专利摘要

快速检测微囊藻毒素的丝网印刷电极免疫传感器的制备及检测方法，属于环境监测技术领域。所述丝网印刷电极通过电极下面的磁铁形成的磁场将核壳磁性纳米微粒Fe3O4Au固定在工作电极表面，再通过纳米金和微囊藻毒素抗体之间的吸附作用，将抗体固定在电极表面，制得MCLR抗体电极，取一定浓度的MCLR和辣根过氧化物酶标记的MCLR共同修饰在工作电极表面，免疫反应进行一段时间后，采用DPV进行峰电流值测得，得到MCLR与氧化峰电流的标准曲线，然后将待测水样重复上述步骤，得到的氧化峰电流与标准曲线比较，即可得到MCLR浓度。本发明有利于快速检测MCLR，水样不必提纯处理，简单快捷，降低检测成本。

权利要求

1.一种快速检测MCLR的丝网印刷电极免疫传感器的制备方法，具体通过以下步骤来实现：

在聚氯乙烯薄膜（PVC）上印刷三根导电银浆，其中一端作为电极端，另一端作为引线端，最边上的一根导电银浆其电极端长于其他两根导电银浆的电极端，90℃固化30min；然后在导电银浆上印刷碳浆油墨，其中边上导电银浆较长的电极端不印刷碳浆油墨，其他的两根导电银浆在超出电极端的部分还印刷有碳浆油墨，90℃固化15min；然后继续印刷绝缘油墨覆盖除三个电极端以及引线端以外的部分，即其中电极端未覆盖碳浆油墨的导电银浆、超出电极端只印刷有碳浆油墨和引线端不印刷绝缘油墨，其他地方均印刷有绝缘油墨，90℃固化10min；将上述的丝网印刷电极固定在磁铁表面，滴涂一层核壳型Fe₃O₄Au磁性复合纳米颗粒于上述中间电极的表面进行修饰，室温干燥，至完全晾干；再将MCLR抗体滴涂于上述核壳型Fe₃O₄Au磁性复合纳米颗粒修饰过的电极表面，室温保湿孵育3小时，制得抗体电极，采用含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）淋洗抗体电极，氮气吹干，滴加牛血清白蛋白于上述抗体电极表面，室温保湿孵育，封闭30分钟，制得丝网印刷电极免疫传感器。

2.按照权利要求1的方法，其特征在于，中间导电银浆的电极端只印刷有碳浆油墨的部分为圆形状的，两边上的电极端未覆盖碳浆油墨的导电银浆的部分和电极端只印刷有碳浆油墨的部分形成不连接的圆环。

3.利用权利要求1或2的的方法得到的丝网印刷电极免疫传感器快速检测MCLR的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）用0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）淋洗抗体电极，氮气吹干，取不同浓度的MCLR标准溶液与10mg/L辣根过氧化物酶标记的MCLR（MCLR-HRP）分别滴加到免疫工作电极表面，室温孵育20min，用二次水冲洗，氮气吹干；

（2）将上述反应过的电极放入含有H₂O₂和对苯二酚（HQ）的pH为7.0的PBS中，其中H₂O₂的浓度为1mmol/L，对苯二酚（HQ）的浓度1mmol/L，PBS的浓度为0.1mol/L中，反应20s后，采用示差脉冲伏安法（DPV）进行峰电流值的测定，电位扫描范围为-0.2V至0.8V，脉冲振幅50mV，脉冲宽度50ms，得到一条MCLR与氧化峰电流的标准曲线；

（3）将MCLR标准溶液替换为待测的水样重复步骤（1）和（2）得到峰电流值，再与步骤（2）得到的标准曲线进行比较，即可得到MCLR的浓度。

说明书

技术领域

本发明属于环境监测技术领域，具体涉及一种用于检测微囊藻毒素-（亮氨酸-精氨酸）（Microcystin-(leucine-arginine），MCLR）的复合磁性纳米材料修饰的丝网印刷电极免疫传感器。

背景技术

微囊藻毒素（Microcystins,MCs）是由蓝藻水华产生的一种毒性极强、急性危害巨大的七肽单环肝毒素，其分子存在着环状结构和间隔双键，具有相当的稳定性。它对蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2A具有抑制作用，而且也具有强烈的致肝癌作用，其中MCLR是最常见、急性毒性最强的微囊藻毒素之一。随着中国水体的富营养化程度逐渐加剧，蓝藻水华的发生也逐渐增加。80%的蓝藻水华都可以检测出次生代谢产物—微囊藻毒素，它对水体环境和人群健康的危害已成为全球关注的重大环境问题之一。由于MCs易溶于水，结构稳定，且300℃高温不分解，易通过饮用水等途径进入人体，危害人体健康，所以发展一种快速、灵敏、高效的分析检测方法就显得极为重要。

目前，检测MCLR的传统技术主要有高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用技术，这些方法虽然灵敏度高，但是需要对样品进行预处理，操作步骤繁琐，且需要昂贵的仪器及专业的技术人员。植物细胞的生物测试法和蛋白磷酸酶抑制法灵敏度都较低。酶联免疫吸附法虽然灵敏度较高，但是其线性范围较窄。

电化学免疫传感器结合免疫分析的高特异性和电化学检测的高灵敏度，具有操作简单、实验微型化、样品用量小、检测速度快等优点而备受关注。近年来，在电化学传感技术研究领域，为了提高电子转移速度、放大检测信号、提高检测灵敏度，纳米材料作为电极的修饰剂已得到广泛应用。其中，Fe₃O₄核Au壳型（Fe₃O₄Au）磁性复合纳米材料以其独特的电化学性质、良好的稳定性和生物相容性以及Fe₃O₄的超顺磁性等特征，在电化学免疫传感器的研究上具有重要的应用价值。而丝网印刷电极（SPE）应用于制作电化学生物传感器已经成为检测环境污染物的常用的方法，其具有制作简单、价格低廉、可批量生产、便于携带、可一次性使用等优点，避免了共用同一支电极检测多个样品时的交叉干扰问题。

本方法是利用磁性复合纳米材料修饰SPE，应用于电化学检测，具有操作费用低、便于携带、适于现场检测，同时具有检测速度快和灵敏度高等优点。目前，利用核壳型Fe₃O₄Au磁性纳米复合材料修饰的SPE来检测MCLR的相关技术和方法尚未见报的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种丝网印刷免疫传感器及检测MCLR的方法。本方法采用核壳型Fe₃O₄Au磁性复合纳米材料修饰丝网印刷电极。本发明中的丝网印刷电极，是在银导电基线上覆盖一层碳浆，可以避免高温时绝缘浆对导电银层的影响，从而提高导电性。核壳型Fe₃O₄Au磁性复合纳米颗粒有较大的比表面积，可以提高电子转移速度从而提高传感器的灵敏度，其表面的纳米金材料有良好的生物相容性，可以有效且简便地固定抗体，另外，Fe₃O₄的超顺磁性特征使得抗体可以通过外加磁场极其方便的固定在工作电极表面。

本发明公开了一种快速检测MCLR的丝网印刷电极免疫传感器的制备方法，具体通过以下步骤来实现：

在聚氯乙烯薄膜（PVC，图1A）（优选0.5mm厚）上印刷三根导电银浆（图1），其中一端作为电极端，另一端作为引线端，最边上的一根导电银浆其电极端长于其他两根导电银浆的电极端，90℃固化30min；然后在导电银浆上印刷碳浆油墨，其中边上导电银浆较长的电极端不印刷碳浆油墨，其他的两根导电银浆在超出电极端的部分还印刷有碳浆油墨（图1C），90℃固化15min；然后继续印刷绝缘油墨覆盖除三个电极端以及引线端以外的部分，即其中电极端未覆盖碳浆油墨的导电银浆、超出电极端只印刷有碳浆油墨和引线端不印刷绝缘油墨，其他地方均印刷有绝缘油墨（图1D），90℃固化10min；将上述的丝网印刷电极（图1E）固定在磁铁表面，滴涂一层核壳型Fe₃O₄Au磁性复合纳米颗粒于上述中间电极的表面进行修饰，室温干燥，至完全晾干；再将MCLR抗体滴涂于上述核壳型Fe₃O₄Au磁性复合纳米颗粒修饰过的电极表面，室温保湿孵育3小时，制得抗体电极，采用含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）淋洗抗体电极，氮气吹干，滴加牛血清白蛋白（优选质量浓度1%）于上述抗体电极表面，室温保湿孵育，封闭30分钟，制得丝网印刷电极免疫传感器。

优选中间导电银浆的电极端只印刷有碳浆油墨的部分为圆形状的（图1E2），两边上的电极端未覆盖碳浆油墨的导电银浆的部分(图1E1)和电极端只印刷有碳浆油墨的部分(图1E2)形成不连接的圆环。

利用上述所述的丝网印刷电极免疫传感器快速检测微囊藻毒素的方法,其特征在于，包括以下步骤：

（1）用0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）淋洗抗体电极，氮气吹干，取不同浓度的MCLR标准溶液与10mg/L辣根过氧化物酶标记的MCLR（MCLR-HRP）分别滴加到免疫工作电极表面，室温孵育20min，用二次水冲洗，氮气吹干；

（2）将上述反应过的电极放入含有H₂O₂和对苯二酚（HQ）的PBS（pH7.0）中，其中H₂O₂的浓度为1mmol/L，对苯二酚（HQ）的浓度1mmol/L，PBS的浓度为0.1mol/L中，反应20s后，采用示差脉冲伏安法（DPV）进行峰电流值的测定，电位扫描范围为-0.2V至0.8V，脉冲振幅50mV，脉冲宽度50ms，得到一条MCLR与氧化峰电流的标准曲线。

（3）将MCLR标准溶液替换为待测的水样重复步骤（1）和（2）得到峰电流值，再与步骤（2）得到的标准曲线进行比较，即可得到MCLR的浓度。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：丝网印刷电极制备简单，加工方便，成本低，一次性使用避免了共用同一支电极检测多个样品时的交叉干扰问题。本发明使用核壳型Fe₃O₄Au磁性复合纳米颗粒对丝网印刷电极进行表面修饰，依靠磁铁提供的磁场直接将超顺磁性Fe₃O₄Au固定到工作电极表面，再通过纳米金和微囊藻毒素抗体（anti-MCLR）之间的吸附作用，将抗体固定在电极表面，采用直接竞争模式，检测MCLR，该方法简单快捷，灵敏度高，其检测限为0.38μg/L，还有利于实现MCLR的现场快速测定。

附图说明

图1为丝网印刷电极的结构示意图

图中A为PVC基底，B为银层，C为碳层，D为绝缘层，E为完整的丝网印刷电极，1为参比电极，2为工作电极，3为对电极，4为引线端。

图2为微囊藻毒素免疫传感器检测原理示意图

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

丝网印刷电极的结构及制备工艺

参见图1，本发明所用的丝网印刷电极，是在聚氯乙烯薄膜片上丝网印刷三个电极：一个是银伪参比电极1，一个是工作电极2，一个是对电极3。电极的另一端是三电极的引线端4。在三个电极引线端及三个电极以外的基片上，还覆盖有绝缘浆印制的绝缘层D。

首先将银浆缓慢搅拌均匀，通过丝网印刷技术制备并单独印刷到厚度为0.5mm的聚氯乙烯薄膜（图1A）上，置于烘箱中烘干，制成半环形参比电极及导电基轨（图1B）；然后再印刷半环形碳对电极及圆形的工作电极以及三个电极的引出线（图1C），最后在除上述工作电极、参比电极、对电极以及引线端以外的地方涂覆一层绝缘浆，形成绝缘层（图1D），制得丝网印刷电极（图1E）

上述丝网印刷电极尺寸：40×12mm，工作电极：r=1.5mm，引线端：6×3mm，对电极和参比电极：r_外=4.75mm，r_内=3.25mm。

微囊藻毒素免疫传感器的制备：

参见图2，首先，将丝网印刷电极工作电极固定在磁铁表面，用微量进样器吸取Fe₃O₄Au悬浊液，滴涂在工作电极表面，自然晾干成膜后，滴涂anti-MCLR溶液，并在湿盒中室温保湿孵育3h，用0.05%Tween-20的PBST淋洗，氮气吹干。取1%（W/V）BSA溶液封闭工作电极上裸露的Fe₃O₄Au表面，室温保湿孵育30min，以封闭电极表面存在的非特异性结合位点，再次用PBST溶液淋洗该修饰电极，氮气吹干后保存于4℃待用。

实施例3：检测微囊藻毒素的方法

本发明微囊藻毒素电化学传感器应用时，需要采用1台恒电位仪。首先，将10μL不同浓度的MCLR标准溶液与10μL 10mg/L MCLR-HRP分别滴加到免疫工作电极表面，室温孵育20min，用二次水冲洗，氮气小心吹干；然后，将该反应过的电极放入1mmol/L H₂O₂和1mmol/L HQ的0.1mol/L PBS（pH7.0）中，反应20s后，采用示差脉冲伏安法（DPV）进行测定，得到一条MCLR与氧化峰电流的标准曲线。然后对水样以同种方法检测，对比标准曲线得到水样中MCLR的浓度。电位扫描范围为-0.2V至0.8V，脉冲振幅50mV，脉冲宽度50ms。

快速检测微囊藻毒素的丝网印刷电极免疫传感器的制备及检测方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。