专利摘要

本发明公开了一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明将来源于普通变形杆菌ProteusvulgarisATCC33420的硫酸软骨素ABC裂解酶进行异源表达，选取pPIC9K载体，通过甲醇进行诱导，实现了硫酸软骨素ABC裂解酶在毕赤酵母GS115中的分泌表达，并通过设计的硫酸软骨素ABC裂解酶‑酶膜反应器实现了小分子硫酸软骨素的高效连续生产，并使硫酸软骨素ABC裂解酶得到了循环利用，大大降低了生产成本。本发明以食品级酵母菌作为宿主菌株，安全可靠，为工业化绿色生产小分子硫酸软骨素A、B和C提供了有效的参考与借鉴，同时节能减排，经济效益和社会效益显著。

权利要求

1.一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌，其特征在于，该重组酵母菌中导入了硫酸软骨素ABC裂解酶基因，所述硫酸软骨素ABC裂解酶基因的核苷酸序列如SEQID NO. 1所示；

包括如下步骤：将SEQID NO. 1所示的硫酸软骨素ABC裂解酶基因导入pPIC9K质粒，得到重组质粒，将重组质粒转化酵母菌，既得到产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌；

所述的酵母菌为毕赤酵母Pichia pastoris GS115。

2.权利要求1所述产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌在制备硫酸软骨素ABC裂解酶、小分子硫酸软骨素中的应用。

3.一种小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 小分子硫酸软骨素制备：

将大分子硫酸软骨素A粉末配置成水溶液，泵入酶膜反应器的降解反应釜（10）中，向其中加入硫酸软骨素ABC裂解酶，使硫酸软骨素ABC裂解酶的总酶活与硫酸软骨素质量的比例为1 × 104 ~ 6 × 104 U：1 kg，控制转速50 ~ 200 rpm，温度20 ~ 40 °C；当降解反应进行0.5 ~ 1.5 h后，开启酶膜反应器的超滤膜系统（12），小分子硫酸软骨素透过超滤膜进入浓缩釜（13）中，大分子硫酸软骨素被截留返回到降解反应釜（10）中继续降解，硫酸软骨素ABC裂解酶则被截留返回到降解反应釜（10）中循环利用；当浓缩釜（13）中料液体积是浓缩釜体积的1/3时开启纳滤系统（14），水分子透过纳滤膜进入降解反应釜（10）中被循环利用，小分子硫酸软骨素被截留返回到浓缩釜（13）中继续浓缩；

(2) 除菌：对步骤(1)浓缩釜（13）中得到的纳滤截留液进行除菌处理，得到无菌滤液；

(3) 浓缩：将步骤(2)得到无菌滤液通过三效浓缩器浓缩，得到无菌浓缩液；

(4) 干燥：将步骤(3)得到的无菌浓缩液加入喷雾干燥塔内，进风温度185 °C，出风温度90 °C，进行干燥，得到小分子硫酸软骨素成品。

4.根据权利要求3所述小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，所述硫酸软骨素ABC裂解酶按照如下方法制备：

将权利要求1所述的产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌YPD液体培养基中，28 °C过夜培养至OD660值在3 ~ 8，离心，收集菌泥；用产酶培养基重悬重组酵母细胞，每天补加0.5~ 3%的甲醇，28 °C，220 rpm条件下培养3 ~ 7天；

所述产酶培养基的配方如下：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，3 g/L K2HPO4，12 g/LKH2PO4，13.4 g/L无氨基酸酵母氮源， 4 × 10-4 g/L生物素，甲醇5 mL/L。

5.根据权利要求3所述小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，所述的酶膜反应器包括如下部件：

降解反应釜（10）、超滤膜组件（12）、浓缩釜（13）和膜过滤组件（14）；

所述降解反应釜（10）包括：夹套（8-1）、第一搅拌桨（9-1）、第一电机（2-1）、第一温度传感器（1-1），所述夹套（8-1）包覆在降解反应釜（10）的外部，所述第一搅拌桨（9-1）与第一电机（2-1）连接，所述第一搅拌桨（9-1）、第一温度传感器（1-1）伸入降解反应釜（10）的内部，所述降解反应釜（10）的上部设有反应液出口管道，所述反应液出口管道与超滤膜组件（12）的一端连接，所述反应液出口管道上设有料液出口（15-1）；

所述超滤膜组件（12）包括：超滤液进口（12-1）、超滤液出口（12-2），所述超滤膜组件（12）内设有超滤膜，所述超滤膜的孔径为1000 Da、2000 Da、2500 Da、3000 Da或者5000Da，所述超滤液进口（12-1）与反应液出口管道连接，所述超滤液出口（12-2）通过管道与浓缩釜（13）连接，所述超滤膜组件（12）上设有超滤回流出口（16），所述超滤回流出口（16）通过管道与降解反应釜（10）连接；

所述浓缩釜（13）包括：夹套（8-2）、第二搅拌桨（9-2）、第二电机（2-2）、第二温度传感器（1-2），所述夹套（8-2）包覆在浓缩釜（13）的外部，所述第二搅拌桨（9-2）与第二电机（2-2）连接，所述第二搅拌桨（9-2）、第二温度传感器（1-2）伸入浓缩釜（13）的内部，所述浓缩釜（13）上设有清水进入管道（7）；

所述膜过滤组件（14）包括进口（14-1）和出口（14-2），所述膜过滤组件（14）中设有纳滤膜或超滤膜，所述纳滤膜的孔径为300 Da ~ 1000 Da，所述超滤膜的孔径为10 KDa ~ 50kDa；所述膜过滤组件（14）的进口（14-1）通过管道与浓缩釜（13）连接。

6.根据权利要求3所述小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，所述除菌处理，是利用0.01 ~ 0.10 μm金属过滤器进行过滤除菌。

7.根据权利要求3所述小分子硫酸软骨素的生产方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的三效浓缩器浓缩，其浓缩条件为：一效温度80 ~ 90℃，二效温度75 ~ 85℃，三效温度60 ~70℃，真空度为0.03 ~ 0.06 MPa。

一株产硫酸软骨素ABC裂解酶的重组酵母菌及其构建方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。