专利摘要
本发明公开了一种FTO小分子抑制剂钯配合物及其合成方法，合成方法是将氨基硫脲溶于无水CH3OH，再加入2‑吡啶甲醛，回流反应，过滤，滤液室温挥发，有晶体析出，用无水CH3OH洗涤，得到配体；取配体和PdCl2于圆底烧瓶中，加入无水CH3OH溶解，回流反应，趁热过滤，滤液室温挥发，有固体析出，再用无水乙醇重结晶得到钯配合物晶体。本发明进一步对合成的钯配合物进行了多种肿瘤细胞增殖抑制活性实验，进行了FTO蛋白活性测试实验以及测定钯配合物和FTO蛋白的相互作用，证明钯配合物可以作FTO蛋白小分子抑制剂的备选。本发明合成方法，操作简单，便于实施。
权利要求
1.一种钯配合物在制备FTO小分子抑制剂中的用途，其特征在于，所述钯配合物的结构式如下式C3、C5所示：
2.根据权利要求1所述的钯配合物在制备FTO小分子抑制剂中的用途，其特征在于，C3、C5所示钯配合物的合成路线为：
C3所示钯配合物的合成方法，包括如下步骤：
（1）将4，4-二甲基-3氨基硫脲溶于无水CH3OH，再加入2-吡啶甲醛，65℃冷凝回流反应，过滤，滤液室温挥发，有晶体析出，用无水CH3OH洗涤，得到配体L3；
所述氨基硫脲与2-吡啶甲醛的摩尔比为1:1；
（2）取配体L3和PdCl2于烧瓶中，加入无水CH3OH溶解， 80℃冷凝回流反应，趁热过滤，滤液室温挥发，有固体析出，再用无水乙醇重结晶，得到钯配合物晶体；
所述配体L3与PdCl2的摩尔比为1:1；
C5所示钯配合物的合成方法是：
将氨基硫脲溶于无水CH3OH，再加入2-吡啶甲醛和PdCl2于烧瓶中，80℃冷凝回流反应，趁热过滤，滤液室温挥发，有透明黄色晶体析出，得到钯配合物C5；
所述氨基硫脲、2-吡啶甲醛和PdCl2的摩尔比为1:1:1。
说明书
技术领域
本发明涉及FTO小分子抑制剂，具体是一种以2-吡啶甲醛缩氨基硫脲为配体的钯配合物及其合成方法，并验证了该钯配合物对FTO蛋白的活性的影响。
背景技术
FTO(fat mass and obesity associated)基因，也被称为肥胖基因，是至今为止研究证实最确定的肥胖易感基因。最新研究发现肥胖基因FTO还与癌症关系密切，会导致各类癌症的发生，这为开发有效的靶向治疗药物提供了潜在靶点。2011年，FTO被确证为调控RNA甲基化修饰的去甲基化酶。这一发现揭示了细胞内m6A修饰过程是动态可逆的，并掀起了m6A修饰及其调控蛋白质生物学研究热潮，逐步形成了以m6A修饰为核心内容的表观转录组学研究新方向。后来发现，FTO基因是白血病、乳腺癌、成胶质细胞脑瘤等癌症发生的重要致癌基因之一。FTO在癌症的发展和进程中起着至关重要的作用，它调节癌症干细胞和免疫逃逸。换句话说，FTO促进癌细胞的生长、自我更新、转移和免疫逃逸。
缩氨硫脲类是一类具有显著抗肿瘤活性的螯合剂，目前很多研究主要是研究缩氨基硫脲铜、铂等金属配合物，对抗肿瘤缩氨基硫脲钯配合物的研究较少，尤其是合成具有抑制FTO蛋白活性的钯配合物鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种FTO小分子抑制剂钯配合物及其合成方法，该钯配合物是以2-吡啶甲醛缩氨基硫脲为配体合成的，本发明合成了5个缩氨基硫脲的钯配合物，实验证明其具有明显的抑制FTO活性，且对小鼠乳腺癌细胞具有良好的活性。
实现本发明目的的技术方案是：
一种FTO小分子抑制剂钯配合物，其结构式如下式C1-C5所示：
上述式C1-C5所示钯配合物的合成路线如下：
上述式C1-C4所示钯配合物的合成方法，包括如下步骤：
(1)将氨基硫脲溶于无水CH3OH，再加入2-吡啶甲醛，65℃冷凝回流反应，过滤，滤液室温挥发，有晶体析出，用无水甲醇洗涤，得到配体；
(2)取配体和PdCl2于烧瓶中，加入无水CH3OH溶解，80℃冷凝回流反应，趁热过滤，滤液室温挥发，有固体析出，再用无水乙醇重结晶，得到钯配合物晶体。
步骤(1)所述氨基硫脲与2-吡啶甲醛的摩尔比为1:1；所述溶剂的用量以能溶解参加反应的原料为宜。
步骤(2)所述配体与PdCl2的摩尔比为1:1；所述溶剂的用量以能溶解参加反应的原料为宜。
上述式C5所示钯配合物的合成方法是：
将氨基硫脲溶于无水CH3OH，再加入2-吡啶甲醛和PdCl2于烧瓶中，80℃冷凝回流反应，趁热过滤，滤液室温挥发，有透明黄色晶体析出，得到钯配合物C5；
所述氨基硫脲、2-吡啶甲醛和PdCl2、的摩尔比为1:1:1；
所述溶剂的用量以能溶解参加反应的原料为宜。
本发明选择2-吡啶甲醛、氨基硫脲进行缩合反应，得到配体；配体再与PdCl2反应得到钯配合物。本发明还提供了C1-C5钯配合物对MCF-7、MDA-MB-231肿瘤细胞的细胞活性实验，结果表明钯配合物对MDA-MB-231肿瘤细胞的活性抑制较强，但是对正常细胞毒性很低，远低于顺铂。
本发明进一步对合成的C1-C5钯配合物进行了FTO蛋白活性测试实验，以及测定钯配合物和FTO蛋白的相互作用，证明钯配合物对FTO蛋白有很好的抑制效果，并能有效作用于肿瘤，可作为FTO蛋白小分子抑制剂的备选。本发明合成方法，操作简单，便于实施。
附图说明
图1为实施例1合成的C1钯配合物的单晶结构图；
图2为实施例2合成的C2钯配合物的单晶结构图；
图3为实施例3合成的C3钯配合物的单晶结构图；
图4为实施例4合成的C4钯配合物的单晶结构图；
图5为实施例5合成的C5钯配合物的单晶结构图；
图6为对钯配合物C1-C5进行FTO蛋白的体外活性抑制实验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明内容作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：
C1钯配合物的合成，具体合成方法为：
(1)将3mmol的氨基硫脲溶于25ml无水甲醇，再加入2-吡啶甲醛3mmol，65℃冷凝回流4h，过滤，滤液室温挥发，有透明无色晶体析出，用10ml无水甲醇洗涤2-3次，得到配体L1(0.4435g，82.1％，透明白色晶体)；
Yield:0.4435g，82.1％,C7H8N4S：C,46.65；H,4.47；N,31.09；S,17.79.Found：C,46.58；H,4.37；N,31.19；S,17.89.IR,cm
(2)称取0.1mmol配体L1和0.1mmol PdCl2于一个50ml的烧瓶中，加入20ml无水甲醇溶解，再80℃冷凝回流4h，趁热过滤，滤液室温静置，缓慢挥发，有黄色固体析出，再用无水乙醇重结晶，得到钯配合物C1(0.02546g,79.6％，黄色晶体)，其晶体结构和数据保存至剑桥晶体数据中心(CCDC数据库)申请号：No.2019138；利用单晶衍射仪获取衍射数据，应用OLEX 2软件解析钯配合物C1晶体结构，如图1所示；
Yield:0.02546g，79.6％,C7H7ClN4PdS：C,26.18；H,2.20；Cl,11.04；N,17.45；Pd,33.14；S,9.99.Found：C,26.31；H,2.17；Cl,10.94；N,17.24；Pd,33.35；S,9.95.IR,cm
实施例2：
C2钯配合物的合成，具体合成方法为：
(1)将3mmol的4-甲基-3-氨基硫脲溶于25ml无水甲醇，再加入2-吡啶甲醛3mmol，65℃冷凝回流4h，过滤，滤液室温挥发，有透明无色晶体析出，用10ml无水甲醇洗涤2-3次，得到配体L2(0.4605，79.1％，透明白色晶体)；
Yield:0.4605g，79.1％，C8H10N4S：C,49.46；H,5.19；N,28.84；S,16.51.Found：C,49.51；H,5.21；N,28.73；S,16.41.IR,cm
(2)称取0.1mmol配体L2和0.1mmol PdCl2于一个50ml的烧瓶中，加入20ml无水甲醇溶解，再80℃冷凝回流4h，趁热过滤，滤液室温静置，缓慢挥发，有黄色固体析出，无水乙醇重结晶，得到钯配合物C2(0.02785g,83.4％，黄色晶体)，其晶体结构和数据保存至剑桥晶体数据中心(CCDC数据库)申请号：No.2019136；利用单晶衍射仪获取衍射数据，应用OLEX2软件解析钯配合物C2晶体结构，如图2所示；
Yield:0.02785g，83.4％，C8H9ClN4PdS：C,28.67；H,2.71；Cl,10.58；N,16.72；Pd,31.76；S,9.57.Found：C,28.71；H,2.73；Cl,10.51；N,16.74；Pd,31.73；S,9.58.IR,cm
实施例3：
C3钯配合物的合成，具体合成方法为：
(1)将3mmol的4，4-二甲基-3氨基硫脲溶于25ml无水甲醇，再加入2-吡啶甲醛3mmol，65℃冷凝回流4h，过滤，滤液室温挥发，有透明无色晶体析出，用10ml无水甲醇洗涤2-3次得到配体L3(0.5194g，83.2％，黄色晶体)；
Yield:0.5194g，83.2％，C9H12N4S：C,51.90；H,5.81；N,26.90；S,15.39.Found：C,51.88；H,5.91；N,26.95；S,15.49.IR,cm
(2)称取0.1mmol配体L3和0.1mmol PdCl2于一个50ml的烧瓶中，加入20ml无水甲醇溶解，再80℃冷凝回流4h，趁热过滤，滤液室温静置，缓慢挥发，有黄色固体析出，无水乙醇重结晶，得到Pd配合物C3(0.02957g,85.0％，黄色晶体)，其晶体结构和数据保存至剑桥晶体数据中心(CCDC数据库)申请号：No.2019137；利用单晶衍射仪获取衍射数据，应用OLEX2软件解析钯配合物C3晶体结构，如图3所示；
Yield:0.02957g，85.0％，C9H11ClN4SPd：C,29.91；H,3.07；Cl,9.81；N,15.50；S,8.87；Sn,32.84.Found：C,29.92；H,3.06；Cl,9.83；N,15.48；S,8.87；Sn,32.84.IR,cm-1:3445(s,amide),2922(m,aromatic hydrogen),1509(s),1381(s),1314(s,aromatic),1248(m,C＝N),1124(s,thioamide),910(m,C-H),772(m,C＝S),597(m)。
实施例4：
C4钯配合物的合成，具体合成方法为：
(1)将3mmol的4-苯基氨基硫脲溶于25ml无水甲醇，再加入2-吡啶甲醛3mmol，65℃冷凝回流4h，过滤，滤液室温挥发，有透明无色晶体析出，用10ml无水甲醇洗涤2-3次得到配体L4(0.6384g，83.1％，透明白色晶体)；
Yield:0.6384g，83.1％，C13H12N4S：C,60.91；H,4.72；N,21.86；S,12.51.Found：C,60.93；H,4.79；N,21.76；S,12.59.IR,cm
(2)称取0.1mmol配体L4和0.1mmol PdCl2于一个50ml的烧瓶中，加入20ml无水甲醇溶解，再80℃冷凝回流4h，趁热过滤，滤液室温静置，缓慢挥发，有黄色固体析出，无水乙醇重结晶，得到钯配合物C4(0.03231g,81.6％，黄色晶体)，其晶体结构和数据保存至剑桥晶体数据中心(CCDC数据库)申请号：No.2019125；利用单晶衍射仪获取衍射数据，应用OLEX2软件解析钯配合物C4晶体结构，如图4所示；
Yield：0.03231g，81.6％，C13H11ClN4SPd：C,38.13；H,2.71；Cl,8.66；Sn,28.99；N,13.68；S,7.83.Found：C,38.12；H,2.72；Cl,8.69；Sn,28.99；N,13.65；S,7.83.IR,cm-1:3447(s,amide),3317(s,NH),3261(m,aromatic hydrogen),1600(s),1536(s),1487(s,aromatic),1317(m,C＝N),1122(s,thioamide),895(m,C-H),755(m,C＝S),692(m)。
实施例5：
C5钯配合物的合成，具体合成方法为：
将1mmol的氨基硫脲溶于25ml无水CH3OH，再加入1mmol的2-吡啶甲醛和1mmol的PdCl2于烧瓶中，80℃冷凝回流4h，趁热过滤，滤液室温挥发，有透明黄色晶体析出，得到钯配合物C5(0.0261g,78.4％，黄色晶体)，其晶体结构和数据保存至剑桥晶体数据中心(CCDC数据库)申请号：No.2019135；利用单晶衍射仪获取衍射数据，应用OLEX 2软件解析钯配合物C5晶体结构，如图5所示；
Yield:0.03261g，78.4％，C14H19Cl1N4PdS：C,40.30；H,4.59；Cl,8.50；N,13.43；Pd,25.50；S,7.68.Found：C,40.11；H,4.77；Cl,8.12；N,13.73；Pd,25.42；S,7.76.IR,cm-1:3436(s,amide),2928(m,aromatic hydrogen),1635(s),1540(s),1486(s,aromatic),1387(m,C＝N),1128(s,thioamide),897(m,C-H),760(m,C＝S),696(m)。
实施例1-5的钯配合物合成皆可取相应配体和PdCl2于密封的玻璃瓶中，按1:1滴加丙酮和无水CH3OH溶解，真空密封，于80℃干燥箱中静置，得到钯配合物。
为说明本发明以2-吡啶甲醛缩氨基硫脲为配体的钯配合物，申请人对上述实施例1-5制得的钯配合物C1-C5进行了体外肿瘤细胞增殖抑制活性实验：
1、实验方法和材料
(1)细胞株与细胞培养
本实验选用了人乳腺癌癌细胞株(MCF-7)，人宫颈癌细胞株(Hela)，人正常乳腺肝细胞(HBL-100)进行了活性探究。所有细胞株均培养在含10％小牛血清、100U/mL链霉素的DMEM培养液内，置37℃含体积浓度5％CO2孵箱中培养。
(2)待测化合物的配制
所用的受试药物的纯度≥95％，将其DMSO储液用生理缓冲液稀释后配置成5mmol/L的终溶液，其中助溶剂DMSO的浓度≤1％，测试该浓度下化合物对各种肿瘤细胞生长得抑制程度。
(3)细胞生长抑制实验(MTT法)
(I)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配置成浓度为5000个/mL的细胞悬液，以每孔180μL接种于96孔培养板中，使待测细胞浓度至每孔1000～10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)；
(II)5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物20μL，每个浓度梯度设5个复孔；
(III)5％CO2，37℃孵育48h，至倒置显微镜下观察；
(IV)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，继续培养4h-6h；
(V)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入100μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；
(VI)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。利用公式：
肿瘤细胞生长抑制率(％)＝[(1-实验组平均OD值)/(对照组平均OD值)]×％；
IC50测定：利用以上方法，每种化合物须设置浓度梯度，其中含多个(一般5～8个)浓度，每个浓度也须设置3～5个副孔，实验得到每个不同浓度的抑制率，然后在SPSS软件中计算化合物的IC50值，结果见表1。
表1：钯配合物C1-C5对不同细胞株的IC50值(μM)，数值越低表明化合物抑制活性越好。
2、验证钯配合物C3对FTO酶活性的抑制作用
选用15-mer ssRNA(5'-CUUGUCA(m6A)CAGCAGA-3)为底物进行研究。具体实验过程如下:配制50μL反应体系,包括50mM Tris-HCI(pH 7.5),2.0μM ssRNA,2.0nM FTO,1.0mMαKG,280μM(NH)2Fe(SO4)2,2mM L-ascorbic acid,化合物C3(0.2μM,0.8μM,2.0μM,4.0μM,10.0μM,20.0μM和100.0μM)及H20,离心,室温下孵化0.5h,然后95℃下反应5min,使FTO蛋白失活。离心,向反应体系中加入核酸酶P1(1Unit)和醋酸铵(100μM,5μL),42℃下反应4h,使ssRNA裂解。离心,体系中加入碳酸氢铵(1.0M,5μL)和碱性磷酸酶CIP(0.5Unit),37℃下反应3h,进行去磷酸化。离心,利用Thermo TSQ Quantum Ultra LC/MS进行检测(色谱柱为WatersXTerra@MS C18 3.5μM 2.1x100 mm,进样量为10μL,流速为180μL/min)。并通过与纯核苷酸的标准曲线对比进行定量分析，结果如图6所示，配合物C3对FTO的ssRNA去甲基化抑制作用的IC50值为4.52μM，并呈现出剂量依赖关系，表明钯配合物C1-C5是一种竞争或变构性FTO小分子抑制剂。
一种FTO小分子抑制剂钯配合物及其合成方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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