IPC分类号 : B01J23/75,B01J35/02,B01J35/10,B01J37/34,B01J37/08,G01N21/31
专利摘要
本发明公开具有高类过氧化物酶活性及稳定性的四氧化三钴微米带及其制备方法，一种具有高类过氧化物酶活性及稳定性的Co3O4微米带，所述微丝带是由Co3O4单晶颗粒相连形成的丝带状结构，该制备方法包括：首先将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解于乙醇中，待聚乙烯吡咯烷酮完全溶解后加入硝酸钴溶液，混合均匀，得到纺丝溶胶；然后将纺丝溶胶采用静电纺丝法进行纺丝，得到凝胶纤维，干燥；最后将干燥后的凝胶纤维进行分段煅烧得到Co3O4微米带。该微米带在用作过氧化物模拟酶时，能够在较宽的pH和温度范围内表现出活性；样品对H2O2和TMB表现出较好的亲和力；同时具有较高比表面积的微米带表现出较高的类过氧化物酶活性和稳定性。
说明书
技术领域
本发明属于无机材料技术领域，具体涉及一种具有高类过氧化物酶活性及稳定性的Co3O4微米带及其制备方法。
背景技术
过氧化物酶是广泛存在于生物体内的一类氧化还原酶，在生命活动过程中，主要参与催化生物体内的过氧化物分解，是生物防御体系的关键酶之一。天然过氧化物酶的结构复杂、价格昂贵以及它对热敏感、稳定性差和来源有限等缺点限制了它的规模开发和利用。目前广泛应用的过氧化物酶是从天然植物中提取的辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)，但HRP价格昂贵，且保存及使用条件苛刻，容易失活。模拟酶结构比天然酶简单，化学性质稳定，具有酶的催化活性且高效、高选择性、价格低廉。因此，寻找能够替代HRP的模拟酶是酶催化反应的热点。
为了寻找纳米材料模拟酶，科研工作者投入大量的精力，目前已报道的有Fe3O4、FeS、CeO2、Cu2O、Co3O4、CoFe2O4、氧化石墨烯、单壁纳米管及贵金属纳米粒子等等。但这些材料在用作模拟酶时存在以下问题：(1)通常高质量纳米材料的制备工艺比较复杂；(2)纳米材料自身的不稳定性导致在使用过程中颗粒表面氧化或者团聚，从而导致催化活性下降；(3)催化使用后，通常回收比较困难。这些问题的存在限制了其在实际中的应用。因此，发展一种简单、稳定、易回收、高活性的模拟酶是很有必要的。
与零维纳米材料相比，一维纳米材料由小的结构单元构成，从而赋予其开放的三维网络结构，通常存在多孔、高比表面积和较多的活性位。除此之外，在实际应用中，一维材料比较容易回收利用。因此制备一维材料可以解决模拟酶难回收的问题。静电纺丝技术以其操作简单、成本低廉等优点，被认为是制备一维纳米结构材料的简单有效的方法之一。同时，磁性材料在使用过程中表现出较好的重复性。基于以上考虑，制备一维磁性纳米材料可以很好地解决使用过程中难回收的问题。
发明内容
本发明采用静电纺丝结合煅烧的技术制备了一维的微米带，并研究了它的类过氧化物酶活性，该微米带表现出较好的活性和稳定性。
本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种具有高类过氧化物酶活性及稳定性的Co3O4微米带，所述微丝带是由Co3O4单晶颗粒相连形成的丝带状结构，所述Co3O4单晶颗粒的平均尺寸 为25.8～28.0nm，所述微丝带宽为1.3～2.5μm，厚度为0.4～0.8μm。
进一步，所述Co3O4微米带的BET比表面积为30～35m2/g，微丝带上的孔体积为0.15～0.18cm3/g，微丝带上的孔径为15～16nm。
本发明的第二个目的是提供上述Co3O4微米带的制备方法，包括以下步骤：
首先将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解于乙醇中，待聚乙烯吡咯烷酮完全溶解后加入硝酸钴溶液，混合均匀，得到纺丝溶胶；然后将纺丝溶胶采用静电纺丝法进行纺丝，得到凝胶纤维，干燥；最后将干燥后的凝胶纤维进行分段煅烧得到Co3O4微米带。
优选的，所述聚乙烯吡咯烷酮：乙醇：硝酸钴溶液的添加比例为1g：8～12mL：2～4mL。
其中，所述硝酸钴溶液中Co(NO3)2·6H2O的质量浓度为0.12～0.285g/mL。
进一步优选的：所述聚乙烯吡咯烷酮：乙醇：硝酸钴溶液的添加比例为1g：10mL：2mL，所述硝酸钴溶液中Co(NO3)2·6H2O的质量浓度为0.225g/mL。
优选的，所述静电纺丝的条件为：设置静电纺丝机的电压为18～22kV，接收距离为15～25cm，泵的推进速度为0.002～0.005mm/s。
进一步优选的，设置静电纺丝机的电压为20kV，接收距离为20cm，泵的推进速度为0.002mm/s。
优选的，所述干燥温度为70～90℃，时间至少为12h。
进一步优选的，所述干燥温度为80℃，时间为12h。通过干燥可以促使凝胶中的溶剂尽可能地挥发，防止煅烧过程中微米带的粘连。
优选的，所述煅烧条件为：在10～40℃以0.8～3C/min升至250～350℃，保温0.5～1.5h；然后以0.2～1℃/min升至350～450℃，保温1.5～2.5h。
进一步优选的，所述煅烧条件为：室温以1℃/min升至300℃，保温1h；然后以0.5℃/min升至400℃，保温2h。
本发明的三个目的是提供上述Co3O4微米带在制备过氧化物模拟酶中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明采用静电纺丝结合煅烧技术制备得到Co3O4微米带，该制备方法操作简单、成本低廉，得到的产物纯度高。
(2)本发明制备得到的材料具有丝带状结构，该丝带状结构具有较多孔结构和高比表面积以及较多的活性部位。
(3)本发明制备得到的微米带用作过氧化物模拟酶时，能够在较宽的pH和温度范围内表现出活性；样品对H2O2和TMB表现出较好的亲和力；同时具有较高比表面积的微米带表现出较高的类过氧化物酶活性和稳定性。
附图说明
图1：凝胶纤维的热重曲线(a)及纤维煅烧前后的红外光谱图(b)。
图2：本发明所得凝胶纤维的XRD图谱。
图3：凝胶纤维的扫描电镜照片(a)和煅烧后的纤维的扫描电镜照片(b)、透射电镜照片(c)及高分辨透射电镜照片(d)。
图4：不同样品的XRD谱图。
图5：前驱体溶胶不同硝酸钴含量制备出的煅烧前后的样品的扫描电镜和透射电镜照片(F1：a1，a2,a3；F2：b1,b2,b3；F3:c1,c2,c3)，图c1、c2和c3中的标尺都为50nm。
图6：不同样品的N2吸脱附等温线(a,F1；b,F2；c,F3)，插入图为相应样品的BJH曲线。
图7：催化活性(溶液中TMB氧化产物的相对浓度)随溶液pH值、温度及反应温度的变化曲线；以分析过程中最大吸光度作为100％。
图8：不同样品(F1：a,b；F2：c,d；F3:e,f)以H2O2(a,c,e)和TMB(b,d,f)为底物的米氏动力学关系图。
图9：不同样品在优化条件下(溶液pH值为4，温度40℃，时间3min)的催化活性比较图。
图10：样品重复使用过程中的催化活性图。
图11：对比例4中Co3O4凝胶纤维和而微米带的扫描电镜照片。
具体实施方式
实施例1
称取1.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，在磁力搅拌下将之溶解于10mL乙醇。中。待PVP溶解完全后，加入2mL硝酸钴溶液(含有0.45g Co(NO3)2·6H2O)。当溶胶混合均匀后，将其转移到针管中。设置静电纺丝机的电压为20kV，接收距离为20cm,泵的推进速度为0.002mm/s。待电纺完毕后，收集样品，把样品置于80℃烘箱中干燥至少12h。最后煅烧得最终样品，煅烧条件如下：室温以1℃/min升至300℃，保温1h；然后以0.5℃/min升至400℃，保温2h。
实施例2
称取1.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，在磁力搅拌下将之溶解于8mL乙醇。中。待PVP溶解完全后，加入2mL硝酸钴溶液(含有0.24g Co(NO3)2·6H2O)。当溶胶混合均匀后，将其转移到针管中。设置静电纺丝机的电压为18kV，接收距离为15cm，泵的推进速度为0.003mm/s。待电纺完毕后，收集样品，把样品置于70℃烘箱中干燥至少12h。最后煅烧得最终样品，煅烧条件如下：室温以0.8℃/min升至250℃，保温1.5h；然后以0.2℃/min升至350℃， 保温2.5h。
实施例3
称取1.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，在磁力搅拌下将之溶解于12mL乙醇。中。待PVP溶解完全后，加入2mL硝酸钴溶液(含有0.57g Co(NO3)2·6H2O)。当溶胶混合均匀后，将其转移到针管中。设置静电纺丝机的电压为22kV，接收距离为25cm,泵的推进速度为0.005mm/s。待电纺完毕后，收集样品，把样品置于90℃烘箱中干燥至少12h。最后煅烧得最终样品，煅烧条件如下：室温以3℃/min升至350℃，保温0.5h；然后以0.8℃/min升至450℃，保温1.5h。
对比例1
与实施例1的区别在于：2mL硝酸钴溶液中含有0.115g Co(NO3)2·6H2O)。
对比例2
与实施例1的区别在于：2mL硝酸钴溶液中含有0.23g Co(NO3)2·6H2O)。
对比例3
与实施例1的区别在于：2mL硝酸钴溶液中含有0.58g Co(NO3)2·6H2O)。
对比例4
称取1.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，在磁力搅拌下将之溶解于10mL乙醇。中。待PVP溶解完全后，加入2mL醋酸钴溶液(含有0.38g Co(CH3COO)2·4H2O)。当溶胶混合均匀后，将其转移到针管中。设置静电纺丝机的电压为20kV，接收距离为20cm,泵的推进速度为0.002mm/s。待电纺完毕后，收集样品，把样品置于80℃烘箱中干燥至少12h。最后煅烧得最终样品，煅烧条件如下：室温以1℃/min升至300℃，保温1h；然后以0.5℃/min升至400℃，保温2h。
选择醋酸钴作为钴源，其中钴离子的摩尔浓度与0.45g硝酸钴的相同，在相同条件下配置溶胶，电纺，干燥后得到如图11所示的凝胶纤维。从扫描电镜照片(图a)可以看出，凝胶纤维呈带状结构，带的尺寸集中在1.0-1.6μm之间。经煅烧之后，微米带两侧发生卷曲，微米带的形貌没能得以保持，从而降低其模拟的类过氧化物酶的活性，大部分纤维尺寸在400-700nm之间。
实验例：类过氧化物酶活性表征
将36μg实施例1中的Co3O4微丝带催化剂分散于醋酸-醋酸钠缓冲溶液(3mL；pH＝4.0)中，超声分散5分钟，使其分散均匀；然后加入150μL 3,3’,5,5’-四甲基对二联苯胺(TMB)溶液(10mg/mL，溶剂为二甲亚砜)和160μL 30％的H2O2。利用紫外可见光谱仪(Perkin-Elmer Lambda 35)测定该反应液在652nm处由TMB的氧化产物引起的吸光度，根据溶液 吸光度的变化评价催化剂的催化活性。通过改变TMB和H2O2的浓度来测定反应对应的米氏常数。
实施例1中的技术方案的实结果与讨论：
在溶胶的配置中，PVP的加入是为了改善溶胶的可纺性，而选择乙醇做溶剂可以有效地加快电纺速度。首先本发明对凝胶纤维在空气气氛下进行热重分析，结果如图1a所示。热重曲线一共有三段失重：第一段失重(﹤100℃，ca.10％)是由于凝胶纤维表面吸附水及剩余乙醇的挥发，100℃到331℃度温度区间的内的失重量约为55％，该部分失重主要是由于硝酸钴的分解及PVP侧链的分解；最后一段失重为PVP主链的分解。该段的失重量为25.5％。从热重曲线可以看出，当温度高于400℃时，纤维的重量不再发生变化，说明凝在该温度下胶纤维中的有机物已经分解完全。图1b给出了凝胶纤维的红外光谱图。位于3434cm-1的非对称吸收归属为吸附水和乙醇中-OH的伸缩振动；3100-930cm-1范围内的吸收为PVP的特征吸收。位于2949cm-1和1423cm-1的吸收是由于C-H键的振动引起的。处于1674和1020处的红外吸收可以分别归属为PVP中C＝O和C-N键的伸缩振动吸收。位于1384cm-1处的振动为NO3–的特征振动。样品在经过400℃煅烧后，PVP的特征振动消失，说明该温度下热处理样品能够将样品中的PVP完全去除。煅烧后的样品在664cm-1和571cm-1处出现新的吸收峰，这是氧化钴(II,III)中Co-O键的特征振动。Co(NO3)2的特征吸收消失及新的吸收峰的出现，说明凝胶纤维经过热处理后已经转化为Co3O4。
本发明通过X射线粉末衍射仪来表征样品的晶体结构。如图2所示，所有衍射峰与立方相Co3O4(JCPDS no.43-1003)的一致，位于31.3°,36.9°,44.9°,59.4°,65.3°的衍射峰分别对应于(220)、(311)、(400)、(511)和(440)晶面。没有其他杂质峰的出现，说明本发明合成的物相是纯的。根据Scherrer公式分析(311)衍射峰，样品中颗粒的平均尺寸约为26.9±1.1nm。
本发明使用扫描电子显微镜和透射电子显微镜来分析纤维的形貌(图3)。从图3a可以看到，电纺制备的凝胶纤维呈带状结构，带的宽度为4.9±1.5μm厚度0.6±02μm。由于PVP/硝酸钴复合纤维的无定形结构，所以微米带的表面比较光滑。热处理以后，样品的带状结构得以保持，但带的宽度降低到1.9±0.6μm。仔细观察发现(3b)，微米带在经过煅烧之后，由于PVP和硝酸钴的分解，其表面变得粗糙。从透射电镜图片(3b)中可以看出，微米带是由颗粒构成的，颗粒与颗粒之间比较疏松，能够观察到孔的存在。高分辨电镜照片中可以看到清晰平行的晶格条纹线。0.24nm和0.29nm为Co3O4的{311}和{220}的晶面间距。测量的晶面夹角为65°，这与 面和(220)面的夹角一致。
为了研究前驱体溶胶中硝酸钴含量的影响，在其他条件不变的前提下，本发明改变了硝酸钴的用量。结果如图4所示，降低硝酸钴的用量，不会改变产物的带状结构，但是当 硝酸钴用量增加到0.58g，制备的溶胶不具有可纺性。本发明把硝酸钴加入量为0.115、0.23和0.45g的纤维经煅烧后的样品分别命名为F1、F2和F3。从图4可以看到，所有凝胶纤维样品煅烧后都是Co3O4，通过分析F1、F2和F3的XRD谱图，样品的平均粒径分布为31.1±1.1nm、48.1±1.9nm、26.9±1.1nm。从图中可以看出，所有纤维都呈带状而且随着硝酸钴含量增加，带的宽度增加。经过煅烧之后，所有纤维的宽度都低于相应的凝胶纤维的；硝酸钴含量越低，纤维带越薄，也就说高PVP含量的凝胶纤维带，在煅烧过程中由于有机物的移除，收缩更严重。通过观察相应的透射电镜照片(图a3、b3、c3)，随着硝酸钴含量的增加，纤维的晶粒尺寸呈现先增加后减小的趋势，这个结果与XRD估算的粒径趋势相一致。文献中报道硝酸钴的分解温度约为242℃，对凝胶纤维进行热处理时，首先是纺丝助剂PVP侧链的分解，随着温度升高硝酸钴分解形成Co3O4，此时PVP的主链还未分解完全，因此对纳米颗粒的生长起到一定的抑制作用。对于低硝酸钴含量为(如0.115g，0.25g)的凝胶纤维，它在煅烧过程中可能会形成较少的成核点，各成核点之间被残留的有机物很好的分隔开。相比较0.23g硝酸钴含量的凝胶纤维，含0.115g硝酸钴的凝胶纤维每个成核点周围分解得到原子簇不足以供给成核点的进一步长大，因此形成的颗粒尺寸要小一些。但是当含量进一步增加，硝酸钴分解得到的成核数量可能较多，因此倾向于形成较小的颗粒。对于样品F1和F2，可能是晶粒生长对最终颗粒尺寸起到主要作用，而对于样品F2和F3，成核影响了最终颗粒尺寸。
从三个样品的透射照片可以观察到孔的存在。为了研究样品的多孔性，本发明采用N2吸脱附仪对样品进行表征。图5给出了样品的N2吸脱附等温线，插图是是相应样品的孔径分布曲线。样品等温线在0.1-1.0的相对压力范围内表现出滞后环，说明样品中有介孔存在。根据Brunauer-Deming-Deming-Teller标准，吸附等温线属于IV型等温线、H3型滞后环。样品F1、F2、F3的BET比表面积分别为25.5、10.5和33.8m2/g，相应的孔体积分别为0.097、0.040、和0.17cm3/g。相应的孔径分布曲线表明，样品的孔径分布比较宽，F1、F2和F3的最可几孔径分布为12.11、14.34和15.85nm。从以上分析可以看出，煅烧后的样品的比表面积随着硝酸钴含量的增加呈现先降低后增加的趋势，而最可几孔径差别不大，这可能是由于样品的比表面积是由于颗粒堆积贡献。F3的比表面积在三个样品中最大，因此可能表现出较好的性质。
文献中曾报道Co3O4通过Fenton反应将H2O2降解为活性的羟基自由基(·OH)，因此表现出内在的类过氧化物酶活性。催化反应过程中，Co3O4首先将H2O2分解为·OH，高活性的·OH将底物氧化。在实际操作中，本发明选择TMB和H2O2为底物测试所合成产物的类过氧化物酶活性。在H2O2的存在下，Co3O4能够催化氧化TMB从而产生颜色变化，因此 可以用比色法来检测氧化产物的含量，从而检测样品的催化活性。本发明通过改变反应液的pH值(2-12)和反应温度(20-70℃)来优化催化反应条件。由图7可以看出，三个样品的都在pH为4时表现最高的活性(图7a)；随着反应温度升高，三个样品的活性表现出先增高后降低的趋势，而且在较高的温度下(>40℃)，类过氧化物酶活性稍高(图7b)；延长反应时间，三个样品存在下，H2O2都能将TMB氧化到最大值，从图7c，可以看出样品F3在反应时间为6min时，就能使溶液的吸光度达到最大值。因此在实验中，本发明选择溶液pH为4，反应温度为40℃，反应时间为3min来评价样品的类过氧化物酶活性。
为了进一步研究所制备的产物的类过氧化物酶活性，在其他反应条件不变的情况下通过改变其中一种底物的浓度测定了它的表观稳态动力学参数Km(通常称之为米氏常数)。Km值是酶的特性常数，与酶的浓度无关，仅与酶的性质、底物和酶促反应条件(如温度、pH、有无抑制剂等)有关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。各种酶的Km值范围很广，大致在10-1～10-6M(代表mol/L)之间。Km值越大，说明酶与底物的亲和力越小；反之，Km值越小，酶与底物亲和力越大。如果酶与底物亲和力大，意味着在底物浓度较小的情况下，反应速度便可达到最大。一般通过米氏方程的双倒数形式来测定米氏常数，即Lineweaver—Burk plot，也可称为双倒数方程：
1/v＝Km/vmax×1/[S]+1/vmax
将1/v对l/[S]作图(v和s分别代表反应速率和底物浓度)即可得到一条直线，该直线在Y轴的截距即为1/vmax，通过直线的斜率即可得到Km值。
本发明测定的吸光度是由TMB的氧化产物引起的，氧化产物的浓度与吸光度成正比，所以吸光度的变化速率与产物的浓度变化速率相同。本发明通过改变反应体系中TMB和H2O2的浓度，在相同的反应时间内测定了它们的吸光度。采用双倒数法对反应速率和对应底物的浓度作图(如图8所示)，本发明得到了不同样品对对不同底物的Km值。如表1所示，当以H2O2为反应底物时，样品F1、F2和F3的Km值分别为0.079mM、0.091mM和0.026mM；当以TMB为反应底物时，它们对应的Km值分别为0.015mM、0.013mM和0.012mM。三个样品中，样品F3的Km(TMB)和Km(H2O2)最低，说明F3表现出对TMB和H2O2最强的吸附力。文献中报道的辣根过氧化酶的Km(TMB)和Km(H2O2)值分别为3.7mM和0.434mM，远高于本发明制备的纤维的，这可能是由于纤维成疏松的带状结构，很容易与反应液接触。与辣根过氧化酶相比，本发明所制备的样品的Km(TMB)和Km(H2O2)值均较低，说明该它们对TMB和H2O2都有较高的亲和力，即反应体系中不需要太高的浓度就能使反应速率达到最大值。
表1.不同样品分别以H2O2和TMB为底物的Km值
在优化反应条件的基础上，本发明在同等条件下测试了三个样品的类过氧化物酶活性。如图9所示，在不加催化剂(命名为blank)情况下，H2O2对TMB的氧化微乎其微，因此在该反应条件下，我们可以忽略该部分对吸光度值的贡献。三个样品的活性顺序为F3>F1>F2，样品F1的活性约为F3的57.2％，而F2的活性仅为F3的34.8％，该顺序与样品的比表面积的大小顺序一致。样品F3表现出较高的催化活性主要是由于组成微米带的颗粒较小，比表面积较大，同时对H2O2和TMB具有较强的亲和力。
作为一种无机材料，煅烧而来的样品可能会表现出较高的化学稳定性和热力学稳定性。因此，本发明采用同一样品重复进行催化反应实验的方法来检验催化剂的稳定性。如图10所示，连续使用10次后，其催化活性降低到最初活性的78.7％。材料催化活性的降低可能是由于在分离过程中催化剂有少量的损失造成的。以上结果说明本发明所制备的纤维微米带具有良好的稳定性。
结论：本发明采用静电纺丝结合煅烧的方法成功制备了一维的Co3O4微米带。该微米带在用作过氧化物模拟酶时，能够在较宽的pH和温度范围内表现出活性；样品对H2O2和TMB表现出较好的亲和力；同时具有较高比表面积的微米带表现出较高的类过氧化物酶活性和稳定性。相信本发明制备的Co3O4微米带作为模拟酶可以应用于很多领域。
具有高类过氧化物酶活性及稳定性的四氧化三钴微米带及其制备方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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