专利摘要

本发明公开了一种桑椹生物碱的选择性提取方法，包括如下步骤：（1）将桑椹洗净，沥干水分，粉碎；（2）制备浸提剂；（3）向桑椹粉中加入浸提剂，50～80℃磁力搅拌，过滤，加入乙醇水溶液；（4）双相浸提：加入硫酸铵，剧烈搅拌，静置分层，取颜色较深的生物碱层；（5）透析除去杂质，调节样品pH为弱碱性，放入到旋转蒸发器中，减压蒸馏，将提取液蒸发回收，蒸发器中产品在真空条件下干燥，得到桑椹生物碱。本发明具有生物碱的提取选择性高、提取的同时具有纯化的作用，提取时间短、有效成分的提取得率高以及不需要特殊的分离步骤等传统提取工艺不可比拟的优点。

权利要求

1.一种桑椹生物碱的选择性提取方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将桑椹洗净，阴干或者冷冻干燥控制水分含量≤8%，粉碎得到桑椹粉；

（2）浸提剂的制备：取纤维素粉，过100～200目筛子放入坩埚，置于管式炉中，氮气保护400～500℃加热处理1～5h，获得黑灰色固体，然后加入黑灰色固体质量1.5-2倍的发烟硫酸，80℃加热处理2h以上，用蒸馏水洗涤除去杂质，采用滤纸过滤除去固体，根据所需浸提的桑葚质量，按照乙醇水溶液体积:桑葚质量=2-10ml:1g比例加入乙醇水溶液，得到浸提剂；

（3）浸提：向步骤（1）所得的桑椹粉中加入步骤（2）制得的浸提剂，所述桑椹粉与浸提剂的比例为1g:2-10ml，50～80℃磁力搅拌1-6h得到混合液，然后对混合液进行两次过滤，第一次过滤采用孔径为0.5cm的筛网，第二次过滤采用滤纸或者孔径为0.45μm的滤膜，获得滤液；

（4）双相浸提：在步骤（3）所得滤液中加入硫酸铵，所述硫酸铵与滤液的比例为16-30g:100ml，磁力搅拌1-4h，静置待分层，取颜色较深的生物碱层，透析除去杂质，得到生物碱样品；

（5）调节生物碱样品的pH为8-9，用0.2μm滤膜过滤，滤液加入到旋转蒸发器中，60-80℃减压蒸馏，将提取液蒸发回收，蒸发器中产品在真空条件下-20～-40℃干燥，得到桑椹生物碱。

2.根据权利要求1所述的一种桑椹生物碱的选择性提取方法，其特征在于：步骤（2）所述纤维素为微晶纤维素。

3.根据权利要求1所述的一种桑椹生物碱的选择性提取方法，其特征在于：步骤（2）中所述发烟硫酸中三氧化硫的质量分数为15～20%。

4.根据权利要求1所述的一种桑椹生物碱的选择性提取方法，其特征在于：步骤（2）中所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为50～80%。

5.根据权利要求1所述的一种桑椹生物碱的选择性提取方法，其特征在于：步骤（2）和（3）所述滤纸均为中速双圈定性滤纸。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物碱的提取方法，具体涉及一种桑椹生物碱的选择性提取方法，属于生物化工领域。

背景技术

生物碱是存在于自然界（主要为植物，但有的也存在于动物）中的一类含氮的碱性有机化合物，有似碱的性质，所以过去又称为赝碱。大多数有复杂的环状结构，氮素多包含在环内，有显著的生物活性，是中草药中重要的有效成分之一。具有光学活性。有些不含碱性而来源于植物的含氮有机化合物，有明显的生物活性，故仍包括在生物碱的范围内。按照生物碱的基本结构，已可分为60类左右。下面介绍一些主要类型：有机胺类(麻黄碱、益母草碱、秋水仙碱)、吡咯烷类(古豆碱、千里光碱、野百合碱)、吡啶类(菸碱、槟榔碱、半边莲碱)、异喹啉类(小檗碱、吗啡、粉防己碱)、吲哚类(利血平、长春新碱、麦角新碱)、莨菪烷类(阿托品、东莨菪碱)、咪唑类(毛果芸香碱)、喹唑酮类(常山碱)、嘌呤类(咖啡碱、茶碱)、甾体类(茄碱、浙贝母碱、澳洲茄碱)、二萜类(乌头碱、飞燕草碱)、其它类(加兰他敏、雷公藤碱)。

桑树在我国的栽培历史悠久，桑树种类、品种和种植面积位居世界首位。桑椹是桑树的成熟果实，桑椹又叫桑果、桑泡儿，农人喜欢其成熟的鲜果食用，味甜汁多，是人们常食的水果之一。桑椹中的氮糖类化合物呈现弱碱性，这些生物碱类均具有良好的降血糖、降血压等活性作用。1-脱氧野尻霉素(DNJ)是一种典型的桑生物碱，化学名称为3,4,5-三羟基-2羟甲基四氢吡啶，是桑叶中特有的天然活性成分，具有高效的药理活性，可用于治疗糖尿病、肥胖症、病毒感染等功能。

中国专利“从桑椹中分离制备花色苷单体的方法，授权号CN100439384C”公开了采用酸化乙醇浸提桑椹中的花色苷。由于使用酸和乙醇作为提取剂，引入了杂质酸，虽然能实现提取生物碱的功能，但是不能选择性提取，也不能在提取过程中进行纯化，反而引入了酸为杂质。中国专利“一种桑椹抗氧化多糖及其制备方法，申请号2014104733656”采用水提和碱提相结合的方式进行提取，即先采用水提，得到部分多糖提取液，再对滤渣进行碱提，对于生物碱的提取效率较低，不能选择性提取，也不能在提取过程中进行纯化，反而引入了碱为杂质。因此，目前已有的提取方法不能实现选择性提取和纯化功能。

发明内容

解决的技术问题：针对现有技术不能选择性高效提取桑椹生物碱、提取过程中引入杂质的不足，本发明提供了一种桑椹生物碱的选择性提取方法，结合纤维素基盐和双水相，建立了双相提取纯化的方法，提取的同时使生物碱得到纯化。

技术方案：本发明提供的一种桑椹生物碱的选择性提取方法，包括如下步骤：

（1）将桑椹洗净，阴干或者冷冻干燥控制水分含量≤8%，粉碎得到桑椹粉；

（2）浸提剂的制备：取纤维素粉，过100～200目筛子放入坩埚，置于管式炉中，氮气保护400～500℃加热处理1～5h，获得黑灰色固体，然后加入黑灰色固体质量1.5-2倍的发烟硫酸，80℃加热处理2h以上，用蒸馏水洗涤除去杂质，采用滤纸过滤除去固体，根据所需浸提的桑葚质量，按照乙醇水溶液体积:桑葚质量=2-10ml:1g(v/w)的比例加入乙醇水溶液，得到浸提剂；

（3）浸提：向步骤（1）所得的桑椹粉中加入步骤（2）制得的浸提剂，所述桑椹粉与浸提剂的比例为1g:2-10ml(w/v)，50～80℃磁力搅拌1-6h得到混合液，然后对混合液进行两次过滤，第一次过滤采用孔径为0.5cm的筛网，第二次过滤采用滤纸或者孔径为0.45μm的滤膜，获得滤液；

（4）双相浸提：在步骤（3）所得滤液中加入硫酸铵，所述硫酸铵与滤液的比例为16-30g:100ml(w/v)，磁力搅拌1-4h，静置待分层，取颜色较深的生物碱层，透析除去杂质，得到生物碱样品；

（5）调节生物碱样品的pH为8-9，用0.2μm滤膜过滤，滤液加入到旋转蒸发器中，60-80℃减压蒸馏，将提取液蒸发回收，蒸发器中产品在真空条件下-20～-40℃干燥，得到桑椹生物碱。

步骤（2）所述纤维素为微晶纤维素；所述发烟硫酸中三氧化硫的质量分数为15～20%。

步骤（2）中所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为50～80%；步骤（2）和（3）所述滤纸均为中速双圈定性滤纸。

附图说明

图1为本发明工艺流程图；

图2为实施例1、2中获得的乙醇/硫酸铵双水相相图；

图3为实施例2中获得的双相提取系统图，其中A-上层水相、B-活性物质相。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不因此局限于下述实施例，而是由本发明的说明书和权利要求书限定。

实施例1

（1）取微晶纤维素，过100目筛子；

（2）取100g微晶纤维素，加入5g氯化锌；

（3）获得的样品放入坩埚里，置于管式炉中，氮气保护500℃加热处理3h，500ml蒸馏水洗涤3次；

（4）取步骤（3）获得的样品，加入20%三氧化硫的发烟硫酸，80℃加热搅拌处理2h，过滤除去酸（硫酸可以重复使用），加入砂芯漏斗，蒸馏水洗涤直至检测不到硫酸根，过滤，加入80%的乙醇50ml。

双相提取相图的考察

根据浊度法绘制乙醇/硫酸铵相图，硫酸铵浓度范围为16%-30%。，然后将乙醇滴加到反应器中，每滴一滴均混合5分钟，当添加一滴乙醇使得混合物变浑浊时，表明第二相的存在，再滴加一滴乙醇，发现浑浊变澄清。则开始浑浊的时候的点即为浊点，记录浊点时的水总量，硫酸铵以及乙醇的含量，并按以下方程计算和绘制相图曲线。

(公式1)

(公式2)

W₁和W₂代表乙醇和硫酸铵的质量分数。m₁、m₂和m₃分别代表乙醇，硫酸铵和水的添加量。

（5）将20g桑椹洗净，沥干水分，粉碎得到桑椹粉；

（6）向步骤（5）桑椹粉中加入100ml的浸提剂，50℃磁力搅拌2h；

（7）采用两次过滤，第一次过滤采用0.5cm筛网过滤除去较大杂质，第二次过滤采用的是滤纸或者0.45μm滤膜过滤。

（8）加入25g硫酸铵和50ml蒸馏水，磁力搅拌2h，静置分层，用分液漏斗分液，取颜色较深的生物碱层，透析除去杂质；

（9）调节样品pH为8，用0.2微米滤膜过滤，滤液放入到旋转蒸发器中，60℃减压蒸馏，将提取液蒸发回收，蒸发器中产品在真空条件下-40^oC干燥，得到桑椹生物碱干粉。

实施例2

（1）取微晶纤维素，过100目筛子；

（2）取100g微晶纤维素，加入5g氯化锌；

（3）获得的样品放入坩埚里，置于管式炉中，氮气保护500℃加热处理3h，500ml蒸馏水洗涤3次；

（4）取步骤（3）获得的样品，加入20%三氧化硫的发烟硫酸，80℃加热搅拌处理2h，过滤除去酸（硫酸可以重复使用），加入砂芯漏斗，蒸馏水洗涤直至检测不到硫酸根，过滤，加入80%的乙醇50ml。

双相提取相图的考察

根据浊度法绘制乙醇/硫酸铵相图，硫酸铵浓度范围为16%-30%。，然后将乙醇滴加到反应器中，每滴一滴均混合5分钟，当添加一滴乙醇使得混合物变浑浊时，表明第二相的存在，再滴加一滴乙醇，发现浑浊变澄清。则开始浑浊的时候的点即为浊点，记录浊点时的水总量，硫酸铵以及乙醇的含量，并按以下方程计算和绘制相图曲线。

(公式1)

(公式2)

W₁和W₂代表乙醇和硫酸铵的质量分数。m₁、m₂和m₃分别代表乙醇，硫酸铵和水的添加量。

（5）将10g桑椹洗净，沥干水分，粉碎得到桑椹粉；

（6）向步骤（5）桑葚粉中加入50ml的浸提剂，80℃磁力搅拌2h；

（7）采用两次过滤，第一次过滤采用0.5cm筛网过滤除去较大杂质，第二次过滤采用的是滤纸或者0.45μm滤膜过滤。

（8）加入12.5g硫酸铵和25ml蒸馏水，磁力搅拌2h，静置分层，用分液漏斗分液，取颜色较深的生物碱层，透析除去杂质；

（9）调节样品pH为8，用0.2微米滤膜过滤，滤液放入到旋转蒸发器中，60℃减压蒸馏，将提取液蒸发回收，蒸发器中产品在真空条件下-40℃干燥，得到桑椹生物碱干粉。

与目前报道产量较高的盐酸-乙醇法作比较，提取率=DNJ的含量×100%/桑椹质量，结果如表1所示。

盐酸-乙醇法：80%的乙醇25ml，其中盐酸含量为0.05mol/L。

生物碱DNJ的检测：采用高效液相色谱仪（HPLCLC-20A型，岛津公司）测定桑椹中主要的生物碱DNJ的提取量。色谱条件：色谱柱HiQSiLC18分析柱(5μm，250mm×4.6mm)，预柱(5μm，10mm×4.6mm)；流动相：乙腈－0.1%醋酸(55:45，V/V)；流速：1.0ml/min；柱温25℃；荧光检测器激发波长254nm，发射波长322nm；进样量10μl。

表1实施例2与盐酸-乙醇法提取桑椹生物碱DNJ的比较

DNJ提取率=DNJ量′100%/桑葚质量。

一种桑椹生物碱的选择性提取方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。