专利摘要

专利摘要

本发明公开了一种复合抑藻剂的制备方法，所述的方法包括以下步骤：消毒工序、培养工序，本发明与现有技术相比，具有以下特点：按本发明方法所制的微生物和金鱼藻的复合抑藻剂，共同抑藻的最高效率达到了100％，超过了单独的金鱼藻(61.25％)和单独的微生物(70.11％)；且达到最高抑制率的时间由单独的金鱼藻的第4天和单独的微生物的第4d提前到了共同作用时的第2d；可以得出微生物与金鱼藻共同作用于铜绿微囊藻，起到协同抑制的作用，缩短了起效时间。

权利要求

1.一种复合抑藻剂的制备方法，包括以下步骤：

a)消毒工序：将金鱼藻(Ceratophyllum demersum L.)于室温中浸入重量浓度为3％的次氯酸钠(NaClO)溶液中，静置3-5分钟，进行消毒，再用无菌水清洗冲洗5-6次，金鱼藻与次氯酸钠溶液的重量比为1:8-12；

b)培养工序：将上述消毒好的金鱼藻放入盛有Hoagland(0.1×)培养液的1000mL锥形瓶中，再按10⁵个/mL细菌密度加入微生物菌种，用消毒牛皮纸封口，于25℃、光照强度4000lx的环境中培养0.5-1.0个月，用定性滤纸过滤，取滤液进行抑藻，金鱼藻与Hoagland(0.1×)培养液的重量体积比为1：90-120。

2.根据权利要求1所述的一种复合抑藻剂的制备方法，其特征在于：

所述的微生物菌种通过以下方法制备：

取金鱼藻植株周围(0.1m*0.1m)水样，用定性滤纸过滤，以消除原生动物并去除水中杂质，取0.3ml涂于含有牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的平板，37℃条件下培养48h，用平板划线法进行反复分离纯化，将纯化的单克隆菌种分别接入盛有500mL牛肉膏蛋白胨液体培养基或500mL PDA液体培养基的1000mL锥形瓶中，置于150r/min,30℃条件下振荡培养3d，将培养好的菌液4000r·min^-1离心15min，得到沉淀物，将沉淀物加入到BG-11培养基摇匀，驯化培养48h进行抑藻实验，抑藻时细菌在藻液中的个数为10⁵～10⁶个/mL，选取10⁵个/mL时，第4天的抑藻效率大于40％的菌种。

3.根据权利要求2所述的一种复合抑藻剂的制备方法，其特征在于：

所述的牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5g，水定容至1000mL，pH 7.2-7.4。

4.根据权利要求2所述的一种复合抑藻剂的制备方法，其特征在于：

所述的PDA培养基：新鲜去皮土豆200g，煮烂取上清，葡萄糖20g，水定容至1000mL。

5.根据权利要求1所述的一种复合抑藻剂的制备方法，其特征在于：

所述的微生物菌种为不动杆菌属(Acinetobacter sp.IFFI10213)。

说明书

技术领域：

本发明属于抑藻剂的制备方法，特别属于复合抑藻剂的制备方法这一技术领域。

背景技术

水华(water bloom)通常是指当水体达到富营养化或严重富营养化的状态时，在一定的温度、光照等条件下在水面形成或薄或厚的绿色或其他颜色的藻类漂浮物的现象。由于藻类具有浮力和运动能力，绝大部分的水华通常都是由浮游藻类引起的，引起水华现象的浮游藻的种类比较多，如蓝藻、绿藻、裸藻、硅藻等，其中，蓝藻水华是最为常见也是最为严重的。这是由于蓝藻独特的生理生态特性，伪空泡或伪空泡群结构、胶质鞘结构、耐营养盐胁迫性、CO₂浓缩机制、他感效应，使得它在生态系统的生存竞争中，占据有利的优势，成为水华藻类中的优势藻种。蓝藻水华具有重大危害，而水体的富营养化是发生水华现象的重要物质基础。因此，防治水华最重要的措施是控制水体的富营养化，即切断污染源。然而，导致水质富营养化的营养盐来源很复杂，使得其控制难度较大，治理水华的另一个重要措施是直接去除有害藻类。该种治理方法主要可以分为物理法、化学法和生物法。利用水生植物的化感作用来抑藻也是生物法之一，化感作用是指一种生物产生一种或多种生物化学成分，以影响其他生物生长、生存与繁殖的生物学现象，水生植物向水体中释放的化感物质，大多数是植物的次生代谢产物，自然条件下即可降解，不会长期积累，因此生态安全性良好。但通常的水生植物的化感物质具有都有使用量大、起效慢的缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种复合抑藻剂的制备方法，所制的复合抑藻剂具有起效快的特点。

本发明解决技术问题的技术方案为：一种复合抑藻剂的制备方法，包括以下步骤：

a)消毒工序：将金鱼藻(Ceratophyllum demersum L.)于室温中浸入重量浓度为3％的次氯酸钠(NaClO)溶液中，静置3-5分钟，进行消毒，再用无菌水清洗冲洗5-6次，金鱼藻与次氯酸钠溶液的重量比为1:8-12；

b)培养工序：将上述消毒好的金鱼藻放入盛有Hoagland(0.1×)培养液的1000mL锥形瓶中，再按10⁵个/mL细菌密度加入微生物菌种，用消毒牛皮纸封口，于25℃、光照强度4000lx的环境中培养0.5-1.0个月，用定性滤纸过滤，取滤液进行抑藻，金鱼藻与Hoagland(0.1×)培养液的重量体积比为1：90-120。

所述的微生物菌种通过以下方法制备：

取金鱼藻植株周围(0.1m*0.1m)水样，用定性滤纸过滤，以消除原生动物并去除水中杂质，取0.3ml涂于含有牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的平板，37℃条件下培养48h，用平板划线法进行反复分离纯化，将纯化的单克隆菌种分别接入盛有500mL牛肉膏蛋白胨液体培养基或500mL PDA液体培养基的1000mL锥形瓶中，置于150r/min,30℃条件下振荡培养3d，将培养好的菌液4000r·min^-1离心15min，得到沉淀物，将沉淀物加入到BG-11培养基摇匀，驯化培养48h进行抑藻实验，抑藻时细菌在藻液中的个数为10⁵～10⁶个/mL，选取10⁵个/mL时，第4天的抑藻效率大于40％的菌种。

所述的牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5g，水定容至1000mL，pH 7.2-7.4。

所述的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5g，琼脂20g,水1000mL，pH 7.2-7.4。

所述的PDA培养基：新鲜去皮土豆200g(煮烂取上清)，葡萄糖20g，水定容至1000mL。

所述的微生物菌种也可以为不动杆菌属(Acinetobacter sp.IFFI 10213)。

本发明与现有技术相比，具有以下特点：按本发明方法所制的微生物和金鱼藻的复合抑藻剂，共同抑藻的最高效率达到了100％，超过了单独的金鱼藻(61.25％)和单独的微生物(70.11％)；且达到最高抑制率的时间由单独的金鱼藻的第4天和单独的微生物的第4d提前到了共同作用时的第2d；可以得出微生物与金鱼藻共同作用于铜绿微囊藻，起到协同抑制的作用，缩短了起效时间。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实施例1：

微生物菌种通过以下方法制备：

取金鱼藻植株周围(0.1m*0.1m)水样，用定性滤纸过滤，以消除原生动物并去除水中杂质，取0.3ml涂于含有牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的平板，37℃条件下培养48h，用平板划线法进行反复分离纯化，将纯化的单克隆菌种分别接入盛有500mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的1000mL锥形瓶中，置于150r/min,30℃条件下振荡培养3d，将培养好的菌液4000r·min^-1离心15min，得到沉淀物，将沉淀物加入到BG-11培养基摇匀，驯化培养48h进行抑藻实验，抑藻时细菌在藻液中的个数为10⁵～10⁶个/mL，选取10⁵个/mL时，第4天的抑藻效率大于40％的菌种。

所述的牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5g，水定容至1000mL，pH 7.2-7.4。

所述的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5g，琼脂20g,水1000mL，pH 7.2-7.4。

所述的PDA培养基：新鲜去皮土豆200g(煮烂取上清)，葡萄糖20g，水定容至1000mL。

实施例2：

微生物菌种通过以下方法制备：

取金鱼藻植株周围(0.1m*0.1m)水样，用定性滤纸过滤，以消除原生动物并去除水中杂质，取0.3ml涂于含有牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的平板，37℃条件下培养48h，用平板划线法进行反复分离纯化，将纯化的单克隆菌种分别接入盛有500mL PDA液体培养基的1000mL锥形瓶中，置于150r/min,30℃条件下振荡培养3d，将培养好的菌液4000r·min^-1离心15min，得到沉淀物，将沉淀物加入到BG-11培养基摇匀，驯化培养48h进行抑藻实验，抑藻时细菌在藻液中的个数为10⁵～10⁶个/mL，选取10⁵个/mL时，第4天的抑藻效率大于40％的菌种。

实施例3：

一种复合抑藻剂的制备方法，包括以下步骤：

a)消毒工序：将金鱼藻(Ceratophyllum demersum L.)于室温中浸入重量浓度为3％的次氯酸钠(NaClO)溶液中，静置3分钟，进行消毒，再用无菌水清洗冲洗5次，金鱼藻与次氯酸钠溶液的重量比为1:8；

b)培养工序：将上述消毒好的金鱼藻放入盛有Hoagland(0.1×)培养液的1000mL锥形瓶中，再按10⁵个/mL细菌密度加入实施例1所制的微生物菌种，用消毒牛皮纸封口，于25℃、光照强度4000lx的环境中培养0.5个月，用定性滤纸过滤，取滤液进行抑藻，金鱼藻与Hoagland(0.1×)培养液的重量体积比为1：90。

实施例4：

一种复合抑藻剂的制备方法，包括以下步骤：

a)消毒工序：将金鱼藻(Ceratophyllum demersum L.)于室温中浸入重量浓度为3％的次氯酸钠(NaClO)溶液中，静置4分钟，进行消毒，再用无菌水清洗冲洗5次，金鱼藻与次氯酸钠溶液的重量比为1:10；

b)培养工序：将上述消毒好的金鱼藻放入盛有Hoagland(0.1×)培养液的1000mL锥形瓶中，再按10⁵个/mL细菌密度加入实施例2所制的微生物菌种，用消毒牛皮纸封口，于25℃、光照强度4000lx的环境中培养0.8个月，用定性滤纸过滤，取滤液进行抑藻，金鱼藻与Hoagland(0.1×)培养液的重量体积比为1：100。

实施例5：

一种复合抑藻剂的制备方法，包括以下步骤：

a)消毒工序：将金鱼藻(Ceratophyllum demersum L.)于室温中浸入重量浓度为3％的次氯酸钠(NaClO)溶液中，静置5分钟，进行消毒，再用无菌水清洗冲洗6次，金鱼藻与次氯酸钠溶液的重量比为1:12；

b)培养工序：将上述消毒好的金鱼藻放入盛有Hoagland(0.1×)培养液的1000mL锥形瓶中，再按10⁵个/mL细菌密度加入实施例1所制的微生物菌种，用消毒牛皮纸封口，于25℃、光照强度4000lx的环境中培养1.0个月，用定性滤纸过滤，取滤液进行抑藻，金鱼藻与Hoagland(0.1×)培养液的重量体积比为1：120。

实施例6：

除b)培养工序为：“将上述消毒好的金鱼藻放入盛有Hoagland(0.1×)培养液的1000mL锥形瓶中，用消毒牛皮纸封口，于25℃、光照强度4000lx的环境中培养0.8个月，用定性滤纸过滤，取滤液进行抑藻，金鱼藻与Hoagland(0.1×)培养液的重量体积比为1：100。”外，其余与实施例4相同。

实施例7：

除菌种为不动杆菌属(Acinetobacter sp.IFFI 10213)，外其余与实施例4相同。

实施例8：

藻种培养：

在无菌条件下，向已经高温湿热灭菌的250mL锥形瓶内加入100mL的BG-11培养基，加入铜绿微囊藻藻种，摇匀后放入光照培养箱内培养。

培养条件为:温度24±2℃，光周期12L/12D，光照强度4000lx，PH值7.0。每天振荡摇匀4-5次，实验前7天，对铜绿微囊藻进行扩大培养，每天加入新鲜培养基，使之处于对数生长期。

抑藻试验：

分别取出已稀释的藻液40mL加入100mL锥形瓶中，再加入实施例3所制的抑藻剂，使得抑藻剂的的最终浓度分别为50mL/L、100mL/L、200mL/L、400mL/L。另外设置空白对照组，即只含相同藻密度的藻液；每组三个平行，置于藻种培养的相同条件下进行培养，实验期为4天，每隔24h用血球计数板统计藻细胞数。

本发明中铜绿微囊藻的抑制百分率(Inhibition Ratio)公式为：

IR(％)＝(1-N/N₀)×100％，其中：

IR----抑制率；

N----处理组的铜绿微囊藻的藻密度(cells/mL)；

N_0----对照组的铜绿微囊藻的藻密度(cells/mL)。

其结果如表1所示：

表1

由表1可以看出40％的处理组第2d的抑制率达到了100％,在第4d所有的实验组的抑制率达到了100％。

实施例9：

除抑藻试验为：

分别取出已稀释的藻液40mL加入100mL锥形瓶中，再加入实施例1所制的菌种，使得抑藻剂的的最终浓度分别为A:10⁵个/mL、B:10⁶个/mL两个浓度梯度，另外设置空白对照组，即只含相同藻密度的藻液；每组三个平行，进行培养，实验期为4天，每隔24h用血球计数板统计藻细胞数。外，其余与实施例8相同。

其结果如表2所示：

表2：

如表2可知当菌种浓度达到10⁵个/mL时第四天的抑藻效率达到最大为41.51％；达到10⁶个/mL时，抑藻的抑制率可以达到70.11％。

实施例10：

除抑藻试验所加的抑藻剂为实施例6所制的抑藻剂外，其余与实施例8相同。

其结果如表3所示；

如表3所示：当浓度最大时(400mL/L)，在第4d抑制率可以达到61.25％。

实施例11：

除抑藻试验所加的抑藻剂为实施例7所制的抑藻剂外，其余与实施例8相同。

其20％的处理组第2d的抑制率达到了100％,在第4d所有的实验组的抑制率达到了100％。

复合抑藻剂的制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。