专利摘要
本发明公开了一种水稻幼苗组织中的L‑半胱氨酸的提取及其检测方法，包括以下步骤：S1、取样：取水稻幼苗叶片或根系组织，添加液氮后研磨成粉末；S2、提取：称取上述步骤S1制得的粉末0.1～0.2g，加入冰乙酸溶液1.0～5.0ml研磨5～10min后；再依次加入三氯乙酸溶液0.5～2.0ml和乙醇溶液0.5～2.0ml浸泡1～5min得到研磨液混合物；S3、收集：将步骤S2得到的研磨液混合物进行离心取上清液，即得含有L‑半胱氨酸的提取液。取提取液，加入十六烷基三甲基溴化铵和1‑氯‑2，4‑二硝基苯后，90～110℃下恒温反应，反应完后降温，通过比色分析法或吸光光度法测定含量。
权利要求
1.一种水稻幼苗组织中的L-半胱氨酸的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、取样：取水稻幼苗叶片或根系组织，添加液氮后研磨成粉末；
S2、提取：称取上述步骤S1制得的粉末0.1～0.2g，加入冰乙酸溶液1.0～5.0ml研磨5～10min后；再依次加入三氯乙酸溶液0.5～2.0ml和乙醇溶液0.5～2.0ml浸泡1～5min得到研磨液混合物；
S3、收集：将步骤S2得到的研磨液混合物进行离心取上清液，即得含有L-半胱氨酸的提取液。
2.根据权利要求1所述的水稻幼苗组织中的L-半胱氨酸的提取方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述冰乙酸溶液中乙酸的体积百分数为1～2％；所述三氯乙酸溶液中三氯乙酸的体积百分数为1～2％；所述乙醇溶液中乙醇的体积百分数为70～95％。
3.根据权利要求1所述的水稻幼苗组织中的L-半胱氨酸的提取方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述三氯乙酸溶液与乙醇溶液的体积比为1:(1～2)。
4.根据权利要求1所述的水稻幼苗组织中的L-半胱氨酸的提取方法，其特征在于：所述提取方法还包括在取样前的除杂操作，将水稻细苗清洗干净后，用吸水纸吸干水稻细苗上残存的水分。
说明书
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种水稻幼苗组织中L-半胱氨酸的提取及其检测方法。
背景技术
L-半胱氨酸，是一种广泛存在动物、植物体内常见的氨基酸，其广泛存在于许多谷胱甘肽、蛋白质中。L-半胱氨酸具有缓解和修复放射线对人体损伤的作用，是维护肝脏正常功能的重要营养成分，对甲醛、乙醛、铅、镉等毒物具有良好的解毒作用。因此，在日常饮食中，保证每日摄入一定量的L-半胱氨酸对人体健康具有意义。水稻是我国60％人口的主食，若能提升水稻中L-半胱氨酸的含量对于提升我国国民健康将具有重要意义，尤其是针对幼苗期的水稻，若能及时发现其L-半胱氨酸含量低，则可尽早施加相应的肥料，进而提升谷物中的L-半胱氨酸含量。
要对水稻幼苗中L-半胱氨酸的含量进行改进，则必须先将L-半胱氨酸从水稻幼苗组织中提取出来。现有技术中，对L-半胱氨酸的提取与测定主要侧重于动物组织研究领域中，对植物组织中L-半胱氨酸的提取与测定研究相对较少。由于动物组织与植物组织在细胞结构、形态及成分差异等多方面均存在极大的不同，因此，不能直接将动物组织的提取与测定方法直接转移到植物组织中。此外，每种植物也各不相同，必须针对性的找出水稻幼苗中L-半胱氨酸的提取方案。
完成提取后，还需对L-半胱氨酸的含量进行检测，由于L-半胱氨酸仅在偏酸性溶液中可以稳定存在，而在中性或者偏碱性溶液中却呈现出不稳定的特性，易发生氧化还原反应，与胱氨酸间发生相互转换，因此，在提取和检测过程中需要控制好反应环境的pH值。目前，在生物和医学领域，L-半胱氨酸多采用衍生后进氨基酸分析仪或者高效液相色谱仪等，但是检测过程中样品前处理复杂，检测仪器设备昂贵，难以用于水稻研究过程中现场和大样本量的检测。
比色检测法是一种较为常用的快速检测手段，L-半胱氨酸是少数的含硫α-氨基酸之一，由于带有-SH遇亚硝基铁氰化钠呈深红色，但是由于亚硝基铁氰化钠溶液本身显深红色，使得显色反应受干扰程度较大。
基于此，找出一种水稻幼苗组织中L-半胱氨酸的提取及其检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的第一技术问题是：提供一种提取效果好的水稻幼苗组织中L-半胱氨酸的提取方法。
本发明所要解决的第二技术问题是：提供一种颜色变化明显且检测效率高的水稻幼苗组织中L-半胱氨酸的检测方法。
为了解决上述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：一种水稻幼苗组织中的L-半胱氨酸的提取方法，包括以下步骤：
S1、取样：取水稻幼苗叶片或根系组织，添加液氮后研磨成粉末；
S2、提取：称取上述步骤S1制得的粉末0.1～0.2g，加入冰乙酸溶液1.0～5.0ml研磨5～10min后；再依次加入三氯乙酸溶液0.5～2.0ml和乙醇溶液0.5～2.0ml浸泡1～5min得到研磨液混合物；
S3、收集：将步骤S2得到的研磨液混合物进行离心取上清液，即得含有L-半胱氨酸的提取液。
进一步地，所述步骤S2中，所述冰乙酸溶液中乙酸的体积百分数为1～2％；所述三氯乙酸溶液中三氯乙酸的体积百分数为1～2％；所述乙醇溶液中乙醇的体积百分数为70～95％。
进一步地，所述步骤S2中，所述三氯乙酸溶液与乙醇溶液的体积比为1:(1～2)。
进一步地，所述提取方法还包括在取样前的除杂操作，将水稻细苗清洗干净后，用吸水纸吸干水稻细苗上残存的水分。
为了解决上述第二个技术问题，本发明采用的技术方案为：一种水稻幼苗组织中L-半胱氨酸的检测方法，包括以下步骤：
取上述提取方法提取得到的提取液，加入十六烷基三甲基溴化铵和1-氯-2，4-二硝基苯后，90～110℃下恒温反应，反应完后将溶液温度降低至50～60℃，通过比色分析法或吸光光度法测定提取液中L-半胱氨酸的含量。
进一步地，所述提取液在进行比色检测之前通过0.22μm水相滤膜。
进一步地，所述十六烷基三甲基溴化铵是以十六烷基三甲基溴化铵水溶液的形式加入。
进一步地，所述1-氯-2，4-二硝基苯是以1-氯-2，4-二硝基苯的乙醇溶液的形式加入。
进一步地，所述恒温反应是在沸水浴环境中完成。
本发明的有益效果在于：本发明方案首次提出了从水稻中提取L-半胱氨酸并进行测定，而且采用本发明检测方案结合检测，可实现高效快速检测，从提取到检测完成总时间不超过30min，本发明方案显色效果显著，可快速实现半定量检测，提取及检测过程中的实验条件温和，可操作性强。与目前文献资料存在氨基酸分析仪分析方法、衍生-高效液相色谱法分析法，耗时显著缩短，无须复杂设备，整个提取及检测过程可在水稻试验田地现场操作，此外，整个过程的试剂可制备成试剂盒，用于工业化批量生产使用。
附图说明
图1为本发明实施例1中紫外分光光度法测得的浓度-吸光度关系图；
图2为本发明对比例1中测得的液相色谱图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明实施例1为：一种水稻幼苗组织中L-半胱氨酸的提取方法，包括以下步骤：
(1)取沙培法培育的湘早籼45号(购于湖南省农业科学院)水稻幼苗15天，用清水清洗水稻幼苗根系上残存的砂粒，然后吸干根系上多余的水分，吸水时注意轻轻抚压，不要弄断根和叶。
(2)选取称取步骤(1)所得水稻叶片或者根系组织，在研钵中用液氮迅速研磨成均匀的粉末。
(3)分别称取三组0.13g、0.11g和0.13g的水稻幼苗叶片组织粉末。
(4)先加入4.0mL1％冰乙酸(破坏组织中的纤维结构)研磨5min，后依次加入1％三氯乙酸(沉淀蛋白)1.0mL，95％乙醇(消除大分子蛋白，同时让核酸沉淀)1.0mL溶液浸泡2min，得研磨液混合物。
(5)将步骤(4)所得研磨液混合物转入塑料离心管中，在4℃条件下10000rmp离心10分钟，取上清液。
(6)将步骤(5)所得上清液过0.22μm水相滤膜，过滤液放置于4℃冰箱待分析。
(7)上述滤液中准确加入10μL 0.10mol/L十六烷基三甲基溴化铵水溶液和1μL0.07mol/L 1-氯-2，4-二硝基苯的乙醇溶液，迅速放入100℃水浴中2min(也可延长加热时间至5～8min)。
(8)沸水浴结束后，待温度降至50-60℃之间。用紫外及可见光分光光度计分析，波长设置为355nm，记录样品的吸光度值。选用零浓度即不含L-半胱氨酸(其他操作均与提取液的处理相同)作为空白参比溶液。
(9)在紫外及可见光分光光度计分析时，如果样品的吸光度值超过0.8，需要稀释样品。本次试验预测的是吸光度值达到2.5以上，样品测定前均稀释10倍，测量结果如下表1所示：
表1紫外分光光度法测量实验数据
通过测定水稻叶部里面的L-半胱氨酸，平行样的RSD在0.3％,，浓度在0.122-0.129之间，方法稳定可靠。
(10)紫外检测线性范围及检测限测定：配制L-半胱氨酸浓度为50μmol/L、40μmol/L、30μmol/L、20μmol/L、10μmol/L和0μmol/L的系列溶液，重复步骤(7)～(8)的操作，测定吸光度值，结果发现在0～40μmol/L范围内线性关系良好，将吸光度与对应的浓度点绘制后进行线性拟合，拟合线性方程为y＝0.02x-0.0866，如图1所示，具体拟合信息如下表2所示：
表2线性拟合参数
从上表可以看出，在1～40μmol/L范围内线性关系良好，最低检出限为0.5μmol/L。
对比例1
L-半胱氨酸还可以采取高效液相色谱法测定，由于半胱氨酸极性较大，一般采用衍生剂衍生后进样分析。
水稻研磨取上清液步骤同实施例1中步骤(1)～(5)。
本例采用液相色谱条件具体如下：
Aglient 1260配C18柱(250mm*4.6mm i.d.，5μm)配荧光检测器(激发波长470nm，发射波长540nm)。
梯度洗脱程序：
A：甲醇，B：乙腈，C：纯水，D：0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液。
1，0-5min，6.5％A，6.5％B，C87％，D1％；
2，5-15min，25％A，25％B，C49％，D1％；
3，15-20min，35％A，35％B，C29％，D1％；
同等浓度的L-半胱氨酸进样分析后色谱图如图2所示，从图2可以看出，采用高效液相色谱法，虽同样可以检测出L-半胱氨酸，但操作繁琐，且耗时较长。
同样对三个样品进行测量，结果如下表3所示：
表3色谱法测定结果表
从上述结果可以看出，采用本发明方案测得的结果与色谱法的结果基本一致。
对比例2
其与实施例一的区别仅在于，步骤(4)中研磨前加入的是硫酸。
步骤(4)具体为：先加入4.0mL1％硫酸研磨5min，后依次加入1％三氯乙酸1.0mL，95％乙醇1.0mL溶液浸泡2min，得研磨液混合物。
结果：显色时间长达1小时，且吸光值不稳定。
对比例3
其与实施例一的区别仅在于，步骤(4)中研磨前加入的是甲酸。
步骤(4)具体为：(4)先加入4.0mL1％硫酸研磨5min，后依次加入1％三氯乙酸1.0mL，95％乙醇1.0mL溶液浸泡2min，得研磨液混合物。
结果：不显色，无法检测。
对比例4
其与实施例一的区别仅在于，步骤(4)中先加入乙醇再加入三氯乙酸。
步骤(4)具体为：(4)先加入95％乙醇1.0mL 4.0mL，1％冰乙酸研磨5min，后依次加入1％三氯乙酸1.0mL，溶液浸泡2min，得研磨液混合物。
结果：不显色，无法检测。
本发明植物组织样品前处理处理过程操作简便，分析过程显色时间短且效果稳定可靠，显色剂用量少，实现了对植物组织中L-半胱氨酸的快速检测。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
一种水稻幼苗组织中L-半胱氨酸的提取及其检测方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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