专利摘要

本发明涉及一种高温大曲浸提液宏蛋白的提取纯化方法。方法是高温大曲粉碎后喷无菌水混匀放置生物培养箱阶段升温法进行活化培养备用；加入乙酸‑乙酸钠缓冲液和苯甲基磺酰氟溶液，振荡混匀后浸提过夜，过滤，离心得到高温大曲浸提液；依次加入TCA‑丙酮溶液、乙酸铵甲醇溶液、丙酮溶液、Tris饱和酚/十二烷基硫酸钠缓冲液、乙酸铵甲醇溶液、甲醇和丙酮溶液，相应得到A沉淀、B沉淀、酚层、C沉淀、D沉淀和高温大曲宏蛋白质样品；加入样品裂解液，冰浴超声助溶，离心弃沉淀物得到高温大曲宏蛋白样品液。本方法制备的高温大曲宏蛋白样品液可以应用于高温大曲宏蛋白的双向电泳，得到高分辨率，高重复性的双向电泳图谱。

权利要求

1.一种高温大曲浸提液宏蛋白的提取纯化方法，其特征在于：

1）高温大曲的活化培养：

在高温大曲的曲块上，按照五点取样法取高温大曲300g粉碎后过40目筛子得到高温大曲曲粉，喷20-40g无菌水混匀，放置生物培养箱阶段升温法进行24小时活化培养备用；

2）高温大曲浸提液制备：

称取30g经过活化培养的高温大曲曲粉，加入90ml的乙酸-乙酸钠缓冲液和90μL苯甲基磺酰氟溶液，振荡混匀后置于4℃条件下浸提过夜，然后用4层纱布过滤，滤液离心20 min，取上清液即为高温大曲浸提液；

3）Tris-丙酮-酚改良法提取

取10ml高温大曲浸提液于离心管内，加入-20℃预冷40mlTCA-丙酮溶液混合；振荡摇匀后在-20℃冰箱中放置2 小时，离心30 min，弃上清，收集A沉淀；

在A沉淀中，加入5ml 乙酸铵甲醇溶液浸没，振荡3-5分钟后，在-20℃冰箱放置30min，离心10 min，收集B沉淀；

在B沉淀中，加入10ml丙酮溶液清洗，然后置于真空干燥仪中，使丙酮完全挥发后，加入5ml 1：1体积比的 Tris饱和酚/十二烷基硫酸钠缓冲液，振荡15-20分钟后，离心，收取浅色上层酚层；

在酚层中加入乙酸铵甲醇溶液，酚层：乙酸铵甲醇溶液体积比1：5，放置过夜，离心10 min，收取C沉淀；

在C沉淀中加入10ml甲醇，振荡清洗5分钟，离心10min，收取D沉淀；

在D沉淀中，加入10ml丙酮溶液清洗，使丙酮完全挥发，得到高温大曲宏蛋白质样品；

4）超声波裂解

在高温大曲宏蛋白质样品中，加入0.5-1.0ml样品裂解液，浸没高温大曲宏蛋白质样品，冰浴超声助溶30min，离心15 min，弃沉淀物得到高温大曲宏蛋白样品液。

2.根据权利要求1所述的一种高温大曲浸提液宏蛋白的提取纯化方法，其特征在于所述的振荡是在旋涡混合器上进行；所述的离心是在保持4℃条件下以12000 r/min进行离心。

3.根据权利要求1所述的一种高温大曲浸提液宏蛋白的提取纯化方法，其特征在于所述的阶段升温法是指在30℃条件下活化培养8小时，升温至35℃活化培养6小时，再升温至40℃活化培养6小时，最后再升温45℃活化培养4小时。

4. 根据权利要求1所述的一种高温大曲浸提液宏蛋白的提取纯化方法，其特征在于所述的乙酸-乙酸钠缓冲溶液是通过以下过程配制的：称取 8.1 g无水乙酸钠溶于适量水中，定容到1000 mL，配成0.1mol/L乙酸钠溶液；取 5.73mL 冰乙酸加水定容到 1000 mL，配成0.1mol/L乙酸溶液；分别取乙酸钠溶液和乙酸溶液混匀调至pH值为4.6～4.8。

5.根据权利要求1所述的一种高温大曲浸提液宏蛋白的提取纯化方法，其特征在于所述的TCA丙酮溶液是通过以下过程配制的：三氯乙酸50 g，β-巯基乙醇350μL，加丙酮溶解，定容到 500 mL，在-20℃冰箱中保存备用。

十二烷基硫酸钠缓冲液是通过以下过程配制的：30%蔗糖，2%SDS，0.1M Tris-HCL PH值8.0 ，5% β-巯基乙醇，1%蛋白酶抑制剂混合物，在-20℃冰箱中保存备用。

6.根据权利要求1所述的一种高温大曲浸提液宏蛋白的提取纯化方法，其特征在于所述的丙酮溶液是通过以下过程配制的：350μLβ-巯基乙醇，加丙酮溶解，定容到 500mL，在-20℃冰箱中保存。

7. 根据权利要求1所述的一种高温大曲浸提液宏蛋白的提取纯化方法，其特征在于所述的乙酸铵甲醇溶液是通过以下过程配制的：将0.1mol乙酸铵溶于甲醇中，定容到1000 mL，配成0.1mol/L乙酸铵甲醇溶液，在-20℃冰箱中保存备用。

8. 根据权利要求1所述的一种高温大曲浸提液宏蛋白的提取纯化方法，其特征在于所述的样品裂解液是通过以下过程配制的：尿素10.5g，硫脲3.8g，CHAPS 1g，IPG Buffer（pH 3-10）500μL，DTT154mg加水溶解后定容到 25mL，每1.5mL EP 管中分装样品裂解液1mL，在-20℃冰箱中保存备用。

说明书

技术领域

本发明属于宏蛋白组学技术领域。具体涉及一种高温大曲浸提液宏蛋白的提取纯化方法。

背景技术

高温大曲是以小麦为主要原料，经粉碎加水压成砖状的曲块，在一定的温度、湿度条件下开放性培育，制曲培养最高温度达60~68℃，来源于制曲环境、曲母、原料中的微生物在曲块上生长繁殖代谢产生各种酶系，使得高温大曲具有液化力、糖化力及蛋白质分解力。高温大曲主要用于酱香型白酒的生产，以茅台酒为典型。高温大曲中微生物产的复杂多种酶系或酶蛋白体系是酱香型白酒风味物质形成主要动力，也是影响酱香型白酒品质的重要因素。

宏蛋白质组是在2004 年，Rodriguez 根据宏基因组（metagenome）的概念提出的，它是指环境中多种微生物群落中所有生物的蛋白质组总和。在大曲宏蛋白组学的研究，江南大学在大曲宏蛋白组学以及双向电泳技术作了探索性的研究。高温大曲的宏蛋白组学的研究目前国内研究资料还未涉及。由于高温大曲在多水高温的条件培育而成，既产生复杂酶类同时形成多种影响酶类分析的杂质。特别是高温大曲在制曲过程中发生了美拉德反应。美拉德反应使高温大曲中含氨基的化合物和含羰基的化合物之间经缩合、聚合而生成大量类黑精物质。类黑精色素的存在给宏蛋白样品的定量、纯化、双向电泳带来了很大问题。

因此，高温大曲宏蛋白质组学研究必须建立一种高分辨率，高重复性的双向电泳技术方法是有效宏蛋白质组学分析的保证。高温大曲宏蛋白的双向电泳技术将有助于分析高温大曲宏蛋白质组的动态变化，并能有效比较分析高温大曲和强化大曲的宏蛋白质组的组成结构差别，为高温大曲生产工艺的改善提供科学的指导。从而了解功能微生物间复杂多酶体系的相互作用是改善生产工艺和提高酱香型白酒品质的基础。而高分辨率，高重复性的双向电泳技术是建立在良好的高温大曲宏蛋白质组样品的基础上。所以，制备良好的高温大曲宏蛋白质组样品是产生高分辨率，高重复性的双向电泳技术图谱的关键技术，以保证实现样品的有效宏蛋白质组学分析。

本发明针对高温大曲存在多种影响宏蛋白的双向电泳分析的杂质和大量类黑精色素问题，经过多方面反复实验，改进宏蛋白提取的方法，基本解决高温大曲的类黑精色素的干扰问题，制备良好的高温大曲宏蛋白质组样品用于双向电泳，建立一种高分辨率，高重复性的双向电泳技术方法，进行高温大曲宏蛋白组学的研究。

发明内容

高温大曲制备过程既产生复杂酶类同时又形成多种影响酶类分析的杂质。特别是高温大曲在制曲过程中发生了美拉德反应生成大量类黑精物质。严重影响双向电泳的效果。本发明针对问题所在，以高温大曲为材料，以高温大曲进行活化培养，改进蛋白提取的方法，基本解决高温大曲的类黑精色素的干扰问题，构建一种高分辨率，高重复性的高温大曲浸提液提取宏蛋白的样品用于高分辨率，高重复性的双向电泳。

为了实现本发明的目的而采用高温大曲浸提液提取宏蛋白的技术方案如下：

1、高温大曲的活化培养：

在高温大曲的曲块上，按照五点取样法取高温大曲300g粉碎后过40目筛子得到高温大曲曲粉，喷20-40g无菌水混匀，放置生物培养箱阶段升温法进行24小时活化培养，即在30℃条件下活化培养8小时，升温至35℃活化培养6小时，再升温至40℃活化培养6小时，最后再升温至45℃活化培养4小时后备用。

2、高温大曲浸提液制备：

称取30g经过活化培养的高温大曲曲粉，加入90ml的乙酸-乙酸钠缓冲液和90μL苯甲基磺酰氟溶液（ PMSF溶液），振荡混匀后置于4℃条件下浸提过夜。然后用4层纱布过滤，滤液离心20 min，取上清液即为高温大曲浸提液。

3、Tris-丙酮-酚改良法提取

取10ml高温大曲浸提液于离心管内，加入-20℃预冷40mlTCA-丙酮溶液混合。混合液振荡摇匀后，在-20℃冰箱中放置2 小时，离心30 min，弃上清，收集A沉淀；

在A沉淀中，加入5ml 乙酸铵甲醇溶液浸没，振荡3-5分钟后，在-20℃冰箱放置30min，离心10 min。弃上清，收集B沉淀；

在B沉淀中，加入10ml丙酮溶液清洗，然后置于真空干燥仪中，使丙酮完全挥发后，加入5ml 1：1体积比的 Tris饱和酚/十二烷基硫酸钠缓冲液（SDS Buffer），振荡15-20分钟后，离心，收取浅色上层酚层；

在酚层中加入乙酸铵甲醇溶液，酚层：乙酸铵甲醇溶液体积比1：5。放置过夜，离心10 min，收取C沉淀；

在C沉淀中加入10ml甲醇，振荡清洗5分钟，离心10min，收取D沉淀；

在D沉淀中，加入10ml丙酮溶液清洗，使丙酮完全挥发，余下即高温大曲宏蛋白质样品。

以上所述的振荡是在旋涡混合器上进行；所述的离心是在保持4℃条件下以12000 r/min进行离心。

4、超声波裂解

在高温大曲宏蛋白质样品中，加入0.5-1.0ml样品裂解液，浸没高温大曲宏蛋白质样品，冰浴超声助溶30min，在保持4℃下12000 r/min离心15 min，取上清即为高温大曲宏蛋白样品液。

本发明技术方案中涉及的试剂溶液配制如下：

（1）乙酸-乙酸钠缓冲溶液：称取 8.1 g 无水乙酸钠溶于适量水中，定容到1000 mL，配成0.1mol/L乙酸钠溶液。取 5.73mL 冰乙酸加水定容到 1000 mL，配成0.1mol/L乙酸溶液。分别取乙酸钠溶液和乙酸溶液混匀调至pH值为4.6～4.8。

（2）TCA丙酮溶液：三氯乙酸（TCA）50 g，β-巯基乙醇350μL，加丙酮溶解，定容到 500 mL，在-20℃冰箱中保存备用。

（3）十二烷基硫酸钠缓冲液（SDS Buffer）：30%蔗糖，2%SDS，0.1M Tris-HCL PH值8.0 ，5% β-巯基乙醇，1%蛋白酶抑制剂混合物。在-20℃冰箱中保存备用。

（4）丙酮溶液：350μLβ-巯基乙醇，加丙酮溶解，定容到 500mL。在-20℃冰箱中保存。

（5）乙酸铵甲醇溶液：将0.1mol乙酸铵溶于甲醇中，定容到1000 mL，配成0.1mol/L乙酸铵甲醇溶液，在-20℃冰箱中保存备用。

（6）样品裂解液：尿素10.5g，硫脲3.8g，CHAPS 1g，IPG Buffer（pH 3-10）500μL，DTT154mg加水溶解后定容到 25mL。每1.5mL EP 管中分装样品裂解液1mL，在-20℃冰箱中保存备用。

以上涉及的试剂均购自GE公司。通过以上技术方案得到的高温大曲宏蛋白样品液可以应用于高温大曲宏蛋白的双向电泳，得到高分辨率，高重复性的双向电泳图谱，进行高温大曲宏蛋白组学的研究。具体应用过程如下：

提取的350μL高温大曲宏蛋白样品液，用IPG胶条泡涨上样的方式，在泡涨盘中泡涨18h后，进行等电聚焦，限定电流50μA，工作温度20℃。具体操作按照GE公司的《双向电泳手册》程序依此进行等电聚焦、SDS-PAGE电泳、凝胶染色，激光扫描仪 ImageScaner Ⅲ拍照即高温大曲宏蛋白样品的双向电泳谱图。

总结高温大曲宏蛋白双向电泳技术方案：高温大曲需要经过活化培养处理；用pH4.6-4.8乙酸-乙酸钠缓冲液进行高温大曲浸提液的制备；采用Tris-丙酮-酚改良法提取高温大曲宏蛋白质组样品。本发明的高温大曲浸提液宏蛋白的提取纯化方法，双向电泳凝胶背景清晰，基本解决高温大曲的类黑精色素的干扰问题，拍照得到高分辨率清晰，重复率高的高温大曲宏蛋白双向电泳谱图。并适用于下一步质谱鉴定分析工作。

附图说明

图1是采用文献报道Tris-丙酮方法提取的高温大曲宏蛋白样品液进行双向电泳图谱。

图2是采用本发明所述的方法提取的高温大曲宏蛋白样品液进行双向电泳图谱。

具体实施方式

实施例1

为了实现本发明的目的而采用高温大曲浸提液提取宏蛋白的技术方案如下：

1、高温大曲的活化培养：

在高温大曲的曲块上，按照五点取样法取高温大曲300g粉碎后过40目筛子得到高温大曲曲粉，喷40g无菌水混匀，放置生物培养箱阶段升温法进行24小时活化培养，即在30℃活化培养8小时，升温35℃活化培养6小时，升温40℃活化培养6小时，升温45℃活化培养4小时后备用。

2、高温大曲浸提液制备：

称取30g经过活化培养的高温大曲粉，加入90ml的pH值4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液和90μL苯甲基磺酰氟溶液（ PMSF溶液），振荡混匀后置于4℃条件下浸提过夜。然后用4层纱布过滤，滤液离心20 min，取上清液即为高温大曲浸提液。

3、Tris-丙酮-酚改良法提取

取10ml高温大曲浸提液于离心管内，加入-20℃预冷40mlTCA-丙酮溶液混合。混合液振荡摇匀后，在-20℃冰箱中放置2 小时，离心30 min，弃上清，收集A沉淀；

在A沉淀中，加入5ml 乙酸铵甲醇溶液浸没，振荡3-5分钟后，在-20℃冰箱放置30min，离心10 min。弃上清，收集B沉淀；

在B沉淀中，加入10ml丙酮溶液清洗，然后置于真空干燥仪中，使丙酮完全挥发后，加入5ml 1：1体积比的 Tris饱和酚/十二烷基硫酸钠缓冲液（SDS Buffer），振荡15分钟后，离心，收取浅色上层酚层；

在酚层中加入乙酸铵甲醇溶液，酚层：乙酸铵甲醇溶液体积比1：5。放置过夜，离心10 min，收取C沉淀；

在C沉淀中加入10ml甲醇，振荡清洗5分钟，离心10min，收取D沉淀；

在D沉淀中，加入10ml丙酮溶液清洗，使丙酮完全挥发，余下即高温大曲宏蛋白质样品。

以上振荡操作是在旋涡混合器上进行；离心操作是在保持4℃下12000 r/min离心。

4、超声波裂解

在高温大曲宏蛋白质样品中加入1.0ml样品裂解液，浸没高温大曲宏蛋白质样品，冰浴超声助溶30min，在保持4℃下12000 r/min离心15 min，取上清即为高温大曲宏蛋白样品液。

5、高温大曲宏蛋白样品液用于制备双向电泳图谱：

将上述提取纯化得到的高温大曲宏蛋白样品液，应用于高温大曲宏蛋白的双向电泳，得到高分辨率，高重复性的双向电泳图谱，具体应用如下：

提取的350μL高温大曲宏蛋白样品液，用IPG胶条泡涨上样的方式，在泡涨盘中泡涨18h后，进行等电聚焦，限定电流50μA，工作温度20℃。具体操作按照GE公司的《双向电泳手册》程序依此进行等电聚焦、SDS-PAGE电泳、凝胶染色，激光扫描仪 ImageScaner Ⅲ拍照即高温大曲宏蛋白样品的双向电泳谱图。如附图2所示。

本实施例采用公开文献报道Tris-丙酮方法，提取了高温大曲宏蛋白样品液并采用相同的双向电泳条件进行了双向电泳得到双向电泳图谱。如附图1所示。

比较附图1和附图2，可知：图1由于类黑色素干扰，色素沉淀区域大，清晰蛋白点少，分辨率低；图2基本排除类黑色素干扰，色素沉淀区域小，清晰蛋白点多，分辨率高，可应用于蛋白组学研究；

以上涉及的试剂均购自GE公司。

本实施例中涉及的试剂溶液配制如下：

（1）乙酸-乙酸钠缓冲溶液：称取 8.1 g 无水乙酸钠溶于适量水中，定容到1000 mL，配成0.1mol/L乙酸钠溶液。取 5.73mL 冰乙酸加水定容到 1000 mL，配成0.1mol/L乙酸溶液。分别取乙酸钠溶液和乙酸溶液混匀调至pH值为4.6～4.8。

（2）TCA丙酮溶液：三氯乙酸（TCA）50 g，β-巯基乙醇350μL，加丙酮溶解，定容到 500 mL，在-20℃冰箱中保存备用。

（3）十二烷基硫酸钠缓冲液（SDS Buffer）：30%蔗糖，2%SDS，0.1M Tris-HCL PH值8.0 ，5% β-巯基乙醇，1%蛋白酶抑制剂混合物。在-20℃冰箱中保存备用。

（4）丙酮溶液：350μLβ-巯基乙醇，加丙酮溶解，定容到 500mL。在-20℃冰箱中保存。

（5）乙酸铵甲醇溶液：将0.1mol乙酸铵溶于甲醇中，定容到1000 mL，配成0.1mol/L乙酸铵甲醇溶液，在-20℃冰箱中保存备用。

（6）样品裂解液：尿素10.5g，硫脲3.8g，CHAPS 1g，IPG Buffer（pH 3-10）500μL，DTT154mg加水溶解后定容到 25mL。每1.5mL EP 管中分装样品裂解液1mL，在-20℃冰箱中保存备用。

以上涉及的试剂均购自GE公司。

一种高温大曲浸提液宏蛋白提取纯化方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。