专利摘要

本发明公开了一种用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备酶固定化载体的方法，包括如下步骤（1）竹片的预处理；（2）竹片的修饰：先用N-甲基氧化吗啉水溶液处理竹片，再加入修饰剂搅拌均匀，保温处理得纤维素混合溶液；（3）载体干燥成型。本发明的优点为：1、利用N-甲基氧化吗啉处理竹片得到的纤维素材料来制备酶固定化载体，处理过程绿色环保、无污染、操作条件温和、处理工艺简易可行，且处理后的N-甲基氧化吗啉可以完全回收，可大大降低载体的生产成本；2、通过本发明方法制备得到的固定化酶载体上的酶吸附率高、稳定性高，提高了酶的催化活性。3、本发明方法制备的酶固定化载体可以重复使用多次，仍能保持较高的酶活性。

权利要求

1.一种用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备酶固定化载体的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）竹片的预处理：除去竹片上的杂质、干燥并剪切成段；

（2）竹片的修饰：先用N-甲基氧化吗啉水溶液处理竹片，再加入修饰剂搅拌均匀，保温处理得纤维素载体溶液；

（3）载体干燥成型：向纤维素载体溶液中加入溶剂，搅拌均匀洗涤除去杂质，然后干燥、真空脱气制成纤维素酶固定化载体。

2.根据权利要求1所述的用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备酶固定化载体的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述N-甲基氧化吗啉水溶液的质量浓度为20～60%，所述修饰剂的终浓度为0.1-0.2M。

3.根据权利要求1所述的用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备酶固定化载体的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述修饰剂为聚乙二醇、对氨基苯甲酸或者溴代丁乙酰亚胺。

4.根据权利要求1所述的用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备酶固定化载体的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述保温温度为50～90℃，保温时间为10～50h。

5.根据权利要求1所述的用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备酶固定化载体的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述溶剂为水或短链醇。

6.根据权利要求5所述的用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备酶固定化载体的方法，其特征在于：所述短链醇为乙醇或丙醇。

7.根据权利要求5所述的用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备酶固定化载体的方法，其特征在于：加入的水或短链醇与纤维素混合溶液的体积比为1～5：1。

8.根据权利要求1所述的用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备酶固定化载体的方法，其特征在于：步骤（1）中，切成的每段竹片长0.4～0.6cm。

9.根据权利要求1所述的用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备酶固定化载体的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述载体干燥温度为50～60℃。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶固定化载体的制备方法，尤其涉及一种用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备酶固定化载体的方法，属于生物化工领域。

背景技术

固定化酶是酶工程中的一种常见技术，在该技术中，酶被吸附到一种惰性的低水溶性的载体上，可以轻易地与反应物或产物中分离，从而使酶被集中或限制在一定的空间范围内进行酶解反应。固定化酶与游离酶相比，具有稳定性高、酶可反复使用、产物纯度高、生产连续自动化、生产设备小型化等诸多优点。酶固定化的载体材料有很多种，总体来说可分为有机载体和无机载体，其中，有机载体材料中的天然高分子(纤维素、琼脂糖和葡聚糖等多糖及其衍生物)和合成高分子聚合物(尼龙、合成纤维和聚丙烯类高分子聚合物)是固定化酶的常用载体，这些载体需要满足很多要求，例如多孔或松散的网络结构、适当的亲水性、能耐化学或微生物侵蚀等作用，还要求易于进行物理或化学方法衍生，以提供合适的反应基团，另外，工业化生产的载体材料还要具有一定的强度，经得起搅拌和压缩等。酶的固定化方法分为固体吸附法、包埋法、交联法和共价结合法等。但是现有的用于制备酶固定化载体的成本较高、制作工艺较为复杂，同时吸附在载体上的酶容易脱落，由此导致固定化酶稳定性和活性不高，同时酶固定化载体很少能够重复利用，因此存在载体材料的后处理及废载体的闲置问题。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备高酶负载量、高酶活性、可重复利用且廉价环保的酶固定化载体的方法。

技术方案：本发明所述的用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备酶固定化载体的方法，包括如下步骤：

（1）竹片的预处理：除去竹片的杂质、干燥并剪切成段；

（2）竹片的修饰：先用N-甲基氧化吗啉水溶液处理竹片，再加入修饰剂搅拌均匀，保温处理得纤维素载体溶液；

（3）载体干燥成型：向纤维素载体溶液中加入溶剂，搅拌均匀洗涤除去杂质，然后干燥、真空脱气制成纤维素酶固定化载体。

步骤（2）中，所述N-甲基氧化吗啉水溶液的浓度为20～60%，所述修饰剂的终浓度为0.1-0.2M（mol/L）。修饰剂可以为聚乙二醇、对氨基苯甲酸或者溴代丁乙酰亚胺等。另外，加入的N-甲基氧化吗啉与修饰剂没有固定的比值范围，加入足量的N-甲基氧化吗啉用于溶解结晶度低的纤维，加入的修饰剂浓度的高与低、量的多与少均可以，只要能够结合在纤维表面即可。所述保温温度为50～90℃，保温时间为10～50h。

步骤（3）中，所述溶剂为水或短链醇，其中，短链醇为乙醇或丙醇，要满足加入的水与纤维素混合溶液的体积比为1～5：1，加入的短链醇与纤维素混合溶液的体积比为1～5：1。载体干燥温度为50～60℃

步骤（1）中，切成的每段竹片长0.4～0.6cm。

反应机理：N-甲基氧化吗啉处理可以将竹片纤维素材料中结晶度低的纤维溶解、破坏，剩余竹纤维都是结晶度高、强度大的类似纳米纤维素的刚性纤维，结晶度低的纤维溶出之后，竹片表面和内部形成多孔的结构，为酶的固定化提供很多的位点。聚乙二醇、对氨基苯甲酸或者溴代丁乙酰亚胺等修饰剂可以结合在多孔的纤维表面，且这些修饰剂可以与酶表面的基团结合从而实现酶的固定化。

有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点为：1、N-甲基氧化吗啉为无色液体，毒性很低可与乙醇毒性相当，且容易制备获得，利用N-甲基氧化吗啉处理竹片得到的纤维素材料来制备酶固定化载体，处理过程绿色环保、无污染、操作条件温和、处理工艺简易可行，且处理后的N-甲基氧化吗啉可以完全回收，可大大降低载体的生产成本。2、通过本发明方法制备得到的固定化酶载体上的酶吸附率高、稳定性高，提高了酶的催化活性。3、本发明方法制备的酶固定化载体可以重复使用多次，仍能保持较高的酶活性。

附图说明

图1为本发明方法制备的酶固定化载体的扫描电镜图。

具体实施方式：

下面对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1、按如下步骤进行：

（1）对竹片进行预处理：取毛竹竹片，将竹片除去污泥尘土等杂质，取茎节部位，干燥，并用竹片机械裁剪成0.5cm左右的小段（每小段长0.4～0.6cm）。

（2）修饰竹片：先用50g（体积约50ml）质量浓度为20%的N-甲基氧化吗啉水溶液保温处理竹片，温度为50℃，保温时间为15min；再加入20g聚乙二醇4000搅拌均匀，使其终浓度为0.1M，保温温度控制在50℃，处理时间为50h，洗涤除去N-甲基氧化吗啉等物质，得到纤维素载体溶液。该过程是对竹片的表面和内部结构进行修饰，使竹片内部结构发生变化，表面积增大，酶的吸附位点增加。

（3）载体干燥成型：向纤维素载体溶液中加入纤维素混合液5倍体积的水，洗涤除去杂质，然后60℃干燥、真空干燥箱真空脱气制成纤维素酶固定化载体。

该载体的扫描电镜图如图1所示，竹片中结晶度低的纤维（NMMO处理容易脱落和溶出）经过处理除去，通过上述处理方法得到的载体为多孔结构，为酶提供较多的吸附位点。

其中，N-甲基氧化吗啉的具体制法为：以吗啉、甲醛和甲酸为原料，加热回流，生成粗制，然后加入氢氧化钠，静置分层后取出上层有机相，蒸馏精制即可。

实施例2：步骤与实施例1基本相同，不同点为：1、60g（体积约60ml）N-甲基氧化吗啉水溶液浓度为40%；2、加入的修饰剂为0.82g对氨基苯甲酸，使其终浓度为0.2M，且加入对氨基苯甲酸后保温温度为90℃，处理时间为10h；3、加入的溶剂为乙醇，与纤维素混合液等体积；4、载体的干燥温度为50℃。

实施例3：步骤与实施例1基本相同，不同点为：1、100g（体积约100ml）质量浓度为60%N-甲基氧化吗啉水溶液；2、加入的修饰剂为0.178g溴代丁乙酰亚胺，使其终浓度为0.15M，且加入溴代丁乙酰亚胺后保温温度为70℃，处理时间为30h；3、加入的溶剂为丙醇，其体积为纤维素混合液的3倍；4、载体的干燥温度为55℃。

实施例4：取20ml的50mM，pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，加入1mg果胶酶，加入1g实施例1制备得到的载体，在30℃水浴摇床中反应24h，过滤获得固定化酶，用醋酸-醋酸钠缓冲液洗涤直至检测不到蛋白为止。采用考马斯亮蓝法检测果胶酶的吸附率，测得其吸附率为1700mg/g；同时采用DNS法、以半乳糖醛酸作为标准品检测果胶酶的活性，测得该固定化酶的表观活性为900IU/g；载体重复使用10次后，载体固定化酶活性为80%左右。

实施例5：用实施例2制备的固定化酶载体重复实施例4，检测到果胶酶的吸附率为1600mg/g，酶表观活性为1200IU/g，载体重复10次使用后，固定化酶的活性为85%左右。

实施例6：采用实施例3制备的固定化酶载体，重复实施例4，检测到酶的吸附率为1500mg/g，酶表观活性为1800IU/g，载体重复10次使用后，固定化酶的活性为90%左右。

一种用N-甲基氧化吗啉处理后的竹片类纤维素制备酶固定化载体的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。