专利摘要

本发明公开了一种人血清白蛋白‑人参皂苷‑紫杉醇纳米粒及其制备和应用，制备以人血清白蛋白、人参皂苷、紫杉醇为原料，人血清白蛋白与紫杉醇、人参皂苷的摩尔比为8~12:1:1。本发明的另外一个目的是：将制备的人血清白蛋白‑人参皂苷‑紫杉醇纳米粒作为药物用于肿瘤的治疗。本发明制备方法简单易行，制备的纳米粒的粒径是80~120nm，粒径较小，且均一，适宜大规模生产。

权利要求

1.一种人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒的制备方法，其特征在于：以人血清白蛋白、人参皂苷、紫杉醇为原料，人血清白蛋白与紫杉醇、人参皂苷的摩尔比为8~12: 1: 1，制备方法包括以下步骤：

（1）制备紫杉醇乙醇溶液，浓度为1~5 mg/mL；

（2）制备人血清白蛋白水溶液，浓度为10~50 mg/mL；

（3）向人血清白蛋白水溶液中加入人参皂苷，并搅拌均匀；

（4） 用NaOH溶液调节人血清白蛋白-人参皂苷水溶液的pH至8.0~ 8.5，并在常温下搅拌20~ 30 min；

（5） 用微量蠕动泵以1~ 2 mL/min的速度向人血清白蛋白-人参皂苷水溶液中滴加步骤（1）中制备的紫杉醇乙醇溶液，并不断搅拌，直至滴加完全；

（6） 滴加完成1 min后，加入戊二醛的乙醇溶液固定，继续搅拌5~ 12 h；

（7）高速离心除去上清，将沉淀用去离子水溶解后超声，过滤膜，透析或超滤除去残余的戊二醛；

（8）低温预冻后，放入干燥机中真空冷冻干燥，即可得到人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒冻干粉；

步骤（5）中所述人血清白蛋白-人参皂苷水溶液与紫杉醇乙醇溶液的体积比为1: 6~8；

步骤（6）中所加入的戊二醛乙醇溶液的量为10~ 25 μL 8%戊二醛乙醇溶液；

步骤（7）中所述离心机的转速为10000~ 15000 rpm，超声时间为10~ 15 min，滤膜孔径为0.22 μm；

步骤（8）中所述低温预冻2 h后，放入干燥机中真空冷冻干燥48 h。

2.用权利要求1所述的制备方法制备的人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒，其特征在于：人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒的粒径是80~120 nm，人血清白蛋白纳米粒对紫杉醇的包封率是70~85%，对人参皂苷的包封率是70~95%，人血清白蛋白纳米粒的载药量是16~20%。

说明书

技术领域

本发明涉及纳米药物技术领域，具体涉及一种人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

紫杉醇（PTX）是一种广谱抗癌药，对多种恶性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部肿瘤等都显示出较肯定的临床疗效。但紫杉醇水溶性极差，目前临床使用的紫杉醇都是使用聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇作为助溶剂。而聚氧乙烯蓖麻油容易造成严重过敏反应和神经血液毒性，从而使紫杉醇的使用剂量受到限制。

人参皂苷是一类固醇类化合物，主要存在于人参、三七等人参属植物中。由于其具有增强免疫、降低血糖以及抗肿瘤等多种重要的药理活性，目前已有很多提取、分离及纯化人参皂苷单体的方法应用于生产实践之中。人参皂苷Rh2（Ginsenoside Rh2）具有较好的抑制癌细胞增殖作用的能力。此外，人参皂苷Rg3、Rg5、Rk1、Rk2、Rk3、Rh1、Rh3、Rh4、aPPT、aPPD等稀有人参皂苷同样具有一定的抗癌活性。

由于癌症的复杂性，单一药物治疗很容易产生耐药性，不足以使肿瘤消退。因此，近年来，联合化疗的案例已经被应用于癌症治疗领域，但仍然存在体内靶向性低、生物利用度差、毒副作用大等诸多问题。

人血清白蛋白（HSA）是人体血浆中含量最丰富的蛋白，具有无毒、优良的生物相容性和生物可降解性等诸多优点，也是目前最有前途的药物载体之一。白蛋白可以通过gp60和小窝介导的跨细胞转运和肿瘤内蓄积，以及和肿瘤SPARC蛋白之间的相互作用来达到药物的肿瘤靶向和渗透。

基于以上因素考虑，我们合成了基于人血清白蛋白的人参皂苷和紫杉醇联合的纳米载药体系，来解决目前抗癌药物的疗效差、毒性大、生物利用度低等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种相比目前单一药物具有更优良抗肿瘤活性和更低毒副作用的人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒及其制备方法和应用。

实现本发明目的的技术方案是：

一种人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒的制备方法，以人血清白蛋白、人参皂苷、紫杉醇为原料，人血清白蛋白与紫杉醇、人参皂苷的摩尔比为8~12: 1: 1，具体制备方法包括以下步骤：

（1）制备紫杉醇乙醇溶液，浓度为1~5 mg/mL；

（2）制备人血清白蛋白水溶液，浓度为10~50 mg/mL；

（3）向人血清白蛋白水溶液中加入人参皂苷，并搅拌均匀；

（4） 调节人血清白蛋白-人参皂苷水溶液的pH至8.0~ 8.5，并在常温下搅拌20~ 30 min；

（5） 以1~ 2 mL/min的速度向人血清白蛋白-人参皂苷水溶液中滴加步骤（1）中制备的紫杉醇乙醇溶液，并不断搅拌，直至滴加完全；

（6） 滴加完成1 min后，加入戊二醛的乙醇溶液进行固定，继续搅拌5~ 12 h；

（7）用高速离心机除去上清液，将沉淀用去离子水溶解后超声，过滤膜，透析或超滤除去残余的戊二醛；

（8）低温预冻2 h后，放入干燥机中真空冷冻干燥48 h，即可得到人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒冻干粉。

制备方法，步骤（5）中所述人血清白蛋白-人参皂苷水溶液与紫杉醇乙醇溶液的体积比为1: 6~ 8。

步骤（6）中所加入的戊二醛乙醇溶液的量为10~ 25 μL 8%戊二醛乙醇溶液。

步骤（7）中所述离心机的转速为10000~ 15000 rpm，超声时间为10~ 15 min，滤膜孔径为0.22 μm。

本发明制备方法采用人血清白蛋白包裹两种原料，分别为紫杉醇和人参皂苷。人血清白蛋白纳米粒对紫杉醇的包封率是70~85 %，对人参皂苷的包封率是70~95%，人血清白蛋白纳米粒的载药量是16~20%。人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒的粒径是80~120 nm。

本发明的另外一个目的是：将制备的人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒作为药物用于肿瘤的治疗。

相比于现有技术，采用本发明方法制备的人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒具有以下优势：

1)人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒相比于单独药物对癌细胞具有更高的活性；

2) 人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒相比于单独药物对正常细胞具有更低的毒性；

3) 人血清白蛋白纳米粒同时包封两种抗癌药物，且具有较高的载药量；

4) 人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒能有效促进紫杉醇和人参皂苷在水中的溶解性；

5) 人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒的制备方法简单易行，合成的纳米粒粒径较小，且均一，适宜大规模生产。

附图说明

图1为实施例1制备的人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒的扫描电镜照片；

图2为实施例1制备的人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒粒径分布图。

具体实施例

下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。

实施例1

制备人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒：

称取2.5 mg紫杉醇粉末，并加入8 mL乙醇，超声使其完全溶解，配置成紫杉醇乙醇溶液；

称取20 mg的人血清白蛋白粉末，加1 mL去离子水溶解，加入2 mg人参皂苷Rh2，用0.5 M NaOH溶液调节pH至8.2，常温下搅拌30 min；

用微量蠕动泵以1 mL/min的速度向上述溶液中滴加紫杉醇乙醇溶液，并不断搅拌；

滴加完成1 min后，加入25微升8%的戊二醛固定，继续搅拌12 h，让人血清白蛋白充分包载紫杉醇和人参皂苷Rh2；

12 h后，将混合溶液在14000 rpm下离心，去掉上清，将沉淀用去10 mL去离子水溶解，然后超声10 min，用0.22 μm滤膜过滤，透析或超滤法除去溶液中残余的戊二醛；

将纳米粒水溶液放入低温冰箱中预冻2 h，再放入干燥机中真空冷冻干燥48 h，即得到人血清白蛋白-人参皂苷Rh2-紫杉醇纳米粒冻干粉。

最后，整合所有清液，检测其中的药物浓度，并计算载药量和包封率：

载药量(%) = (药物总量－药物上清)/制剂总量×100%

包封率(%) = (药物总量－药物上清)/药物总量×100%

最终得到人血清白蛋白纳米粒对紫杉醇的包封率是82 %，人血清白蛋白纳米粒对人参皂苷Rh2的包封率是93 %，人血清白蛋白纳米粒的载药量是19.5 %。人血清白蛋白-人参皂苷Rh2-紫杉醇纳米粒的粒径是85~120 nm，如图1-2所示。

实施例2

制备人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒：

称取5 mg紫杉醇粉末，并加入14 mL乙醇，超声使其完全溶解，配置成紫杉醇乙醇溶液；

称取40 mg的人血清白蛋白粉末，加2 mL去离子水溶解，加入4 mg人参皂苷Rg3，用0.5 M NaOH溶液调节pH至8.5，常温下搅拌20 min；

用微量蠕动泵以1.2 mL/min的速度向上述溶液中滴加紫杉醇乙醇溶液，并不断搅拌；

滴加完成1 min后，加入15微升8%的戊二醛固定，继续搅拌8 h，让人血清白蛋白充分包载紫杉醇和人参皂苷Rg3；

8 h后，将混合溶液在12000 rpm下离心，去掉上清，将沉淀用去15 mL去离子水溶解，然后超声15 min，用0.22 μm滤膜过滤，透析或超滤法除去溶液中残余的戊二醛；

将纳米粒水溶液放入低温冰箱中预冻2 h，再放入干燥机中真空冷冻干燥48 h，即可得到人血清白蛋白-人参皂苷Rh2-紫杉醇纳米粒冻干粉。

最后，整合所有清液，检测其中的药物浓度，并计算载药量和包封率，得到人血清白蛋白纳米粒对紫杉醇的包封率是85 %，人血清白蛋白纳米粒对人参皂苷Rg3的包封率是88 %，人血清白蛋白纳米粒的载药量是19.4 %。人血清白蛋白-人参皂苷Rg3-紫杉醇纳米粒的粒径是85~120 nm。

以紫杉醇药物浓度为基准，用MTT法测试了人血清白蛋白-人参皂苷Rg3-紫杉醇纳米粒的体外抗肿瘤活性：Rg3、Rg5、Rk1、Rk2、Rk3、Rh1、Rh3、Rh4、aPPT、aPPD对人肝癌细胞（BEL-7402）、人宫颈癌细胞（Hela）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人正常肝细胞（QSG-7701）进行了增殖抑制活性实验，结果如下：

体外实验结果表明，对于这3株癌细胞，单独人参皂苷的活性没有紫杉醇的活性好，两种药物联合的抗癌活性明显好于单独药物，制成人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒，活性更有明显提高，相对于紫杉醇来说普遍提高了两倍以上。对于正常细胞，两种药物联合的毒性也明显增加了，而人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒的毒性相比未结合人血清白蛋白的药物降低了近两倍。

人血清白蛋白-人参皂苷-紫杉醇纳米粒及其制备和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。