专利摘要
本发明公开了一株肠杆菌Kosakoniacowanii，菌株号LT‑1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的保藏号为CCTCCNo：M2017850，保藏日期为2017年12月29日。本发明还公开了肠杆菌在合成2,3‑丁二醇中的应用。该菌株以葡萄糖为碳源，酵母粉为氮源发酵合成2,3‑丁二醇的产量可达到42.56～212.49g/L。本发明的优点在于，发酵合成2,3‑丁二醇所使用的菌株为：肠杆菌K.cowaniiLT‑1，该菌株的发酵特点在于，发酵合成2,3‑丁二醇产量高，副产物少，不仅降低了生产成本而且还有利于2,3‑丁二醇的纯化。本发明所述操作方法简单，成本较低，极具工业化推广应用前景，同时为2,3‑丁二醇的生物合成提供一种新工艺。
权利要求
1.一株肠杆菌在制备2,3-丁二醇的应用，其特征在于，该菌株命名为肠杆菌
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌株活化：
（2）种子培养：
（3）发酵培养：将种子液接种到发酵培养基，发酵42~ 84 h，可得含有2,3-丁二醇的发酵液；
所述发酵培养基包括如下组分：碳源80~140 g/L，氮源4~8 g/L，金属盐1~2.5 g/L， pH值7.0~7.2，余量为水；
所述碳源为甘油、葡萄糖、乳糖的任意一种或几种的组合；所述氮源为牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、黄豆粉、小麦胚芽粉、花生饼粉、酵母粉中的任意一种或几种的组合；金属盐为硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锰、氯化钙、硝酸钠中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，菌株活化的培养条件如下：
将肠杆菌
斜面培养基：蛋白胨20 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠 10 g/L，琼脂粉20 g/L，自来水配制，调整pH值至7.0~7.2，121 °C灭菌20 min；
固体种子培养基：碳源10~30 g/L，氮源4~8 g/L，金属盐1.0~2.5 g/L，琼脂粉20 g/L，余量为水，pH 7.0~7.2。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，种子培养包括如下步骤：将活化菌种接种到液体种子培养基中，温度24~36 °C，震荡培养24~48 h，得到发酵种子液；
液体种子培养基：碳源10~30 g/L，氮源4~8 g/L，金属盐1.0~2.5 g/L，余量为水，pH7.0~7.2。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述发酵的温度为28~38 °C。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，发酵时，摇瓶接种量为摇瓶中培养基的体积分数的1~10%；发酵罐接种量为发酵罐中培养基的体积分数的1~30%；发酵罐发酵方式为分批补料法。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述2,3-丁二醇的提取方法如下：取发酵液，离心除去菌体，进行减压蒸馏获得2,3-丁二醇体积分数为30%~50%的浓缩液，然后加入与浓缩液等体积的K2HPO4-乙醇溶液，所述K2HPO4-乙醇溶液中K2HPO4质量分数为45%，形成双相体系，取上相中的溶液进行蒸馏，得到2,3-丁二醇。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用含有2,3-丁二醇的发酵液提取2,3-丁二醇的方法为盐析萃取法。
说明书
技术领域
本发明具体涉及一株肠杆菌株及其在合成2,3-丁二醇中的应用，属于微生物学、生 物工程技术和化工技术领域。
背景技术
2,3-丁二醇(2,3-Butanediol)是一种极具价值的液体燃料，燃烧值仅次于乙醇且高 于甲醇，达27,200kJ/kg；2,3-丁二醇也是一种极有潜力的化工原料，可用于生产抗冻剂、 高级航空油；2,3-丁二醇可以清除自由基、阻断过氧化反应，因而被广泛地应用于化妆品、洗液等行业；此外，2,3-丁二醇还可以用作高价值香料的食品添加剂和医药中间体。
随着石油需求量的不断增加，而石油又作为不可再生的能源。因此，用人工生产方法获取石油产品，将为社会发展提供一种新的能源开发思路。2,3-丁二醇主要的生产方 法有化学合成法和生物发酵法。化学合成法生产2,3-丁二醇是以石油裂解时产生的四碳 类氢化合物在高温、高压下水解生成，该方法生产成本高、过程繁琐不易操作、副产物 多，因此难以大规模工业化生产，从而限制2,3-丁二醇的开发应用。而本发明的肠杆菌K.cowanii LT-1能够通过微生物发酵技术生产2,3-丁二醇，不仅克服了化学生产成本高、不易操作的困难，而且利用微生物合成发酵生产2,3-丁二醇更加经济化、更具有环保意义。
经检索，目前未见有使用肠杆菌K.cowanii发酵生产2,3-丁二醇的专利报道。
发明内容
针对于现有技术不足，本发明解决的问题是：提供了一株肠杆菌K.cowanii LT-1及 其所述菌在制备2,3-丁二醇中的应用。
本发明还要解决的技术问题是提供上述肠杆菌的应用。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下：
发明人在2017年从酒糟中筛选得到一株肠杆菌，菌株号为Kosakonia cowaniiLT-1， 已保藏于“中国典型培养物保藏中心”(简称CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市，洪 山区八一路，武汉大学山国典型培养物保藏中心，邮编：430072，登记入册的保藏号为 CCTCCNo：M 2017850，保藏日期为2017年12月29日。
以下内容均以此菌株作为生产菌株。
1、菌落形态学特征与生理生化特性见表1。
表1菌落形态学特征与生理生化特性
2、16S rDNA序列分析：
测得菌株的16S rDNA基因的核普酸序列长度为1388bp，其基因序列如SEQID No.1：所示。将所测序列从Gene Bank数据库中使用BLAST程序进行同源性比较，构建 16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与肠杆菌HME8565达到100％ 同源性。根据菌株形态学观察和生理生化实验分析结果认定本发明所使用的是肠杆菌， 具体为肠杆菌K.cowanii LT-1。
上述肠杆菌K.cowanii LT-1在发酵合成2,3-丁二醇的应用也在本发明的保护范围之 内。
具体的应用方法为，将肠杆菌LT-1接种于斜面固体培养基，转接到种子培养基，最后接种于发酵培养基中进行好氧培养，发酵液中富含有2,3-丁二醇。
本发明所述肠杆菌K.cowanii LT-1及其所述菌在制备2,3-丁二醇的应用，依次包括 以下步骤：
1.培养基的配制：
(1)斜面培养基成分为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10 g/L，琼脂粉20g/L，自来水配制，调整pH值至7.0～7.2，115℃灭菌20min；
(2)液体种子培养基为：碳源10～30g/L，氮源4～8g/L，金属盐1.0～2.5g/L，自来水配制，调整pH值至7.0～7.2，115/121℃灭菌20min；
(3)富集液体培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉8g/L，硝酸钠3g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化钙0.2g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂粉20g/L，自来水配制， 调整pH值至7.0～7.2，115℃灭菌20min；
(4)富集固体培养基为：富集液体培养基、琼脂粉20g/L，自来水配制，调整pH 值至7.0～7.2，115℃灭菌20min；
(5)固体种子培养基为：液体种子培养基，琼脂粉20g/L，自来水配制，调整pH 值至7.0～7.2，115/121℃灭菌20min；
(6)发酵培养基：葡萄糖140g/L，酵母粉6g/L，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾0.3g/L， 氯化钙0.3g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.04g/L，自来水配制，pH值调至7.0～7.2，115℃ 灭菌20min；
2.菌种选择：
选已保藏菌株肠杆菌K.cowanii LT-1
3.菌种活化：
将肠杆菌K.cowanii LT-1菌种接种于斜面培养基，24～36℃静置培养24～36h，再次挑取单菌落划线到普通固体培养基上，24～36℃培养24～36h，得到活化菌种备用；
4.摇瓶发酵种子液培养：
取步骤3中活化好的菌种，无菌条件下接种2～4环于种子液的摇瓶中，置于转速为220rpm的摇床上，温度为28～38℃培养24h，得到发酵种子液；
5.发酵培养：
摇瓶发酵培养：将上述发酵种子液在无菌条件下以4％～10％体积比的接种量，将种 子液接种于发酵培养基摇瓶中，置于转速为220rpm的摇床上，28～38℃培养36～48h；当发酵液中丁二醇浓度不再上升时，停止发酵；
6.2,3-丁二醇的提取：
取步骤5中的发酵液，离心除菌后对清液进行减压蒸馏，获得30～55％的浓缩液，再加入等体积的45％的K2HPO4/乙醇体系，形成双相体系，将上相中的溶液进行蒸馏， 得2,3-丁二醇。
7.2,3-丁二醇含量测定：
取步骤5中的发酵液，12,000rpm离心20min除去菌体，上清用0.22μm的滤膜过 滤，置于进样瓶中待用。样品采用示差检测器检测，色谱柱：Aminex HPX-87H(300× 7.8mm)；流动相：0.05M的H2SO4；流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：60℃。
有益效果：本发明具有如下优势：
(1)本发明筛选得到一株产2,3-丁二醇的菌株，该菌株能够以葡萄糖为碳源、酵母粉氮源，发酵合成2,3-丁二醇，副产物少，有利于2,3-丁二醇的纯化，社会和经济效 益显著。
(2)该菌株发酵合成2,3-丁二醇的产量可达到42.56～212.49g/L，葡萄糖转化率最 高达62.50％，大大降低了生产成本低，而且操作简单，这对于2,3-丁二醇的生产和拓展应用具有十分重要的意义。
附图说明
图1为肠杆菌LT-1的16S rDNA PCR纯化琼脂糖凝胶电泳图(A)和肠杆菌LT-1 的系统发育树(B)。
图2为肠杆菌LT-1产2,3丁二醇高效液相色谱图。
图3为肠杆菌LT-1产2,3-丁二醇的红外光谱图。
图4为肠杆菌LT-1摇瓶水平合成2,3-丁二醇进程曲线。
图5为50L发酵罐分批补料合成2,3-丁二醇进程曲线。
图6为1t发酵罐分批补料合成2,3-丁二醇进程曲线。
具体实施方式：
可以根据下列实施例更好的理解本发明，然而本领域的技术人员容易理解，实施例 所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发 明。
实施例1：肠杆菌K.cowanii LT-1的分离筛选。
该实施例所用培养基的组成如下：
液体筛选培养基：葡萄糖20g/L，硝酸钠3g/L，氯化铁0.2g/L，磷酸氢二钾2g/L， 氯化钙0.1g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0.05g/L，自来水配制，pH值调至7.0～7.2，115℃ 灭菌20min；
固体筛选培养基：液体筛选培养基、琼脂粉20g/L、pH值调至7.0～7.2、115℃灭 菌20min；
发酵培养基：葡萄糖140g/L，酵母粉6g/L，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾0.3g/L， 氯化钙0.3g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.04g/L，自来水配制，pH值调至7.0～7.2，115℃ 灭菌20min；
该实施例的具体操作过程如下：
从60份来自全国各地的酒糟中筛选2,3-丁二醇产生菌，各取1g分别加入装有富集培养基的三角瓶中，装液量为50mL/250mL，在37℃条件下，置于摇床以220rpm， 富集培养48h。取1mL培养液转接到相同的液体富集培养基中相同条件下进行第二次 富集培养，培养48h。在无菌条件下，将培养液稀释到10
实施例2：肠杆菌K.cowanii LT-1及发酵产物2,3-丁二醇的鉴定。
①肠杆菌K.cowanii LT-1的鉴定
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株LT-1的基因组DNA，以上游引物27F 和下游引物1492R PCR扩增16S rDNA序列如图1A所示，将PCR扩增后产物进行胶回 收纯化，将胶回收纯化产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。测序所得菌株 的16S rDNA基因的核普酸序列长度为1388bp，其基因序列如SEQID No.1所示。将测 序结果与Gene Bank数据库中已知16S rDNA序列进行BLAST比对，并使用BLAST程 序进行同源性比较，构建16SrDNA全序列为基础的系统发育树。结果显示：该菌株与 肠杆菌K.cowanii HME8565达到100％同源性(图1B)。根据菌株形态学观察和生理 生化实验分析结果认定本发明所使用的是肠杆菌，具体命名为肠杆菌K.cowanii LT-1。
②肠杆菌K.cowanii LT-1发酵产物的鉴定
采用液相色谱(HPLC)和红外光谱仪来鉴定发酵液中是否含有2,3-丁二醇。取肠杆菌K.cowanii LT-1发酵液，12,000rpm离心20min，上清用0.22μm的滤膜过滤，置 于进样瓶中待用。样品采用示差检测器检测，色谱柱：Aminex HPX-87H(300×7.8mm)； 流动相：0.05M的H2SO4；流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：60℃。提纯后 产物的液相色谱如图2所示，在相同色谱条件下，该物质与2,3-丁二醇标准品对比，在 同一处均有吸收峰出现，说明发酵液中含有2,3-丁二醇。
利用红外光谱仪测定K.cowanii LT-1发酵2,3-丁二醇提纯产物的红外图谱，制样后 用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm
实施例3：肠杆菌LT-1发酵合成2,3-丁二醇碳源种类的优化
本实施例说明不同种类的碳源对菌株发酵制备2,3-丁二醇的影响，将种子培养液以 4％(v/v)的接种量分别接种于含100g/L甘油、葡萄糖、乳糖、柠檬酸盐的发酵培养基中，初始pH值为7.2，于26～34℃，220rpm振荡培养，发酵培养基装液量为50mL/250mL 三角瓶，发酵培养42h，取各种不同碳源发酵液进行步骤7的操作，计算2,3-丁二醇的 含量。以葡萄糖为碳源所得2,3-丁二醇含量最高，因此选用葡萄糖为最佳碳源。2,3-丁 二醇产量达到42.56g/L，葡萄糖转化率为42.56％，最大生产率高达1.01g/L/h，且发酵 液中乙偶姻浓度仅为0.83g/L。
实施例4：肠杆菌LT-1发酵合成2,3-丁二醇葡萄糖浓度的优化
本实施例说明不同葡萄糖浓度对菌株发酵制备2,3-丁二醇的影响，将种子培养液以 4％(v/v)的接种量分别接种于葡萄糖含量为100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L、160g/L的发酵培养基中，初始pH值为7.2，于32℃，220rpm振荡培养42h， 发酵培养基装液量为50mL/250mL三角瓶，取葡萄糖各个含量的发酵液，进行步骤7 操作，计算2,3-丁二醇的含量，测得当葡萄糖的浓度为140g/L时，2,3-丁二醇的含量最 高，因此选用葡萄糖的浓度为140g/L进行发酵。2,3-丁二醇产量达到60.04g/L，葡萄 糖转化率为42.89％，最大生产率高达1.43g/L/h，且发酵液中乙偶姻浓度仅为1.03g/L。
实施例5：肠杆菌LT-1发酵合成2,3-丁二醇氮源种类的优化
本实施例说明不同种氮源对菌株发酵制备2,3-丁二醇的影响，将种子培养液以4％(v/v)的接种量分别接种于5g/L牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、花生粉、 黄豆粉、小麦胚芽粉、酵母粉的发酵培养基中，初始pH值为7.2，于32℃，220rpm 振荡培养，发酵培养基装液量为50mL/250mL三角瓶，发酵培养42h，取各种氮源发 酵液进行步骤7的操作，计算2,3-丁二醇的含量，以酵母粉为氮源时2,3-丁二醇含量最 高，因此选用酵母粉为最佳氮源。2,3-丁二醇产量达到62.24g/L，葡萄糖转化率为44.46％， 最大生产率高达1.48g/L/h，且发酵液中乙偶姻浓度仅为1.12g/L。
实施例6：肠杆菌LT-1发酵合成2,3-丁二醇酵母粉浓度的优化
本实施例说明不同酵母粉浓度对菌株发酵制备2,3-丁二醇的影响，将种子培养液以 4％(v/v)的接种量分别接种于含1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、 9g/L、10g/L酵母粉的发酵培养基中，初始pH值为7.2，于32℃，220rpm振荡培养， 发酵培养基装液量为50mL/250mL三角瓶，发酵培养42h，取各个浓度酵母粉发酵液 进行步骤7的操作，计算2,3-丁二醇的含量。当酵母粉浓度为6g/L时2,3-丁二醇含量 最高，因此选用6g/L的酵母粉进行发酵。2,3-丁二醇产量达到64.21g/L，葡萄糖转化 率为45.86％，最大生产率高达1.53g/L/h，且发酵液中乙偶姻浓度仅为1.38g/L。
实施例7：肠杆菌LT-1发酵合成2,3-丁二醇温度的优化
本实施例说明不同温度对微生物发酵制备2,3-丁二醇产量的影响，将种子培养液4％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，初始pH值为7.2，于220rpm振荡培养，培养基 装液量为50mL/250mL三角瓶，发酵培养42h，培养温度分别为24℃、26℃、28℃、 30℃、32℃、34℃、36℃不同的温度，取各个温度的发酵液进行步骤7的操作，计 算2,3-丁二醇的含量，得出当温度为32℃时2,3-丁二醇含量最高，因此选用32℃为 最佳发酵温度。2,3-丁二醇产量达到65.24g/L，葡萄糖转化率为46.60％，最大生产率高 达1.55g/L/h，且发酵液中乙偶姻浓度仅为1.41g/L。
实施例8：肠杆菌LT-1发酵合成2,3-丁二醇pH的优化
本实施例说明不同pH值对菌株发酵制备2,3-丁二醇的影响，将种子培养液以4％(v/v) 的接种量接种于发酵培养基，温度为32℃，于220rpm振荡培养，培养基装液量为50mL/250mL三角瓶，培养pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0不同的 pH值的发酵培养基中，取各pH值下的发酵液进行步骤7的操作，通过标准曲线来计算 2,3-丁二醇的含量，得出当pH值为7.0时2,3-丁二醇含量最高，因此选用pH值7.0为 最佳发酵pH值。2,3-丁二醇产量达到66.44g/L，葡萄糖转化率为47.46％，最大生产率 高达1.58g/L/h，且发酵液中乙偶姻浓度仅为1.45g/L。
实施例9：肠杆菌LT-1发酵合成2,3-丁二醇的所需金属盐种类及其浓度的优化
本实施例说明不同金属盐及其浓度对菌株发酵制备2,3-丁二醇的影响，将种子培养 液以4％(v/v)的接种量分别接种于含有以下各金属盐浓度中，经过单因素变量实验如下：
硝酸钠：3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0g/L以及对照组，硝酸钠最佳浓度为6.0g/L；
磷酸二氢钾：0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L以及对照组，磷酸二氢钾最 佳浓度为0.3g/L；
氯化钙：0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L以及对照组，氯化钙最佳浓度为0.30g/L；
硫酸镁：0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60g/L以及对照组，硫酸镁最佳浓度为0.50g/L；
硫酸锰0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06g/L以及对照组，硫酸锰最佳浓度为0.04g/L；
对于不同实验组的发酵培养基，不同浓度的金属盐设置3组平行对照，初始pH值为7.0，于32℃，220rpm振荡培养，培养基装液量为50mL/250mL三角瓶，发酵培养 42h，取各金属盐浓度下的发酵液进行步骤7的操作计算2,3-丁二醇的含量，当在上述 条件下，菌株产2,3-丁二醇含量最高达到68.41g/L，葡萄糖转化率为48.86％，最大生 产率为1.63g/L/h，且发酵液中乙偶姻浓度仅为1.50g/L(图4)。
实例10：50L发酵罐分批补料合成2,3-丁二醇
将肠杆菌K.cowanii LT-1种子液按体积比为10％的接种量接入无菌发酵培养基中， 发酵罐总装液量为30L，发酵温度为32℃，搅拌转速400rpm，通气量为1.2vvm进行 发酵；发酵初始pH值为7.0，发酵过程控制pH值在7.0；发酵时间为84小时。每隔6 小时取样测定发酵液中的2,3-丁二醇浓度。测定分析：取上述发酵液，12,000rpm离心2分钟，取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2,3-丁二醇产量达到201.35g/L，葡萄糖转 化率为59.22％，最大生产率高达2.40g/L/h，且发酵液中乙偶姻浓度为3.26g/L(图5)。
实例11：1t发酵罐分批补料合成2,3-丁二醇
将肠杆菌K.cowanii LT-1种子液按体积比为10％的接种量接入无菌发酵培养基,发 酵罐总装液量为30L，发酵温度为32℃，搅拌转速300rpm，通气量为1.2vvm进行发 酵；发酵初始pH值为7.0，发酵过程控制pH值在7.0；发酵时间为84小时。每隔6小 时取样测定发酵液中的2,3-丁二醇浓度。测定分析：取上述发酵液，12,000rpm离心2 分钟,取上清液稀释合适倍数检测发酵液中2,3-丁二醇产量达到212.49g/L，葡萄糖转化 率为62.50％，最大生产率高达2.53g/L/h，且发酵液中乙偶姻浓度仅为3.46g/L(图6)。
最后，还需注意的是，以上列举仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明的内容直接导出或联 想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110>常熟理工学院
<120>一株肠杆菌株及其在合成2,3-丁二醇中的应用
<160>1
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>2
<211>1388
<212>DNA
<213>肠杆菌LT1(Kosakonia cowanii)
<400>2
acggtaacag gaagcagctt gctgcttcgc tgacgagtgg cggacgggtg agtaatgtct60
gggaaactgc ctgatggagg gggataacta ctggaaacgg tagctaatac cgcataacgt 120
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一株肠杆菌株及其在合成2,3-丁二醇中的应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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