专利摘要

本发明涉及一种细菌纤维素膜（BC膜）组织工程化人工肌腱支架的制备方法。技术方案如下：将木糖葡糖醋杆菌菌种接种到固体培养基活化后，在摇床的条件下培养24～32h制成木糖葡糖醋杆菌种子液。木糖葡糖醋杆菌种子液接入6‑8%体积的接种量接入到酒糟降解液复合液中，28℃静置培养4～6得到细菌纤维素膜。取细菌纤维素膜，冲洗后将细菌纤维素膜用蒸馏水浸24～28h，得到白色半透明的细菌纤维素膜。本发明的有益效果是以细菌纤维素膜（BC膜）作为支架材料，与传统的高分子材料相比，孔隙率、持水性、复水性、力学性能符合要求，而且具有天然、细胞相容性好等特点，符合组织工程化人工肌腱支架的要求。

权利要求

1.一种细菌纤维素膜组织工程化人工肌腱支架的制备方法，其特征是：

1）将木糖葡糖醋杆菌（Glucoacetobacter xylinus）菌种接种到固体培养基进行常规的活化后，从固体培养基上挑选活化的菌种，接入装有100ml液体培养基的500ml锥形瓶，在28℃和160r/min摇床的条件下培养24～32h制成木糖葡糖醋杆菌种子液，备用；

2、木糖葡糖醋杆菌种子液以每升酒糟降解液复合液接入6～8%体积的接种量，接入到酒糟降解液复合液中，充分震荡，使菌液均匀后，放置于28℃培养箱中进行静置培养。培养4～6天后，可见液体培养基液面浮有细菌纤维素膜，此时细菌纤维素膜厚度为2.5～4.5 mm ；

3、取出浮于培养基表面的细菌纤维素膜，用自来水多次冲洗后，放于0.1M的NaOH溶液中加热并煮沸10min，去除膜中的培养基和菌体等杂质，取出，加蒸馏水漂洗10 min。再将细菌纤维素膜放于0.1M的NaOH溶液并再次煮沸10min，用蒸馏水多次漂洗细菌纤维素膜，直至洗涤水pH值为7.0为止；

4）将细菌纤维素膜用蒸馏水浸24～28h，得到白色半透明的细菌纤维素膜；

5）采用基本符合天然肌腱形状和尺寸的不锈钢模具，将本发明制备的BC膜，填充于模具内，压制定型得到本发明所述的天然肌腱组织工程化BC膜支架材料。

2.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素膜组织工程化人工肌腱支架的制备方法，其特征是所述的菌种为木糖葡糖醋杆菌（Glucoacetobacter xylinus），编号为1.1812，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。

3.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素膜组织工程化人工肌腱支架的制备方法，其特征是所述的固体培养基制备配方为：葡萄糖3%，蛋白胨0.8%，酵母浸出物0.8%，柠檬酸0.1%，磷酸氢二钠0.6%，硫酸镁0.2%，琼脂粉2%按常规加水配制，灭菌备用。

4.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素膜组织工程化人工肌腱支架的制备方法，其特征是所述的液体培养基制备：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母浸出物0.5%，柠檬酸0.1%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%；液体培养基pH 6.0-6.5。

5.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素膜组织工程化人工肌腱支架的制备方法，其特征是所述的酒糟降解液复合液，以酒糟降解液为母液，含有0.2%葡萄糖，0.05%蛋白胨，0.05%酵母浸出物，0.01%柠檬酸，0.02%磷酸氢二钠，0.01%硫酸镁；酒糟降解液复合液pH 6.0～6.5，灭菌备用。

6.根据权利要求5所述的一种细菌纤维素膜组织工程化人工肌腱支架的制备方法，其特征是所述的酒糟降解液的制备：将100重量份机榨黄酒酒糟中加入50重量份55℃热水，搅拌混合，再加入1重量份复合酶酶解6小时，酶解条件：品温为50℃，pH 6.5，酶解后得到经过滤机过滤的酒糟降解液。

7.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素膜组织工程化人工肌腱支架的制备方法，其特征是所述的复合酶，各组分重量比为中温α-淀粉酶：糖化酶：中性蛋白酶＝3：4：3。

8.根据权利要求7所述的一种基于细菌纤维素膜制备组织工程化人工肌腱支架材料的方法，其特征是所述的中温α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司。

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程材料技术领域。具体而言，涉及一种细菌纤维素膜（BC膜）组织工程化人工肌腱支架的制备方法。

背景技术

肌腱受损的患者往往是运动员和从事体力劳动者，肌腱没能及时修复而不能活动的情况，患者肢体和心理感觉痛苦，如果放弃治疗，导致其残疾。近年来，组织工程化肌腱为临床肌腱缺损修复提供了更为理想的、符合生理特点的方法，其主要原理是提供一个能满足肌腱力学性能的细胞生长支架，在体外或体内植入种子细胞，通过调控形成肌腱样组织，从而使肌腱缺损得到修复，但此方法要求技术难度较大且理想的肌腱组织工程支架材料是非常难选择。理想的肌腱组织工程支架材料不仅应具备一定的孔隙率、吸水率、良好的生物相容性等一般支架材料所具有的特性，还应具备相应的力学强度、无免疫原性等特性。

细菌纤维素(Bacterial cellulose BC)是一种在自然环境下，微生物发酵产生的一种纳米级纤维素。由单一的葡萄糖通过化学键形成。拥有良好的抗拉伸能力与韧性，优良的生物相容性和生物可降解性。细菌纤维素本身就是在液体环境中发酵产生的，拥有良好的亲水性和持水性。因此，BC在和以前出现的化工合成纤维材料相比，在力学性能和生物亲和力上都更加接近天然肌腱，具有成为受损肌腱替代品的潜能。在近年的组织工程学研究中，BC膜作为热门研究生物材料，已经在眼睛的晶状体的替换上取得了成功。所以，以BC膜作为组织工程化肌腱的支架材料是较好的选择。

发明内容

本发明采用木糖葡糖醋杆菌（Glucoacetobacter xylinus）制备细菌纤维素膜（BC膜），组织工程化人工肌腱支架。所制备的组织工程化人工肌腱支架孔隙率、持水性、复水性、力学性能、细胞毒性和细胞相容性等技术指标符合组织工程化肌腱支架的要求。

为实现本发明的目的而采用技术方案如下：

一、BC膜的制备

（一）制备

1、将木糖葡糖醋杆菌（Glucoacetobacter xylinus）菌种接种到固体培养基进行常规的活化后，从固体培养基上挑选活化的菌种，接入装有100ml液体培养基的500ml锥形瓶，在28℃和160r/min摇床的条件下培养24～32h制成木糖葡糖醋杆菌种子液，备用。

2、木糖葡糖醋杆菌种子液以每升酒糟降解液复合液接入6 -8%体积的接种量，接入到酒糟降解液复合液中，充分震荡，使菌液均匀后，放置于28℃培养箱中进行静置培养。培养4～6天后，可见液体培养基液面浮有细菌纤维素膜，此时细菌纤维素膜厚度为2.5～4.5 mm。

3、取出浮于培养基表面的细菌纤维素膜，用自来水多次冲洗后，放于0.1M的NaOH溶液中加热并煮沸10min，去除膜中的培养基和菌体等杂质。取出，加蒸馏水漂洗10 min。再将细菌纤维素膜放于0.1M的NaOH溶液并再次煮沸10min，用蒸馏水多次漂洗细菌纤维素膜，直至洗涤水pH值为7.0为止。

4、将细菌纤维素膜用蒸馏水浸24～28h，得到白色半透明的细菌纤维素膜。此时，所制备的细菌纤维素膜由细小的纤维束交错形成中间为大量纳米级孔隙的纤维素膜。

所述的菌种为木糖葡糖醋杆菌（Glucoacetobacter xylinus），编号为1.1812，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。

所述的固体培养基制备配方为：3%葡萄糖，0.8%蛋白胨，0.8%酵母浸出物，0.1%柠檬酸，0.6%磷酸氢二钠，0.2%硫酸镁，2%琼脂粉。按常规配制，灭菌备用。

所述的液体培养基，其配方为：2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%酵母浸出物，0.1%柠檬酸，0.2%磷酸氢二钠，0.1%硫酸镁；液体培养基pH 6.0-6.5。

所述的酒糟降解液复合液，以酒糟降解液为母液，含有0.2%葡萄糖，0.05%蛋白胨，0.05%酵母浸出物，0.01%柠檬酸，0.02%磷酸氢二钠，0.01%硫酸镁；酒糟降解液复合液pH 6.0～6.5，灭菌备用。

酒糟降解液的制备：将100重量份机榨黄酒酒糟中加入50～60重量份55℃热水，搅拌混合，再加1重量份复合酶酶解5～6小时，酶解条件：品温为45℃～50℃，pH 6.0～6.5。酶解后经过滤机过滤的液体为酒糟降解液，灭菌备用。

所述的复合酶，其组分为中温α-淀粉酶：糖化酶：中性蛋白酶＝3：4：3。

所述的中温α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司。

（二）性能测试

1、将以上制备的BC膜，进行孔隙率、持水性、复水性、力学性能测试。经测定本发明制备的BC膜孔隙率为96-98%；持水性为97-99%；复水性为52-55，具有相当高的亲水性，能够适用于生物体内的液体环境。

2、力学性能测试：将以上制备的BC膜，进行极限拉伸强度测试。经测试，极限拉伸强度为38N-42 N，断裂伸长率24-26%。

3、以浸提液法检测BC膜的细胞毒性为Ⅰ级，说明BC膜对细胞生长无毒性。符合生物材料安全要求。

二、支架成型

（一）制备

采用基本符合天然肌腱外形和尺寸的二分开不锈钢模具，将本发明制备的孔隙率、持水性、复水性、力学性能技术指标符合要求的BC膜，填充于模具内，压制定型成组织工程化人工肌腱支架，将压制定型后支架放在高压灭菌锅中进行温度121℃、15min的灭菌处理，灭菌处理后降到室温后，放入4℃冰箱保存、备用。由于模具内底部刻有单向凹凸浅花纹，因而压制定型成组织工程化人工肌腱支架表面也具有单向浅花纹。

（二）验证试验

将本发明制备的组织工程化人工肌腱支架浸泡入DMEM低糖培养基(含10%FBS)中24h，置于细胞培养箱中，使人工肌腱支架充分吸收DMEM低糖培养基；将骨髓间充质干细胞（BMSCs）植到已充分吸收DMEM低糖培养基的组织工程化人工肌腱支架上。选用种子细胞为骨髓间充质干细胞（BMSCs），骨髓间充质干细胞浓度为1-2×10⁵/ml。经过细胞培养箱培养48h，经观察未感染杂菌，可用于下一步验证实验。

(1) 人工肌腱支架附上种子细胞培养的HE染色:

人工肌腱支架附上骨髓间充质干细胞进行体外培养后，HE染色试验。在2周开始，体外培养新生细胞在人工肌腱支架上附着并大量分裂。此时的细胞数量虽多，但是分布紊乱，没有条理。经6周后，细胞数量开始减少；8周后，细胞数量趋于稳定，而细胞排布也开始向受力方向有条理地排列；在12周，体外培养新生细胞数量与天然肌腱细胞数量相近，细胞也显现出向受力方向排列。

(2)人工肌腱支架附上种子细胞培养的免疫组化:

人工肌腱支架附上骨髓间充质干细胞进行体外培养后，免疫组化试验。在4周胶原蛋白Ⅰ型开始大量表达，并在12周达到天然肌腱水平。在12周，体外培养新生细胞的胶原蛋白Ⅰ型程度已经和天然肌腱相当接近。

体外培养新生细胞在4周开始，胶原蛋白Ⅲ型有少量表达。到8周，胶原蛋白Ⅲ型才开始大量表达。在12周，体外培养新生细胞的胶原蛋白Ⅲ型表达高于对照组水平。

HE染色和免疫组化试验证明：骨髓间充质干细胞作为种子细胞能够附着在植入的BC膜支架材料上，并生长分泌胶原蛋白。人工肌腱支架上种子细胞培养可以良好生长增值，本发明制备的BC膜可以作为组织工程化肌腱的支架材料。

所述的DMEM低糖培养基、骨髓间充质干细胞（BMSCs）可从市场直接购得。

本发明的细菌纤维素支架材料功效是：1、微生物培养得到天然产物细菌纤维素膜（BC膜）作为支架材料，不存在材料来源限制。2、其作为生物支架材料具有孔隙率、持水性、复水性、力学性能好，而且具有良好细胞相容性等特点，符合组织工程化人工肌腱支架的要求。

附图说明

图1是12周 BC膜人工肌腱支架的新生细胞HE染色图。

图2是12周 BC膜人工肌腱支架新生细胞的胶原蛋白Ⅰ免疫组化染色图。

图3是12周 BC膜人工肌腱支架新生细胞的胶原蛋白Ⅲ免疫组化染色图。

具体实施方式：

实施例1

一、BC膜的制备

（一）制备

1、将木糖葡糖醋杆菌（Glucoacetobacter xylinus）菌种接种到固体培养基进行常规的活化后，从固体培养基上挑选活化的菌种，接入装有100ml液体培养基的500ml锥形瓶，在28℃和160r/min摇床的条件下培养24～32h制成木糖葡糖醋杆菌种子液备用。

2、木糖葡糖醋杆菌种子液以每升酒糟降解液复合液接入8%体积的接种量，接入到酒糟降解液复合液中，充分震荡，使菌液均匀后，放置于28℃培养箱中进行静置培养。培养5天后，可见液体培养基液面浮有细菌纤维素膜，此时细菌纤维素膜厚度为3.1mm。

3、取出浮于培养基表面的细菌纤维素膜，用自来水多次冲洗后，放于0.1M的NaOH溶液中加热并煮沸10min，去除膜中的培养基和菌体等杂质。取出，加蒸馏水漂洗10 min。再将细菌纤维素膜放于0.1M的NaOH溶液并再次煮沸10min，用蒸馏水多次漂洗细菌纤维素膜，直至洗涤水pH值为7.0为止。

4、将细菌纤维素膜用蒸馏水浸26h，得到白色半透明的细菌纤维素膜。此时，所制备的细菌纤维素膜由细小的纤维束交错形成中间为大量纳米级孔隙的纤维素膜。

所述的菌种为木糖葡糖醋杆菌（Glucoacetobacter xylinus），编号为1.1812，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）。

所述的固体培养基制备配方为：3%葡萄糖，0.8%蛋白胨，0.8%酵母浸出物，0.1%柠檬酸，0.6%磷酸氢二钠，0.2%硫酸镁，2%琼脂粉。按常规配制，灭菌备用。

所述的液体培养基，其配方为：2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%酵母浸出物，0.1%柠檬酸，0.2%磷酸氢二钠，0.1%硫酸镁；液体培养基pH 6.0-6.5。

所述的酒糟降解液复合液，含有0.2%葡萄糖，0.05%蛋白胨，0.05%酵母浸出物，0.01%柠檬酸，0.02%磷酸氢二钠，0.01%硫酸镁，调整pH 6.0-6.5，灭菌备用。

酒糟降解液的制备：将100重量份机榨黄酒酒糟中加入55重量份55℃热水，搅拌混合，再加1重量份复合酶酶解5小时，酶解条件：品温为50℃，pH 6.0。酶解后经过滤机过滤的液体为酒糟降解液，灭菌备用。

所述的复合酶，其组分为中温α-淀粉酶：糖化酶：中性蛋白酶＝3：4：3。

所述的中温α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司。

（二）性能测试

1、将以上制备的BC膜，进行孔隙率、持水性、复水性、力学性能测试。经测定本发明制备的BC膜孔隙率为96%；持水性为97%；复水性为52，具有相当高的亲水性，能够适用于生物体内的液体环境。

2、力学性能测试：将以上制备的BC膜，进行极限拉伸强度测试。经测试，极限拉伸强度为41 N，断裂伸长率26%。

3、以浸提液法检测BC膜的细胞毒性为Ⅰ级，说明BC膜对细胞生长无毒性。符合生物材料安全要求。

二、BC膜支架材料成型制备

（一）制备

采用基本符合天然肌腱外形和尺寸的二分开不锈钢模具，将本发明制备的孔隙率、持水性、复水性、力学性能技术指标符合要求的BC膜，填充于模具内，压制定型成组织工程化人工肌腱支架，将压制定型后支架放在高压灭菌锅中进行温度121℃、15min的灭菌处理，灭菌处理后降到室温后，放入4℃冰箱保存、备用。由于模具内底部刻有单向凹凸浅花纹，因而压制定型成组织工程化人工肌腱支架表面也具有单向浅花纹。

（二）验证试验

将本发明制备的组织工程化人工肌腱支架浸泡入DMEM低糖培养基(含10%FBS)中24h，置于细胞培养箱中，使人工肌腱支架充分吸收DMEM低糖培养基；将骨髓间充质干细胞（BMSCs）植到已充分吸收DMEM低糖培养基的组织工程化人工肌腱支架上。选用种子细胞为骨髓间充质干细胞（BMSCs），骨髓间充质干细胞浓度为2×10⁵/ml。经过细胞培养箱培养48h，经观察未感染杂菌，可用于下一步验证实验。

(1) 人工肌腱支架附上种子细胞培养的HE染色:

人工肌腱支架附上骨髓间充质干细胞进行体外培养后，HE染色试验。在2周开始，体外培养新生细胞在人工肌腱支架上附着并大量分裂。此时的细胞数量虽多，但是分布紊乱，没有条理。经6周后，细胞数量开始减少；8周后，细胞数量趋于稳定，而细胞排布也开始向受力方向有条理地排列；在12周，体外培养新生细胞数量与天然肌腱细胞数量相近，细胞也显现出向受力方向排列，如图1所示。

(2)人工肌腱支架附上种子细胞培养的免疫组化:

人工肌腱支架附上骨髓间充质干细胞进行体外培养后，免疫组化试验。在4周胶原蛋白Ⅰ型开始大量表达，并在12周达到天然肌腱水平。在12周，体外培养新生细胞的胶原蛋白Ⅰ型程度已经和天然肌腱相当接近，如图2所示。

体外培养新生细胞在4周开始，胶原蛋白Ⅲ型有少量表达。到8周，胶原蛋白Ⅲ型才开始大量表达。在12周，体外培养新生细胞的胶原蛋白Ⅲ型表达，如图3所示。

一种细菌纤维素膜组织工程化人工肌腱支架的制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。