专利摘要

本发明涉及植物抗线虫基因及其应用，属于生物技术领域。GhNtR1基因是从抗黄萎病枯萎病材料常抗棉中获得的一个CC-NBS-LRR基因，其编码蛋白含有861个氨基酸。与已登录的R基因相似度较低，最高相似度的蓖麻RPPR8也只有27%。构建了GhNtR1基因的植物过表达载体，并通过农杆菌介导法转化感病普通烟草。用南方根结线虫接种后发现9个转基因株系中有5个株系的抗性显著增加。另外，接种线虫后转基因植株的防卫反应基因PR1和PR3表达量较非转基因植株更高，转基因植株中有更多的胼胝质积累。GhNtR1基因的克隆与功能分析深化了对该类基因抗性机制以及相关的信号通路的了解，并为获得抗线虫基因工程植株奠定基础。

权利要求

1.一个棉花CC-NBS-LRR类基因GhNtR1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的棉花GhNtR1基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1～2之一所述基因的表达载体。

4.含有权利要求1～3之一所述基因的宿主菌。

5.权利要求1～4之一所述基因在植物线虫抗性改良中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个棉花抗线虫相关基因，属于植物基因工程领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。 

背景技术

根结线虫(Meloidogyne spp)是危害农作物的重要病原生物，目前国际上报道的根结线虫有80多种，我国报道的根结线虫有29种。由根结线虫引起的农作物损失中90％以上是由南方根结线虫(M.incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)、北方根结线虫似(M.Hapla)4种主要根结线虫引起的。植物根结线虫对农业生产造成了巨大的危害，特别是随着温室大棚的大面积推广，为根结线虫的发生、发展提供了适宜的环境，使得土壤中的根结线虫得以积聚繁殖，温室蔬菜受害尤为严重，且病害呈逐年上升之势。目前对于根结线虫仍然缺乏安全有效的防治措施，从抗性资源中发掘抗性基因(R基因)，并利用生物技术手段培育抗性品种是最有前景的抗根结线虫研究方向。 

Hs1Pro-1是第一个克隆的抗胞囊线虫基因，对甜菜包囊线虫具有抗性。该基因编码一个由282个氨基酸组成的酸性蛋白质，具有几个富含亮氨酸区域(1eucine rich repeat，LRR)构成的受体结构域和一个典型的跨膜区域，是位于细胞膜上的糖蛋白受体。另外大豆胞囊线虫抗性基因rhg1和Rhg4也是受体类似蛋白激酶(Receptor like kinase)。 

除了Hs1pro-1，rhg1和Rhg4外，其它克隆的线虫抗性基因都属于NBS-LRR基因家族。如小麦的禾谷孢囊线虫抗性基因Cre3；马铃薯的胞囊线虫抗性基因Gpa2,Gro1-4；醋栗番茄(S.pimpinellifolium)中白线虫(G.pallida)金线虫(G.rostochiensis)抗性基因Hero A和番茄的Mi-1基因。Mi-1基因对南方根结线虫，花生根结线虫和爪哇根结线虫都具有抗性，但对北方根结线虫无效，并且在温度高于28℃时抗性丢失。Mi-1基因的特征表现为在寄主植物中引起过敏反应(HR)，即在二龄侵染性幼虫头部周围植物细胞发生局部坏死。国外从20世纪40年代开始开展对Mi-1基因的研究，目前该基因在欧洲和美国被广泛应用于番茄上控制根结线虫的危害,并取得了良好的效果)。在番茄中又陆续发现了8个新的线虫抗性基因。Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5、Mi-6、Mi-9在32℃下对根结线虫仍具有较高的抗性。除 了Mi-1外，另一个克隆的根结线虫抗性基因是樱桃李的Ma基因，该基因编码一个长为2048个氨基酸的超长NBS-LRR基因，具有广谱根结线虫抗性，对30种根结线虫具有抗性。 

棉花是世界重要的经济作物。青枯病、枯萎病、黄萎病和根结线虫等棉花病害对棉花生产造成严重危害，降低棉花产量和品质。克隆抗性基因不仅对研究棉花和病原物互作十分重要，并且可以为转基因育种提供更多的候选基因。 

发明内容

本发明的目的是：提供了一个棉花抗线虫相关基因GhNtR1，该基因编码一个CC-NBS-LRR蛋白。该基因过量表达株的线虫抗性明显增加，同时接种线虫后转基因植株的防卫反应基因PR1和PR3表达量较非转基因植株更高，并且有更明显的胼胝质积累。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗线虫性状。 

本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个棉花抗病相关基因GhNtR1，属于植物基因工程领域，该基因来源于陆地棉品种常抗棉(Gossypium hirsutum L.)，是下述核苷酸序列之一： 

1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列或部份DNA序列； 

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(15mM NaCl,1mM NaH2PO4,0.1mM EDTA)、0.1×SSC(15mM NaCl,1.5mM柠檬酸钠)、0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，65℃条件下洗膜。 

序列表中的SEQ ID NO.1由2989个碱基组成，自5’端第152位碱基为转录起始位点,记为+1；第2740位碱基为转录终止位点。完整编码框长度为2584个碱基，编码蛋白为861个氨基酸，分子量为93KD。GhNtR1具有保守的P-LOOF结构域，属于CC-NBS-LRR类蛋白。 

本发明提供了含有本发明基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片段的引物。 

本发明棉花抗线虫基因GhNtR1及其应用，该基因编码一个CC-NBS-LRR蛋白，受线虫侵染诱导表达。同时，该基因过量表达株的线虫抗性显著增加，同时接种线虫后转基因植株的防卫反应基因PR1和PR3表达量较非转基因植株更高，并且有更明显的胼胝质积累。可以利用本发明基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗线虫性状。 

本发明的有益效果是：棉花是世界重要的经济作物，棉花的真菌病害、细菌病害以及线虫都会造成产量减少以及品质下降。克隆抗性基因不仅对研究棉花和病原菌互作十分重要，并且可以为转基因育种提供更多的候选基因。目前为止获得的R基因中大部分都属于NBS-LRR类基因，但是棉花NBS-LRR基因的研究十分滞后。本发明获得的GhNtR1基因是一个全新NBS-LRR类基因，在GENBANK中没有与其高度相似的同源基因。并且通过转化烟草，发现此基因的过量表达会显著提高植物对南方根结线虫抗性，表明可以利用该基因进行抗线虫转基因育种。 

本发明阐明了GhNtR1的抗性机制。虽然目前有一些抗病基因被克隆出来，但是对抗性机制以及相关的信号通路的了解还不是很深入。对GhNtR1转基因植株进行进一步研究分析发现接种线虫后转基因植株的防卫反应基因PR1和PR3表达量较非转基因植株更高，并且有更明显的胼胝质积累，说明GhNtR1基因响应线虫侵染，并激活下游防卫反应基因PR1和PR3的表达，最终胼胝质大量积累而导致线虫不能在植株体内扩繁，植株抗性增加。 

附图说明

图1GhNtR1,RPP8(EEF33923.1),RPM1(AAT09451.1)和NRC1(ABC26878.1)的氨基酸序列相似性比较。 

图2部分再生植株PCR检测目的基因。M:DL2000分子量标准，H:水空白对照，1-9：再生植株。箭头所指为PCR扩增目的基因GhNtR1的部分片段,目的片段大小约1Kb。 

图3未转化植株和转基因植株GhNtR1-31线虫侵染40天后的表型。 

图4未转化植株和转基因株系的线虫病指鉴定。CK为未转化植株，13，15，17，28，31，32，35，36，38为转基因株系。 

图5GhNtR1转基因株系和未转基因植株在接种线虫后的防卫反应基因表达变化。CK为未转基因植株，28和31为GhNtR1转基因植株；0,3,7,15,25为接种线虫后天数。 

图6GhNtR1转基因株系和未转基因植株在接种线虫12d后的胼胝质积累。标尺为100um。CK为未转基因植株，GhNtR1-31为GhNtR1转基因植株。 

具体实施方式

下述实施方式中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物序列均由上海英俊生物技术有限公司合成，所述百分含量均为质量百分含量。本实验所用的陆地棉品种为常抗棉， 烟草为普通烟(Nicotiana tabacum)。棉花与烟草都在培养箱中生长。光照强度为130μmolphotons m^–2s^–1，湿度为65％。 

实施例一 

棉花GhNtR1基因克隆以及序列分析 

根据NBS结构域的P-loop和GLPL氨基酸保守区设计简并引物。引物序列为5'-GGNGGNAT(T/C/A)GGIAA(A/G)ACIAC-3'，5'-NA(G/A)NGCIA(G/A)IGGIA(G/A)ICC-3'。PCR扩增获得一500bp左右的双引物扩增条带，回收并送多个克隆测序。结果获得了多个含有NBS结构域的EST序列，且这些序列之间具有极高的同源性。选择其中一个EST用Tail PCR技术扩增全序列。N端特异性引物是5'-TGCCTTGTAAAAAGTTCCTCAGCT-3',5'-CGTCCATGACAATGAGATATCTC-3'。C端特异性引物是5'-GGTGTAGAAGAAACTCAACTATGG-3'，5'-CTCAAAGAATGTGGCTTCACTGG-3'。参照Paterson等的方法(Paterson AH,Brubaker CL,Wendel JF.A rapid method for extraction cotton(Gossypium spp.)Genomic DNA suitablefor RFLP or PCR analysis.Plant Mol Biol Rep1993,11:122-127.)提取棉花叶片的核基因组DNA。TAIL PCR的方法参照(Liu Y.G.,Mitsukawa N.Oosumi T.，Whittier R.F.Plant J，1995，8：457–463.)进行。利用TAIL PCR在5’端获得了一953bp的片段，序列分析发现其具有启始密码子ATG和部分5'UTR序列。在3’获得了一1900bp的片段，发现其含有终止密码子，说明已经到达基因的3'末端。将这些序列拼接获得了长为2989bp的序列并含有完整的开放阅读框，长为2584bp，5'UTR为151bp，编码蛋白含有861个氨基酸。根据拼接得到的序列设计特异引物用于扩增常抗棉cDNA，分析发现此基因没有内含子。将此基因命名为GhNtR1。用DNAMAN进行序列比较分析，通过氨基酸序列比较，可以将GHNTR1归为CC-NBS-LRR类型蛋白。GHNTR1除NBS区域外，与已登录的R基因相似度都不高，相似度最高的蓖麻的RPPR8(登录号：EEF33923.1)，NRC1(登录号：ABC26878.1)相似度也只有27％。与RPM1(登录号：AAT09451.1)的相似度为26％(图1)。 

实施例二 

GhNtR1过表达烟草转化株的获得 

为了研究GhNtR1的功能，根据序列SEQ ID NO.1设计引物，并在引物中加入SalⅠ和XbaⅠ内切酶识别位点，5'-GTCGACAAGGCAAATTAGTTTTCTGAGTGA-3'和5'-TCTAGACCTTCAATAAAGAAGCCACTCTTC-3'。用这对引物扩增常抗棉的cDNA。用SalⅠ和XbaⅠ同时酶切PCR扩增产物和PCAMBIA2301，回收酶切产物并用T4ligase连接。将以上获得的重组载体用冻融法将重组载体转化农杆菌LBA4404。用农杆菌介导法转化普通烟草(张保龙, 杨郁文,倪万潮,侯继波.转H5禽流感病毒M2e基因烟草的研究.江苏农业学报,2010,01:51-54)。用CTAB法提取T0代单株，利用引物：5’-AACCAAGTTTTGGGATATTAGAT-3’；5’-ACCAAGCTTACCTTAACAAGACT-3’进行PCR扩增，鉴定阳性植株9株(图2)，分单株收获烟草种子。将T1代转基因株系在含有40mg/L卡那霉素的MS培养基上进行筛选，挑选绿色植株移栽至营养土中继续生长。 

实施例三 

GhNtR1过表达烟草的线虫抗性分析 

对转基因植株进行初步的抗性鉴定，用南方根结线虫处理9个转基因烟草株系，南方根结线虫由南京农业大学植物保护学院提供。烟草苗在光照培养箱中以25℃(昼,12h)/16℃(夜,12h)培养，栽培土壤灭菌处理。待幼苗的真叶长出4～5片时，用2龄幼虫进行接种。接种方法为在烟草根系周围用玻璃棒打洞(每盆3洞)，将收集到的2龄幼虫注入洞中，接种量为每株2000个幼虫，然后盖土1cm左右，对照株只注入同体积的清水而不接种线虫。每个转基因株系接种数>16株。接种45天后发现未转化植株已经完全萎蔫，叶片干枯，根部变为黄褐色，而转基因植株生长正常，叶片仍为绿色，根部为白色(图3)。将植株根部清洗干净后调查根部线虫卵块数和根结数。根据番茄抗根结线虫评价分级标准计算病情指数，分级标准为：0级,所有根系上都没有根结,无侵染；1级,1％～20％的根系上有根结；2级,21％～40％的根系上有根结；3级,41％～60％的根系上有根结；4级,61％～80％的根系上有根结；5级,81％～100％的根系上有根结。病情指数＝∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高代表值)×100，抗性指标为：免疫(I):病情指数＝0；高抗(HR):0<病情指数≤20.0；中抗(MR):20.0<病情指数≤40.0；抗病(R):40.0<病情指数≤60.0；感病(S):60.0<病情指数≤80.0；高感(T):病情指数>80.0。结果显示非转基因植株的病指为78，为感病(S)，而9个转基因株系中5个株系的病指都显著低于非转基因植株，分布在38-59之间(图4)，达到中抗(MR)或抗病(R)水平。 

实施例四 

烟草转化株中相关防卫基因的表达变华 

R基因和avr基因识别后，引发过敏反应，同时通过信号传导途径诱导一系列抗病防卫反应基因表达，产生系统获得抗性(systemic acquired resistance，SAR)。植物产生SAR后，抗病防卫反应中表达的基因主要是编码病程相关蛋白(pathogenesis-relatedproteins，PRs)和植保素合成相关酶基因。所以R基因的过量表达往往会造成相应的防卫反应相关基因的上调表达。根据发表文章合成烟草防卫相关基因PR1a，Basic PR-1，PR2，PR3， PR5的引物，并以EF-1α作为内参基因(Wang F D,Feng G H,Chen K S.Burdock fructooligosaccharide induces resistance to tobacco mosaic virus in tobacco seedlings.Physiological and Molecular Plant Pathology,2009,74,34–40)。用南方根结线虫接种非转基因植株和2个抗性最好的转基因株系28和31，接种方法如上所述。在接种后0,3,7,15和25d分别提取烟草根部总RNA，总RNA提取后用RQ1DNAase(Promega,America)消化污染的DNA。用Oligo(dT)将各个器官的总RNA反转录成cDNA模板备用。取1ul cDNA模板做realtime PCR，所用试剂为Primscript RT-PCR kit(TaKaRa公司)，PCR程序为95℃1min，(95℃15s，60℃20s，72℃20s)40cycles。仪器为qTOWER2.0/2.2(德国耶拿)。结果表明接种线虫后转基因植株中防卫反应基因PR1和PR3表达量显著上升，并且在接种后第7天PR1和PR3表达量达到最大值(图5)。 

实施例五 

烟草转化株中胼胝质的积累 

用南方根结线虫接种非转基因植株和2个抗性最好的转基因株系28和31，接种方法如上所述。在接种后0,3,7,15和25d分别提取烟草根部洗净，在二倍乙醇稀释的乳酚油(水：甘油：苯酚：乳酸的质量比为1:2:2:1)中煮沸2min，双蒸水洗干净后在0.01％苯胺蓝中染色15min，冲洗干净后在荧光显微镜(Olympus1X71invert microscope)下观察胼胝质的积累。结果显示在线虫侵染后非转基因植株根部基本没有胼胝质的积累，而转基因株系31根部有大量的胼胝质积累(图6)。 

实施例六 

GhNtR1抗性机制的初步分析 

根据转基因植株中防卫反应基因的表达变化和胼胝质积累，推测GhNtR1基因可以响应线虫侵染，并将信号进一步传导诱导PR1和PR3的表达，最终致使在细胞壁或细胞间隙处积累大量胼胝质。根结线虫由于不能在细胞间隙和组织内移动而不能大量繁殖，植株抗性增加。 

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棉花抗线虫基因GhNtR1及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。