒pHBAd-BHG组合，并用Invitrogen的Lipofectamine 2000转染试剂共转染293细胞。转染6h后，更换细胞培养液。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。即将60mm培养皿中所有细胞及培养液收于15mL离心管中，将15mL离心管在液氮及37℃水浴反复冻融三次后，3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为OPN过表达腺病毒第一代毒种，将作为随后大量病毒扩增的毒种。从P1代病毒上清（约3mL左右）中取2mL去感染10cm细胞培养皿的细胞（细胞汇合率90%以上）。余下的病毒上清放入冻存管中-80℃保留，作为毒种保留。病毒扩增两天后待所有细胞脱落底面即可进行收毒，将细胞连同培养液一同收入15mL离心管中，依据前面的冻融方法，冻融三次，取上清进行下一代扩增或于-80℃保存。如此操作得到第二代和第三代病毒。

3. 感染性滴度检测

采用改进的TCID50法对第三代腺病毒的滴度进行测定。测定结果为1×10¹⁰PFU/mL, 体积1mL, 总滴度为：1×10¹⁰ PFU。

第三部分大鼠原代肝细胞的分离

将质量浓度为3%的戊巴比妥钠溶液按照1.5mL/kg腹腔注射大鼠，用体积分数为75%的酒精消毒腹部皮肤，十字打开腹腔，暴露肝门静脉，插管，结扎肝上、下腔静脉，将37℃D-Hank’s液从门静脉插管灌流，流速保持10-20mL/min，待肝脏涨大，肝表面出现均匀红点时，迅速剪断肾上、下腔静脉使灌流液流出，反复进行，直至肝脏表面呈均匀土黄色。用止血钳夹住肾上、下腔静脉，然后换用质量浓度为0.05%的胶原酶灌注液以1-2mL/min速度继续灌注至肝脏胀起，轻轻按摩肝脏，待肝脏表面出现龟背样花纹时，剪下肝脏，置于4℃预冷的PBS中。划开肝被膜，并用玻璃分针轻轻梳理肝脏，以促使细胞分散。收集细胞悬液置于400目尼龙网上过滤， 滤液即为肝脏细胞悬液。用4℃的PBS洗涤肝脏细胞3次，将细胞悬液铺于体积浓度为60%的Percoll液面上，4℃，200g离心15min，收集沉淀，即得到纯化的肝细胞。

第四部分腺病毒对大鼠原代肝细胞的增殖作用检测

1. 细胞计数试剂盒CCK8法检测肝细胞活力

用胶原蛋白预处理96孔培养板，并在96孔板中配置100μL密度为2×10⁴个/mL的肝细胞悬液（每孔约2000个细胞，24h后约3000个细胞）。将培养板置于培养箱预培养24h（37℃，体积分数5% CO₂）。后续将阴性对照病毒和OPN过表达腺病毒分别侵染大鼠原代肝细胞，每孔按照MOI=50加适量腺病毒颗粒，3孔重复，分别在感染后0、24、48和72h，向每孔加入10μL CCK8溶液后于培养箱内孵育3小时，最后酶标仪测定在450nm处的吸光度。结果发现，与对照相比，OPN腺病毒颗粒侵染大鼠原代肝细胞后于24、48和72h都能够提高肝细胞的活力，尤其在72h能显著增加肝细胞的活力（图1，**p﹤0.01）。

2. 流式细胞术PI染色法检测肝细胞周期

用胶原蛋白预处理6孔培养板，并于6孔板中接种5×10⁵-10⁶细胞，3孔重复，按照细胞量加入适量腺病毒颗粒，设置阴性对照和OPN过表达组，阴性对照病毒和OPN过表达腺病毒颗粒，感染36h后胰酶消化、离心收集细胞，并用PBS 轻柔悬浮细胞，得到单细胞悬液，不得有细胞聚集物。快速加入预冷的无水乙醇，使乙醇终浓度为70%（v/v），4℃冰浴过夜。过夜清洗后，用300目细胞筛过滤、离心处理细胞。接着用含Rnase A（10mg/mL）的0.5mL PBS悬浮细胞，在37℃消化1h。使用流式细胞仪之前1h，加入0.5mL 0.1mg/mL 的PI染液重悬细胞，4℃避光30min，流式细胞仪分析细胞周期分布情况。结果发现，过表达大鼠OPN基因可显著增加S期细胞的比例，极显著增加G₂/M期细胞的比例（图2，*p﹤0.05，**p﹤0.01）。

3. Ki67细胞免疫荧光法检测肝细胞增殖能力

用胶原蛋白预处理6孔培养板，并于6孔板中接种5×10⁵-10⁶细胞，3孔重复，按照细胞量加入适量腺病毒颗粒，设置阴性对照和OPN过表达组，感染36h后开始移去培养基，用PBS清洗细胞2次。用质量浓度为4%的多聚甲醛室温固定15min。用含0.1%（v/v）Triton-X-100的PBS室温通透化处理15min。用含3%（w/v）BSA的PBS室温封闭1h。加入抗Ki67的一抗（稀释度1:100），4℃孵育过夜，加入1:1000（稀释度1:1000）荧光二抗，室温下避光孵育1h。最后用抗荧光淬灭封片剂封片，于荧光显微镜下观察结果，激光共聚焦显微镜下拍摄照片。结果发现，过表达大鼠OPN基因明显提高Ki67阳性细胞的比例（图3）。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南师范大学

<120> 基于转OPN基因诱导的肝细胞体外增殖方法

<130> 2015

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 317

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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gaaacacaca gcctggagca gtccaaggag tataagcaga gggccagcca cgagagcact 720

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ctgaaattcc gcatttctca tgaattagag agttcatctt ctgaggtcaa ttaa 954

SEQUENCE LISTING

<110> 河南师范大学

<120> 基于转OPN基因诱导的肝细胞体外增殖方法

<130> 2015

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 317

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagactgg cagtggtttg cttttgcctg ttcggccttg cctcctgtct cccggtgaaa 60

gtggctgagt ttggcagctc ggaggagaag gcgcattaca gcaaacactc agatgctgta 120

gccacttggc tgaagcctga cccatctcag aagcagaatc ttctagcccc acagaattct 180

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gaggattctg tgaactcgga tgaatctgac gaatctcacc attccgatga atctgatgag 360

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cctgacggcc gaggtgatag cttggcttat ggactgaggt caaagtccag gagtttccct 480

gtttctgatg aacagtatcc cgatgccaca gatgaggacc tcacctcccg catgaagagc 540

caggagtccg atgaggctct caaggtcatc ccagttgccc agcgtctgag cgtgccctct 600

gatcaggaca gcaacgggaa gaccagccat gagtcaagtc agctggatga accaagcgtg 660

gaaacacaca gcctggagca gtccaaggag tataagcaga gggccagcca cgagagcact 720

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ctgaaattcc gcatttctca tgaattagag agttcatctt ctgaggtcaa ttaa 954

基于转OPN基因诱导的肝细胞体外增殖方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。