专利摘要
本发明公开了一种桑蛋白活性肽的制备方法，包括以下步骤：桑叶、桑枝皮经洗涤、干燥、粉碎后加入磁性氧化石墨烯、稀酸和双氧水所组成的处理剂浸提，用磁铁回收磁性氧化石墨烯，调节pH值为4.5‑5.5，离心获得沉淀，沉淀加水溶解过滤，滤液中含桑蛋白溶液，经加热处理，冷却调节pH值为7‑8.5，加入蛋白酶保温，置入超声场中超声波辅助酶解，高温加热使酶灭活，离心，收集上清液，经脱色，抽滤，超滤、透析、离子交换和浓缩获得桑活性肽。本发明采用桑叶桑枝皮为原料制备活性肽，原料为农业废弃物，成本低，对于环境保护和废弃物资源化利用都有着重要意义；本方法提取桑蛋白含量和桑蛋白活性肽转化效率均比常规方法多，理化性能稳定。
权利要求
1.一种桑蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
(1)原料预处理：桑叶和/或桑枝皮洗涤除去杂质，干燥，粉碎获得桑叶粉和/或桑枝皮粉；
(2)处理剂浸提：将桑叶粉和/或桑枝皮粉加入至处理剂中，放入打浆器中均匀打浆，所述处理剂包括磁性氧化石墨烯、稀酸和双氧水；
(3)桑蛋白提取：用磁铁回收磁性氧化石墨烯，调节pH值为4.5-5.5，离心获得沉淀，沉淀加水溶解并过滤，滤液待用；
(4)酶解：取步骤(3)所得滤液加热处理，冷却后调节pH值为7-8.5，加入蛋白酶37℃保温，置入超声场中超声波辅助酶解，高温加热使酶灭活，离心，收集上清液；
(5)脱色：在步骤(4)上清液中加入活性炭，在30℃的水浴锅中保温2-5h且持续搅拌，然后用循环水真空泵抽滤得到水解蛋白质的清液，即多肽溶液；
(6)将步骤(5)制得的多肽溶液先超滤得到小分子肽混合物，随后经透析除去杂质和部分盐，离子交换树脂脱盐、滤纸过滤、浓缩获得桑活性肽。
2.根据权利要求1所述的桑蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中桑叶粉和/或桑枝皮粉与处理剂的质量体积比为1：5-10。
3.根据权利要求1所述的桑蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中磁性氧化石墨烯、稀酸和双氧水的质量比为1:10:5。
4.根据权利要求1所述的桑蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中稀酸为稀盐酸，所述稀盐酸的浓度为0.1-0.5wt％。
5.根据权利要求1所述的桑蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中打浆器中均匀打浆的时间为3-20min。
6.根据权利要求1所述的桑蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中加热处理的温度为95-100℃，加热处理的时间为5-30min。
7.根据权利要求1所述的桑蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中超声酶解的时间为2-5h，高温加热的温度为100℃，高温加热的时间为5min-30min。
8.根据权利要求1所述的桑蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中活性炭的加入量相当于上清液的5-8wt％。
9.根据权利要求1所述的桑蛋白活性肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中超滤采用中空纤维超滤膜进行超滤，所述中空纤维的截留分子量为3000，所述离子交换树脂为阳离子交换树脂，所述浓缩采用冷冻干燥浓缩，所述冷冻干燥温度为-40℃。
说明书
技术领域
本发明属于医药和生物化工领域，具体涉及一种桑蛋白活性肽的制备方法。
背景技术
肽是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，在人体内起重要生理作用，发挥生理功能。具有活性的多肽称为活性肽，又称生物活性肽或生物活性多肽。活性肽是一千多种肽的总称(如大豆肽，海参肽等是活性肽中的一种)。它在人的生长发育，新陈代谢，疾病以及衰老，死亡的过程中起着关键作用。活性肽是人体中最重要的活性物质。正是因为它在体内分泌量的增多或减少，才使人类有了幼年，童年，成年，老年直到死亡的周期。而服用活性肽便打破了生命的这一周期，从而达到延长生命，有效减缓衰老的神奇效果。
目前，它成为全世界研究的热点、大量的国内外研究结果表明：生物活性肽是涉及生物体内多种细胞功能的生物活性物质，在生物体内已发现几百种，不同的生物肽具有不同的结构和生理功能，如抗病毒、抗癌、抗血栓、抗高血压、免疫调节、激素调节、抑菌、降胆固醇等作用。
目前肽类的提取方法主要有两种，一种是化学法提取，一种是物理法提取。二者各有利弊，“化学提取法”主要是“化学酶反应提取法”。其反应快，生产量大，但缺点是提取出来的肽类活性较低，该法是市面上肽类产品的主要来源；“物理提取法”主要指“介质电容法活性肽提取技术”，其特点是反应慢，生产量小，但是生产出来的肽类具有很高的活性。
桑树(拉丁学名：Morus alba L.)，桑科多年生落叶乔木，原产中国。桑树在我国已有4000多年的栽培历史，桑树种类、品种和种植面积位居世界首位，主要集中种植在江苏、浙江、四川等省。桑叶蛋白的含量是我国少数几种叶蛋白含量较高的植物之一。桑枝皮中也存在一定量的蛋白。桑蛋白中氨基酸组成理想，含有18种氨基酸，必需氨基酸的含量占总氨基酸含量的30wt％-40wt％，桑叶蛋白氨基酸比值系数平均分为70.61，营养价值较高；第一限制氨基酸为异亮氨酸。但一直以来，对桑叶的利用十分有限，尤其对桑叶蛋白类产品的开发还鲜见报道，更没有对于桑活性肽的研究。主要原因可能是现有方法提取到的活性肽含量较少。主要是因为桑叶和桑枝皮主要由木质素、纤维素、半纤维素组成，由于纤维素以结晶态存在，加上木质素的缠绕和包裹，不溶于水，在环境中十分稳定，从而形成了桑蛋白提取和利用的强大障碍。因此破坏这种复杂的结构是桑蛋白和桑活性肽制备的关键问题之一。目前，桑活性肽的制备迄今未有报道。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的桑蛋白提取困难和桑蛋白活性肽提取含量较少等问题，本发明提供一种桑蛋白活性肽的制备方法，以有效解决桑蛋白提取和桑蛋白活性肽制备困难的问题，拓展活性肽生产的原料来源，避免多余的桑叶桑枝皮、桑叶焚烧或丢弃造成的环境污染问题并实现较大的社会经济效益。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种桑蛋白活性肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：桑叶和/或桑枝皮洗涤除去杂质，干燥，粉碎获得桑叶粉和/或桑枝皮粉；
(2)处理剂浸提：将桑叶粉和/或桑枝皮粉加入至处理剂中，放入打浆器中均匀打浆，所述处理剂包括磁性氧化石墨烯、稀酸和双氧水；
(3)桑蛋白提取：用磁铁回收磁性氧化石墨烯，调节pH值为4.5-5.5，离心获得沉淀，沉淀加水溶解并过滤，滤液待用；
(4)酶解：取步骤(3)所得滤液加热处理，冷却后调节pH值为7-8.5，加入蛋白酶37℃保温，置入超声场中超声波辅助酶解，高温加热使酶灭活，离心，收集上清液；
(5)脱色：在步骤(4)上清液中加入活性炭，在30℃的水浴锅中保温2-5h且持续搅拌，然后用循环水真空泵抽滤得到水解蛋白质的清液，即多肽溶液；
(6)将步骤(5)制得的多肽溶液先超滤得到小分子肽混合物，随后经透析除去杂质和部分盐，离子交换树脂脱盐、滤纸过滤、浓缩获得桑活性肽。
作为优选，所述步骤(2)中桑叶粉和/或桑枝皮粉与处理剂的质量体积比为1：5-10。
作为优选，所述步骤(2)中磁性氧化石墨烯、稀酸和双氧水的质量比为1:10:5。
作为优选，所述步骤(2)中稀酸为稀盐酸，所述稀盐酸的浓度为0.1-0.5wt％。
作为优选，所述步骤(2)中打浆器中均匀打浆的时间为3-20min。
作为优选，所述步骤(4)中加热处理的温度为95-100℃，加热时间为5-30min。
作为优选，所述步骤(4)中超声酶解的时间为2-5h，高温加热的温度为100℃，高温加热的时间为5min-30min。
作为优选，所述步骤(5)中活性炭的加入量相当于上清液的5-8wt％。
作为优选，所述步骤(6)中超滤采用中空纤维进行超滤，所述中空纤维的截留分子量为3000，所述离子交换树脂为阳离子交换树脂，所述浓缩为在-40℃冷冻干燥浓缩。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明首次利用桑叶、桑皮为原料制备活性肽，利用磁性氧化石墨烯，加入双氧水处理，继而置入超声场中超声波辅助酶解，高效制备桑活性肽。有效解除了主要由木质素、纤维素、半纤维素组成的屏障，解决了桑蛋白提取和桑活性肽制备的困难。
(2)本发明以废弃物为原料，成本低，变废为宝，有利于减少环境污染，实现了桑叶桑枝皮废弃物高值转化。
(3)本发明制备方法效率高，活性肽转化率高，所使用的磁性氧化石墨烯可以完全回收，所制备的活性肽杂质少，纯度高。
附图说明
图1为本发明桑叶、桑枝皮蛋白活性肽的制备工艺流程图；
图2为本发明实施例5绘制的蛋白质标准曲线；
图3为本发明实施例7中不同浓度桑蛋白活性肽和VC对DPPH自由基清除率的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步解释说明。图1是本发明桑叶和桑枝皮蛋白活性肽的制备工艺流程图，原料经洗涤、粉碎干燥后经处理剂浸提，其中处理剂中的磁性氧化石墨烯可回收利用，再用蛋白酶酶解脱色得多肽溶液，再经过一系列透析、过滤、浓缩处理即得到桑蛋白活性肽。
实施例1.处理剂的制备
取铁磁性(Fe3O4)氧化石墨烯1g，0.5wt％的稀盐酸50g和5mL(相当于5g)市售30wt.％的双氧水混合均匀，制备得到处理剂。
实施例2.桑蛋白的制备方法1
取桑树鲜叶或者嫩桑枝，从顶部取8cm左右嫩的新鲜茎叶或者桑枝皮，清洗干净，沥干水分备用。使用时切成0.5～1.0cm的小段，用粉碎机粉碎成小于0.5cm的小块，取5g粉末加入50g上述处理剂，放入打浆器中均匀打浆，用磁铁回收磁性氧化石墨烯，调节pH值为4.5，离心获得沉淀，加50mL水溶解，采用8层纱布过滤，得到桑蛋白液。
实施例3.桑蛋白的制备方法2
取桑树鲜叶或者嫩桑枝，从顶部取8cm左右嫩的新鲜茎叶或者桑枝皮，清洗干净，沥干水分备用。使用时切成0.5～1.0cm的小段，用粉碎机粉碎成小于0.5cm的小块。取1g粉末加入2g处理剂，放入打浆器中均匀打浆，用磁铁回收磁性氧化石墨烯，调节pH值为5.5，离心获得沉淀，加15mL水溶解，采用8层纱布过滤，得到桑蛋白液。
实施例4.桑活性肽的制备
取桑蛋白液，100℃加热处理15min，冷却调节pH值为7.5，加入蛋白酶37℃保温，置入超声场中超声波辅助酶解3h，100℃高温加热10min使酶灭活。以10000r/min的速度离心10min，去下层沉淀，留上层清夜。在上述上层清液中加入相当于其重量5-8wt％的活性碳，在30℃的水浴锅中保温2h且持续搅拌。然后将此液体用循环水真空泵抽滤，得水解蛋白质的清液，即多肽溶液。通过中空纤维超滤膜超滤(截留分子量3000)作用得到分子量小于3000的小分子肽混合物。通过透析袋透析除去杂质和部分盐，通过5cm长的阳离子交换树脂BK001柱子脱盐，滤纸过滤除去树脂等固体杂质，-40℃冷冻干燥使其浓缩到一定浓度获得桑活性肽溶液。
实施例5.桑蛋白和桑蛋白活性肽的含量测定方法
(1)考马斯亮蓝试剂的配置
试剂A：称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL95％的乙醇，加入100mL85％(w/v)的磷酸溶液。
试剂B：将考马斯亮蓝G-250母液与蒸馏水(双蒸水)按15:85的比例混匀，过滤，4度，棕色试剂瓶保存。
(2)标准曲线的绘制
以牛血清白蛋白为标准样品制定的蛋白标准溶液，取7支比色管并编号(由1至7)，分别加入0.00、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mL的1.0mg/mL的牛血清白蛋白溶液，然后用蒸馏水补充至0.1mL，最后各管加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，每加完一管，立即在漩涡混合仪上混合，加完试剂2-5分钟后，即可用比色皿在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值(OD值)，实验结果见表1，根据得到的光吸收值与浓度数据做蛋白质标准曲线，标准曲线见图2。
表1蛋白质标准曲线表
实施例6.本方法与传统方法对不同原料桑蛋白和桑蛋白活性肽提取得率的影响
取200g桑叶分成2组(对照组和实验组)，每组100g；取200g桑枝皮分成2组(对照组和实验组)，每组100g。实验组采用实施例2和实施例5中的方法制备桑蛋白液和活性肽。对照组1采用1％的盐酸作为处理剂，对照组2采用水作为处理剂，采用实施例5的测定方法对实验组和对照组获得的桑蛋白和桑蛋白活性肽含量进行测试所，结果如表2所示，本发明提供的制备方法提取得到的桑蛋白和桑蛋白活性肽的含量都比对照组1和2的高。
表2.本方法与传统方法对不同原料桑蛋白和桑蛋白活性肽提取率的影响
实施例7.桑蛋白活性肽对自由基清除能力的测定
以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基为清除对象，分别取桑蛋白活性肽和抗坏血酸(Vc)进行如下阳性对照实验：
样品组：依次取浓度为0.25mg/mL的桑蛋白活性肽溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL于试管中，各加入相应体积的蒸馏水，使其稀释至终体积为2mL，在各管中加入2mL 0.2mmol/L的DPPH溶液，摇匀，放置30min，无水乙醇调零，测定混合液在OD517nm的吸光度。
对照组：依次取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的桑蛋白活性肽溶液(浓度为0.25mg/mL)于试管中，各加入相应体积的蒸馏水，使其稀释至终体积为2mL,在各管中加入2mL无水乙醇，摇匀，放置30min，以无水乙醇调零，测定混合液OD517nm。
空白组：取2mL DPPH溶液与2mL无水乙醇于试管中，摇匀，放置30min，无水乙醇调零，测定混合液的OD517nm。
同理，按照上述方法和浓度分别配制抗坏血酸(Vc)的样品组、对照组和空白组溶液，并测定。DPPH清除率按照公式1进行计算，图3为不同浓度桑蛋白活性肽和VC对DPPH自由基清除率的影响。
DPPH清除率(％)＝[1-(A样品-A对照)/A空白]×100％公式1
以上描述是用于实施本发明的一些最佳模式和其他实施方式，只是对本发明的技术构思起到说明示例作用，并不能以此限制本发明的保护范围，本领域技术人员在不脱离本发明技术方案的精神和范围内，进行修改和等同替换，均应落在本发明的保护范围之内。
一种桑蛋白活性肽的制备方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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