专利摘要

本发明公开了一种脯氨酸亚细胞分离方法，取水稻幼苗样品在磺基水杨酸中冰浴研磨成匀浆；研磨液在3000r/min离心5min；下层沉淀物a备用；上清液a在10000r/min离心30min，得到上清液b，沉淀物b；用Tris‑HCl溶液溶解混合；均浆取600g在4℃离心，沉淀物c为细胞壁部分；上清液c为细胞器部分；将上清液c和沉淀物c分别10000r/min离心30min，分别保留沉淀物d、沉淀物e；分别加入3％的磺基水杨酸溶解，继续10000r/min离心，再分别保留下部的沉淀物f、沉淀物g；分别加入3％的磺基水杨酸溶解，超声处理30min，沸水浴30min，4℃3000r/min离心10min，得到的上清液d、上清液e分别为细胞器和细胞壁组分。可以方便直接的测定亚细胞结构中脯氨酸含量。

权利要求

1.一种脯氨酸亚细胞分离方法，其特征在于，具体按照以下步骤进行：

步骤1，取水稻幼苗样品0.4-0.6g在5-8mL 3％磺基水杨酸中冰浴研磨成匀浆；

步骤2，将步骤1得到的研磨液在3000r/min的条件下，4℃离心5min；下层沉淀物a留作备用；上清液a在10000r/min离心30min，得到上清液b为细胞液组分用于分析脯氨酸，沉淀物b留作备用；

步骤3，将步骤2中的沉淀物a、沉淀物b用4-6ml的Tris-HCl溶液溶解混合均匀；其中，Tris-HCl溶液为50mM Tris-HCl，pH＝7.5、0.25mM蔗糖、1mM二硫苏糖醇；

步骤4，将步骤3得到的均浆取600g在4℃离心1min，离心转速为2500r/min，沉淀物c为细胞壁部分；上清液c为细胞器部分；

步骤5，将步骤4得到的上清液c和沉淀物c分别在4℃下10000r/min离心30min，分别保留下部的沉淀物d、沉淀物e；

步骤6，在沉淀物d、沉淀物e中分别加入3-5ml的3％的磺基水杨酸溶解、混合均匀，继续在10000r/min离心30min，再分别保留下部的沉淀物f、沉淀物g；

步骤7，在沉淀物f、沉淀物g中分别加入3-5ml的3％的磺基水杨酸溶解、混合均匀，超声处理30min，沸水浴30min，4℃、3000r/min离心10min，得到的上清液d、上清液e分别为细胞器和细胞壁组分。

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞分离技术领域，涉及一种脯氨酸亚细胞分离方法。

背景技术

自1954年Kemble和MacPherson首先发现黑麦草的离体叶片在萎蔫时会产生并积累大量的游离脯氨酸以来，植物脯氨酸的研究开始受到关注。脯氨酸是植物蛋白质的组分之一，并可以游离状态广泛存在于植物体中。

在自然条件下，植物经常受到干旱、高盐、高温等逆境环境而引起渗透胁迫。很多植物在应对渗透胁迫时会累积脯氨酸。脯氨酸是一种相容性渗透调节物质，作为一种理想的渗透调节物质，脯氨酸具有分子量小，极易溶于水等特点。脯氨酸作为细胞结构保护剂、自由基清除剂在细胞应对胁迫时也发挥了重要的作用；而且脯氨酸还参与了氮代谢、和能量代谢；同时，脯氨酸作为逆境胁迫信号物质还可以诱导盐胁迫应答渗透调节蛋白的合成。

目前脯氨酸研究主要倾向于植物体内在的抗逆机制及转基因研究方面，很少有在亚细胞水平上去分析脯氨酸在植物体内的生理作用。目前主要用Tris-HCl离心法进行植物亚细胞分离，Tris-HCl缓冲溶液的pH有效范围在7.0-9.2之间，Tris的具体作用是作为抗酸成分，防止溶液pH大幅度下降；蔗糖或无机盐保持一定的渗透压避免细胞器破碎；二硫苏糖醇在碱性环境中具有强还原性，可以阻止蛋白质分子内或分子间形成二硫键；同时，二硫苏糖醇稳定性较低，需要再低温环境中使用。Tris-HCl溶液的pH值位7.0-9.2之间，而提取脯氨酸需要在磺基水杨酸弱酸环境中，因此不能使用Tris-HCl溶液直接进行脯氨酸亚细胞分离。植物体内的脯氨酸的提取液偏酸性，同时，脯氨酸的作为一种在渗透调节物质，在进行亚细胞分离过程中会受到蔗糖和无机盐的干扰。酸性茚三酮溶液也会受到Tris-HCl溶液pH值影响。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供一种脯氨酸亚细胞分离方法，解决了现有技术中存在的问题，可以方便直接的测定亚细胞结构中脯氨酸含量。

本发明所采用的技术方案是，一种脯氨酸亚细胞分离方法，具体按照以下步骤进行：

步骤1，取水稻幼苗样品在3％磺基水杨酸中冰浴研磨成匀浆；

步骤2，将步骤1得到的研磨液在3000r/min的条件下，4℃离心5min；下层沉淀物a留作备用；上清液a在10000r/min离心30min，得到上清液b为细胞液组分用于分析脯氨酸，沉淀物b留作备用；

步骤3，将步骤2中的沉淀物a、沉淀物b用4-6ml的Tris-HCl溶液溶解混合均匀；

步骤4，将步骤3得到的均浆取600g在4℃离心1min，离心转速为2500r/min，沉淀物c为细胞壁部分；上清液c为细胞器部分；

步骤5，将步骤4得到的上清液c和沉淀物c分别在4℃下10000r/min离心30min，分别保留下部的沉淀物d、沉淀物e；

步骤6，在沉淀物d、沉淀物e中分别加入3-5ml的3％的磺基水杨酸溶解、混合均匀，继续在10000r/min离心30min，再分别保留下部的沉淀物f、沉淀物g；

步骤7，在沉淀物f、沉淀物g中分别加入3-5ml的3％的磺基水杨酸溶解、混合均匀，超声处理30min，沸水浴30min，4℃低温3000r/min离心10min，得到的上清液d、上清液e分别为细胞器和细胞壁组分。

优选的，所述步骤1中，取水稻幼苗样品0.4-0.6g在5-8mL的3％磺基水杨酸中冰浴研磨成匀浆。

优选的，所述步骤3中，Tris-HCl溶液为50mM Tris-HCl pH 7.5、0.25mM蔗糖、1mM二硫苏糖醇。

本发明的有益效果：目前还没有使用酸性茚三酮比色法测定亚细胞结构中脯氨酸含量，本实验结合酸性茚三酮测定脯氨酸经典方法和Tris-HCl亚细胞经典分离方法，首次测定了脯氨酸在亚细胞结构的分布。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1脯氨酸在水稻幼苗叶中亚细胞分布图。

图2是本发明实施例2脯氨酸在水稻幼苗叶中亚细胞分布图。

图3是本发明实施例3脯氨酸在水稻幼苗叶中亚细胞分布图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种脯氨酸亚细胞分离方法，具体按照以下步骤进行：

步骤1，取0.5g水稻幼苗样品在6ml的3％磺基水杨酸中冰浴研磨成匀浆；

步骤2，将步骤1得到的研磨液在3000r/min的条件下，4℃低温离心5min；下层沉淀a留作备用，上清液a在10000r/min离心30min；上清液b为细胞液组分用于分析脯氨酸；沉淀b留作备用。

步骤3，将步骤1中的沉淀物a、b用5ml Tris-HCl溶液溶解混合均匀，Tris-HCl溶液为50mM Tris-HCl pH 7.5、0.25mM蔗糖、1mM二硫苏糖醇；

步骤4，将步骤3得到的均浆取600g在4℃低温离心1min，离心转速为2500r/min，沉淀物c为细胞壁部分；上清液c为细胞器部分；

步骤5，将步骤4得到的上清液c和沉淀物c分别在4℃下10000r/min低温离心30min，分别保留下部的沉淀物d、沉淀物e；

步骤6，在沉淀物d、沉淀物e中分别加入4ml的3％的磺基水杨酸溶解、混合均匀，继续在10000r/min离心30min，再分别保留下部的沉淀物f、沉淀物g；

步骤7，在沉淀物f、沉淀物g中分别加入4ml的3％的磺基水杨酸溶解、混合均匀，超声处理30min，沸水浴30min，4℃低温3000r/min离心10min，得到的上清液d、上清液e分为细胞器和细胞壁组分。

利用本方法可以实现水稻幼苗体内脯氨酸的亚细胞分离。经过后续的检测，水稻幼苗体内的脯氨酸的亚细胞含量百分比位如图1所示。可以看出，该方法将水稻幼苗体内的脯氨酸进行亚细胞分离后，细胞溶质、细胞器、细胞壁内脯氨酸含量分别占脯氨酸总量61.2％、22.24％、16.56％。

实施例2

一种脯氨酸亚细胞分离方法，具体按照以下步骤进行：

步骤1，取0.4g水稻幼苗样品在5ml的3％磺基水杨酸中冰浴研磨成匀浆；

步骤2，将步骤1得到的研磨液在3000r/min的条件下，4℃低温离心5min；下层沉淀a留作备用，上清液a在10000r/min离心30min；上清液b为细胞液组分用于分析脯氨酸；沉淀b留作备用。

步骤3，将步骤1中的沉淀物a、b用4ml Tris-HCl溶液溶解混合均匀，Tris-HCl溶液为50mM Tris-HCl pH 7.5、0.25mM蔗糖、1mM二硫苏糖醇；

步骤4，将步骤3得到的均浆取600g在4℃低温离心1min，离心转速为2500r/min，沉淀物c为细胞壁部分；上清液c为细胞器部分；

步骤5，将步骤4得到的上清液c和沉淀物c分别在4℃下10000r/min低温离心30min，分别保留下部的沉淀物d、沉淀物e；

步骤6，在沉淀物d、沉淀物e中分别加入3ml的3％的磺基水杨酸溶解、混合均匀，继续在10000r/min离心30min，再分别保留下部的沉淀物f、沉淀物g；

步骤7，在沉淀物f、沉淀物g中分别加入3ml的3％的磺基水杨酸溶解、混合均匀，超声处理30min，沸水浴30min，4℃低温3000r/min离心10min，得到的上清液d、上清液e分为细胞器和细胞壁组分。

经过后续的检测，水稻幼苗体内的脯氨酸的亚细胞含量百分比位如图2所示。可以看出，该方法将水稻幼苗体内的脯氨酸进行亚细胞分离后，细胞溶质、细胞器、细胞壁内脯氨酸含量分别占脯氨酸总量59.28％、24.89％、15.82％。

实施例3

一种脯氨酸亚细胞分离方法，具体按照以下步骤进行：

步骤1，取0.6g水稻幼苗样品在5ml的3％磺基水杨酸中冰浴研磨成匀浆；

步骤2，将步骤1得到的研磨液在3000r/min的条件下，4℃低温离心5min；下层沉淀a留作备用，上清液a在10000r/min离心30min；上清液b为细胞液组分用于分析脯氨酸；沉淀b留作备用。

步骤3，将步骤1中的沉淀物a、b用6ml Tris-HCl溶液溶解混合均匀，Tris-HCl溶液为50mM Tris-HCl pH 7.5、0.25mM蔗糖、1mM二硫苏糖醇；

步骤4，将步骤3得到的均浆取600g在4℃低温离心1min，离心转速为2500r/min，沉淀物c为细胞壁部分；上清液c为细胞器部分；

步骤5，将步骤4得到的上清液c和沉淀物c分别在4℃下10000r/min低温离心30min，分别保留下部的沉淀物d、沉淀物e；

步骤6，在沉淀物d、沉淀物e中分别加入5ml的3％的磺基水杨酸溶解、混合均匀，继续在10000r/min离心30min，再分别保留下部的沉淀物f、沉淀物g；

步骤7，在沉淀物f、沉淀物g中分别加入5ml的3％的磺基水杨酸溶解、混合均匀，超声处理30min，沸水浴30min，4℃低温3000r/min离心10min，得到的上清液d、上清液e分为细胞器和细胞壁组分。

经过后续的检测，水稻幼苗体内的脯氨酸的亚细胞含量百分比位如图2所示。可以看出，该方法将水稻幼苗体内的脯氨酸进行亚细胞分离后，细胞溶质、细胞器、细胞壁内脯氨酸含量分别占脯氨酸总量57.63％、24.23％、18.14％。

本实验使用酸性茚三酮染色法测定脯氨酸含量，如果直接用Tris-HCl溶液作为缓冲溶液进行脯氨酸亚细胞分离，Tris-HCl会和酸性茚三酮反应，严重影响脯氨酸测定。本发明结合了磺基水杨酸法提取脯氨酸和Tris-HCl溶液亚细胞分离技术，不仅将细胞体内的脯氨酸进行了亚细胞分离，同时也避免了Tris-HCl溶液对脯氨酸测定的影响。本文中所述的转速、温度、时间均经过多次实验才最终确定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

脯氨酸亚细胞分离方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。