专利摘要

多级溶剂萃取法在酶促合成异槲皮苷中的应用，将芦丁溶解在pH为9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液溶液中，浓度为1g/L，加入体积为10%的离子液体[Bmim][BF4]和橙皮苷酶液构成反应体系，在40℃下恒温振荡培养得到芦丁水解液，离子液体共溶剂体系芦丁水解液的pH在2.0～7.0之间；芦丁水解液与萃取剂混合，水浴恒温震荡后，进行溶剂萃取，有机相与水相的相比在0.2～2.0之间，时间为10～150min，之后采用多级逆流萃取公式计算理论级数，在达到完全萃取时，根据所需最少比例的萃取剂及理论级数来筛选出最佳萃取条件。该方法操作简便，工艺易行，降低生物反应后期纯化的难度和成本，提高产品回收率和纯度。

权利要求

1.多级溶剂萃取法在酶促合成异槲皮苷中的应用，其特征在于萃取过程为：将芦丁溶解在pH为9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液溶液中，浓度为1g/L，再分别加入溶液体积10%的离子液体[Bmim][BF₄]和18%的浓度为0.01g/mL的橙皮苷酶液构成反应体系，在40℃下恒温振荡培养得到芦丁水解液，离子液体共溶剂体系芦丁水解液的pH在2.0～7.0之间；芦丁水解液与萃取剂混合，水浴恒温4～35℃震荡后，进行溶剂萃取，有机相与水相的相比在0.2～2.0之间，时间为10～150min，之后采用多级逆流萃取公式计算理论级数，在达到完全萃取时，根据所需最少比例的萃取剂及理论级数来筛选出最佳萃取条件，多级逆流萃取理论级数N的计算公式可表示为：

$\log \frac{x_N-\frac{y_0}{D}}{x_f-\frac{Y_0}{d}}=\log (\alpha -1)-\log ({\alpha }^{N+1}-1)$

其中，α表示萃取因子,D表示萃取分配系数，X_f(g/L)为萃取前料液中被萃取组分的浓度，y₀(g/L)为萃取前有机相中被萃取组分的浓度，X_N(g/L)为料液从第一级进入，从第N级流出后萃余相中的被萃组分的浓度。

2.根据权利要求1所述多级溶剂萃取法在酶促合成异槲皮苷中的应用，其特征在于：离子液体共溶剂体系芦丁水解液的pH优选为6。

3.根据权利要求1所述多级溶剂萃取法在酶促合成异槲皮苷中的应用，其特征在于：所选用的萃取溶剂为乙酸乙酯、石油醚（60-90℃）、异辛烷、三氯甲烷、正己烷、正丁醇、异戊醇、三乙酸甘油酯、苯、二硫化碳、溴乙烷、二氯甲烷或环己烷。

4.根据权利要求1所述多级溶剂萃取法在酶促合成异槲皮苷中的应用，其特征在于：有机相与水相的相比优选为1.2。

5.根据权利要求1所述多级溶剂萃取法在酶促合成异槲皮苷中的应用，其特征在于：溶剂萃取过程的时间优选为30min。

6.根据权利要求1所述多级溶剂萃取法在酶促合成异槲皮苷中的应用，其特征在于：多级逆流萃取的理论级数优选为4级。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物化工分离方法，具体涉及一种利用高效萃取体系从芦丁的酶促选择性水解液中制备异槲皮苷的方法。

背景技术

异槲皮苷属黄酮类化合物，是槲皮素与葡萄糖形成的糖苷，故又称为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷；它又是芦丁的衍生物，在结构上比芦丁少一个鼠李糖。国内外研究表明，异槲皮苷具有抗氧化、抗炎、抗抑郁、降压、降脂、降酶、抗诱变、抗病毒等多种药理作用，且在制备治疗心肌缺氧、脑缺氧、缺血性疾病以及抗血栓药物中作为有效成分而备受重视(J.Food.Sci,2008,73(7):561-568)。除此之外，异槲皮苷还能够抑制血管紧张素转化酶，起到抗高血压的功效；具有抗黑色素生成的生理功能(Inflammation Res,2007,56(10):402-408;J.EthnopHarmacol,2011,134(2):363-372)。针对异槲皮苷的药理作用，常被用作辅助药物或药物有效成分，其相关制剂开发前景广阔，有望成为新型高效的小分子临床药物。近年来，以异槲皮苷为原料合成的EMIQ（Enzymatically modified isoquercitrin）是一种新型的多用途食品添加剂，具有优质的抗氧化和着色特性，其安全性已获美国食品药品监督管理局的认证（中国生物工程杂志,2013,33(3)：130-134）。

异槲皮苷在自然界植物中的分布较广（如桑叶、田基黄、罗布麻等），但含量却极低，提取法制备异槲皮苷的难度极大，成本高，从而阻碍了其实际应用。研究发现，在分子结构上比异槲皮苷多一个鼠李糖基的芦丁在自然界分布广泛、来源丰富，以其为原料经橙皮苷酶（含鼠李糖苷酶）催化水解可选择性制备异槲皮苷。然而，在缓冲溶液体系中底物芦丁的溶解性较差，导致橙皮苷酶的催化效率较低。之后，在缓冲体系中添加一定比例的[Bmim][BF₄]形成共溶剂体系，有效地提高了芦丁的溶解度（从0.08g/L提高到0.80g/L），提高了糖苷酶的催化效率（摩尔得率可达91.41%），表明离子液体的共溶剂效应可以有效地强化选择性酶促合成异槲皮苷，操作简便，且对环境友好。在此基础上，如何从芦丁酶促水解液中低成本地分离出高纯度的异槲皮苷是其实际应用的根本保证。因为高效的分离纯化方法可以提高异槲皮苷的实际产量及质量，从而降低异槲皮苷的生产成本。因此，迫切需要开发一种生产成本低、工艺收率高、产品纯度好的高效萃取体系制备异槲皮苷的新方法。

对于异槲皮苷的分离纯化技术迄今报道较少，如使用聚酞胺树脂层析法（光谱实验室,2013,30(1):257-261）和硅胶板层析法（大连工业大学学报,2012,31(6):399-401），但这些实验室方法制备能力低，且成本高。到目前为止，尚未有利用溶剂多级萃取芦丁酶解液中异槲皮苷的工艺报道。本专利利用溶剂多级萃取芦丁酶解液中异槲皮苷，为生物转化天然产物的后期产物分离提供了新的思路和方法。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对以上技术问题，提供一种利用溶剂多级萃取芦丁酶解液中异槲皮苷的方法。该方法能够实现芦丁水解反应后产物异槲皮苷更高效地分离纯化，低成本获得高纯度产物。

技术方案：多级溶剂萃取法在酶促合成异槲皮苷中的应用，萃取过程为：将芦丁溶解在pH为9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液溶液中，浓度为1g/L，再分别加入溶液体积10%的离子液体[Bmim][BF₄]和18%的浓度为0.01g/mL的橙皮苷酶液构成反应体系，在40℃下恒温振荡培养得到芦丁水解液，离子液体共溶剂体系芦丁水解液的pH在2.0～7.0之间；芦丁水解液与萃取剂混合，水浴恒温4～35℃震荡后，进行溶剂萃取，有机相与水相的相比在0.2～2.0之间，时间为10～150min，之后采用多级逆流萃取公式计算理论级数，在达到完全萃取时，根据所需最少比例的萃取剂及理论级数来筛选出最佳萃取条件，多级逆流萃取理论级数N的计算公式可表示为：

logxN-y0Dxf-y0D=log(α-1)-log(αN+1-1)]]>

其中，α表示萃取因子,D表示萃取分配系数，X_f(g/L)为萃取前料液中被萃取组分的浓度，y₀(g/L)为萃取前有机相中被萃取组分的浓度，X_N(g/L)为料液从第一级进入，从第N级流出后萃余相中的被萃组分的浓度。

所述离子液体共溶剂体系芦丁水解液的pH优选为6。

所述萃取溶剂为乙酸乙酯、石油醚（60-90℃）、异辛烷、三氯甲烷、正己烷、正丁醇、异戊醇、三乙酸甘油酯、苯、二硫化碳、溴乙烷、二氯甲烷或环己烷。

所述有机相与水相的相比优选为1.2。

所述溶剂萃取过程的时间优选为30min。

所述多级逆流萃取的理论级数优选为4级。

有益效果：溶剂多级萃取法分离芦丁的酶促选择性水解产物，操作简便，工艺易行，降低生物反应后期纯化的难度和成本，提高产品回收率和纯度，为生物转化天然产物的后期产物分离提供了新的思路和方法。

附图说明

图1为本发明中使用的多级逆流萃取异槲皮苷流程示意图。

图中每一方块代表一个理论级。图中x(g/L)和y(g/L)分别代表料液和有机相中被萃取组分的浓度，x_f(g/L)为萃取前料液中被萃取组分的浓度，y₀(g/L)为萃取前有机相中被萃取组分的浓度。料液从第一级进入，与有机相充分混合达到平衡后依次进入下一级，从第N级流出后即为萃余相，萃余相中的被萃组分的浓度为x_N(g/L),i为到达第i级。有机相从第N级进入，依次从右向左流动，从第一级流出后即为萃取相，萃取相中的被萃组分的浓度为y₁(g/L)。萃取过程中，料液中的被萃组分浓度依次降低，而有机相中的被萃组分浓度依次增加。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明所述实施例中，萃取相异槲皮苷浓度由质量守恒计算得出。相关量计算如下：

多级逆流萃取理论级数N的计算公式可表示为：

logxN-y0Dxf-y0D=log(α-1)-log(αN+1-1)---(1)]]>

其中，α表示萃取因子，D表示萃取分配系数，X_f(g/L)为萃取前料液中被萃取组分的浓度，y₀(g/L)为萃取前有机相中被萃取组分的浓度，X_N(g/L)为料液从第一级进入，从第N级流出后萃余相中的被萃组分的浓度。

实施例1：

将芦丁溶解在pH为9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液溶液中，浓度为1g/L，分别加入溶液体积10%的离子液体[Bmim][BF₄]和18%的浓度为0.01g/mL的橙皮苷酶液构成反应体系，在40℃下恒温振荡培养得到芦丁水解液，下面每个实施例都参考该芦丁水解液制备方法。离子液体共溶剂体系芦丁水解液的pH在2.0～7.0之间；

取pH为2.0的芦丁水解液3mL于100mL锥形瓶中，加入3mL三乙酸甘油酯，30℃、130r/min于水浴恒温振荡器中振荡30min，倒入分液漏斗，待两相平衡后，HPLC检测萃相中和萃余相中的异槲皮苷，经计算异槲皮苷的萃取效率为60.27%。 E为萃取效率，V_水为水相体积，单位mL，V有为有机相体积，单位mL，计算得萃取分配系数D为1.52。 计算得萃取因子α为1.52。

当α^N+1≥1时，式(1)可写成

logxN-y0Dxf-y0D=-Nlogα+log(α-1α)---(2)]]>

当y₀=0时，式(2)即为

logxNxf=-Nlogα+log(α-1α)---(3)]]>

当异槲皮苷的收率达到99%时，即达到完全萃取时 所需的理论逆流萃取级数为5级。

实施例2：

芦丁水解液参考实施例1的制备，取pH为6.0的芦丁水解液3mL于100mL锥形瓶中，加入0.6mL正丁醇，20℃、130r/min于水浴恒温振荡器中振荡45min，倒入分液漏斗，待两相平衡后，HPLC检测萃相中和萃余相中的异槲皮苷，经计算异槲皮苷的萃取效率为52.16%，萃取分配系数为5.45，萃取因子为1.09。当异槲皮苷的收率达到99%时，多级逆流萃取的理论级数为6级。

实施例3：

芦丁水解液参考实施例1的制备，取pH为3.0的芦丁水解液3mL于100mL锥形瓶中，加入0.9mL异戊醇，15℃、130r/min于水浴恒温振荡器中振荡120min，倒入分液漏斗，待两相平衡后，HPLC检测萃相中和萃余相中的异槲皮苷，经计算异槲皮苷的萃取效率为53.2%，萃取分配系数为3.78，萃取因子为1.37。当异槲皮苷的收率达到99%时，多级逆流萃取的理论级数为7级。

实施例4：

芦丁水解液参考实施例1的制备，取pH为6.0的芦丁水解液3mL于100mL锥形瓶中，加入3.6mL三乙酸甘油酯，30℃、130r/min于水浴恒温振荡器中振荡30min，倒入分液漏斗，待两相平衡后，HPLC检测萃相中和萃余相中的异槲皮苷，经计算异槲皮苷的萃取效率为68.26%，萃取分配系数为1.79，萃取因子为2.15。当异槲皮苷的收率达到99%时，多级逆流萃取的理论级数为4级。

实施例5：

芦丁水解液参考实施例1的制备，取pH为7.0的芦丁水解液3mL于100mL锥形瓶中，加入6mL乙酸乙酯，4℃、130r/min于水浴恒温振荡器中振荡150min，倒入分液漏斗，待两相平衡后，HPLC检测萃相中和萃余相中的异槲皮苷，经计算异槲皮苷的萃取效率为52.26%，萃取分配系数为0.47，萃取因子为1.09。当异槲皮苷的收率达到99%时，多级逆流萃取的理论级数为7级。

实施例6：

芦丁水解液参考实施例1的制备，取pH为5.0的芦丁水解液3mL于100mL锥形瓶中，加入2.1mL环己烷，35℃、130r/min于水浴恒温振荡器中振荡10min，倒入分液漏斗，待两相平衡后，HPLC检测萃相中和萃余相中的异槲皮苷，经计算异槲皮苷的萃取效率为58.74%，萃取分配系数为2.03，萃取因子为1.42。当异槲皮苷的收率达到99%时，多级逆流萃取的理论级数为6级。

多级溶剂萃取法在酶促合成异槲皮苷中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。