专利摘要

专利摘要

本发明公开了一种抑藻剂，所述的抑藻剂为葱白的无水甲醇粗提取物、葱白的无水丙酮粗提物、葱白的无水石油醚粗提物、葱白的乙醇粗提取物。本发明与现有技术相比，本发明与现有技术相比，有机溶剂的葱白粗提物对铜绿微囊藻的抑制效果由高到低顺序为：无水丙酮>75%乙醇>无水石油醚>无水甲醇。葱白的无水丙酮纯提物的抑制率随着时间的增加而增大，并表现出浓度效应。高剂量组在第四天的抑制率达到了97.78%；EC50按第五天计算，结果为0.03g/L，即纯化后的无水丙酮提取物抑藻效果较纯化前显著。

权利要求

1.一种抑藻剂，其特征在于：所述的抑藻剂为葱白的无水甲醇粗提取物、葱白的无水丙酮粗提物、葱白的无水石油醚粗提物、葱白的乙醇粗提取物。

2.根据权利要求1所述的一种抑藻剂，其特征在于：所述的葱白的无水甲醇粗提物通过以下方法制备：

按葱白与无水甲醇的比例为100g：400mL，室温浸提两天后过滤，收集滤液，减压浓缩挥干甲醇，干燥至恒重，即可。

3.根据权利要求1所述的一种抑藻剂，其特征在于：所述的葱白的无水丙酮粗提物通过以下方法制备：

按葱白与无水丙酮的比例为100g：400mL，室温浸提两天后过滤，收集滤液，减压浓缩挥干无水丙酮，干燥至恒重，即可。

4.根据权利要求1所述的一种抑藻剂，其特征在于：所述的葱白的无水乙醚粗提物通过以下方法制备：

按葱白与无水乙醚的比例为100g：400mL，室温浸提两天后过滤，收集滤液，减压浓缩挥干无水乙醚，干燥至恒重，即可。

5.根据权利要求1所述的一种抑藻剂，其特征在于：所述的葱白的乙醇粗提物通过以下方法制备：

按葱白与75%（ml/ml）的乙醇比例为100g：400mL，室温浸提两天后过滤，收集滤液，减压浓缩挥干乙醇，干燥至恒重，即可。

6.根据权利要求3所述的一种抑藻剂，其特征在于：将葱白的无水丙酮粗提取物，用无水丙酮稀释，装入滴液漏斗中，由滴液漏斗向层析柱（大孔树脂XAD1180）滴流，上样完全后，用蒸馏水洗柱，直至层析柱中流出的蒸馏水与95%乙醇（ml/ml）混合不产生混浊为止，再用2BV的丙酮进行洗脱，层析柱中洗脱液的洗脱速率恒定为 0.5BV/h，再经减压浓缩挥干无水丙酮，即可，得到葱白的无水丙酮提取物。

7.一种抑藻剂，其特征在于：所述的抑藻剂为烯丙硫醇、环戊硫醇一种或两种的混合物。

说明书

技术领域

本发明属于抑藻剂这一技术领域。

背景技术

近年来，随着人类活动的增加，湖泊、水库富营养化日益严重，导致水华频繁爆发，水资源的利用效能降低，水产业经济因此遭受了巨大的损失，水环境安全也因此面临着严重的威胁。因此，有效抑制富营养化水体中浮游藻类的过量生长及防止水华发生成为目前环境领域的研究热点和前沿。在众多控制藻类生长的方法中，传统的物理、化学抑制藻类生长的方法会不可避免地破坏生态平衡并造成环境污染。而生物方法尤其是利用植物化感作用抑藻被认为是一种新型的生物抑藻技术，具有高效、生态安全性好等特点，因而颇受关注。目前对利用植物化感作用抑藻主要是集中于沉水、挺水和浮游植物 的研究，但是水体中营养盐的直接胁迫和毒害作用会造成沉水植物的消亡；维持浅水湖泊清水状态的磷浓度通常为0.05-0.15 mg/L，当水体中的总磷浓度超过0.15 mg/L时，湖泊会开始从草型生态系统转化为藻型生态系统。再者，由于浮游藻类大量生长，水生植物不但会受到各种环境因子的影响，而且会受到营养、光照等方面的冲击而导致消亡，故要达到发挥抑藻效果的盖度是较难实现的，从而无法有效控制有害藻类的过量增殖。同时，蓝藻也会通过藻毒素等化感物质的分泌影响水生植物的化感潜能。此外，水生植物又受季节和气候的限制, 因此水生植物化感抑藻在实际应用中有一定的局限性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种含有陆生植物提取液的抑藻剂。

本发明解决技术问题的技术方案为: 一种含有植物提取物的抑藻剂，所述的抑藻剂为葱白的无水甲醇粗提取物、葱白的无水丙酮粗提物、葱白的无水石油醚粗提物、葱白的乙醇粗提物。

所述的葱白的无水甲醇粗提物通过以下方法制备：

按葱白与无水甲醇的比例为100g：400mL，室温浸提两天后过滤，收集滤液，减压浓缩挥干甲醇，干燥至恒重，即可。

所述的葱白的无水丙酮粗提物通过以下方法制备：

按葱白与无水丙酮的比例为100g：400mL，室温浸提两天后过滤，收集滤液，减压浓缩挥干无水丙酮，干燥至恒重，即可。

所述的葱白的无水乙醚粗提物通过以下方法制备：

按葱白与无水乙醚的比例为100g：400mL，室温浸提两天后过滤，收集滤液，减压浓缩挥干无水乙醚，干燥至恒重，即可。

所述的葱白的乙醇粗提物通过以下方法制备：

按葱白与75%（ml/ml）的乙醇比例为100g：400mL，室温浸提两天后过滤，收集滤液，减压浓缩挥干乙醇，干燥至恒重，即可。

将葱白的无水丙酮粗提物，用无水丙酮稀释，装入滴液漏斗中，由滴液漏斗向层析柱（大孔树脂XAD1180）滴流，上样完全后，用蒸馏水洗柱，直至层析柱中流出的蒸馏水与95%乙醇（ml/ml）混合不产生混浊为止，再用2BV的丙酮进行洗脱，层析柱中洗脱液的洗脱速率恒定为 0.5BV/h，再经减压浓缩挥干无水丙酮，即可得到葱白的无水丙酮纯提物。  

一种抑藻剂，所述的抑藻剂为烯丙硫醇、环戊硫醇一种或数种的混合物。

大葱(Allium fistulosum L.var. giganteam Makino)是常见的陆生植物，属百合科葱属，是以叶鞘组成的肥大假茎和嫩叶为产品的2-3年生草本植物；大葱在我国的栽培历史长达3000余年，是世界上主要栽培大葱的国家之一，它由葱白和葱叶组成。

本发明与现有技术相比，有机溶剂的葱白粗提物对铜绿微囊藻的抑制效果由高到低顺序为：无水丙酮>75%乙醇>无水石油醚>无水甲醇。葱白的无水丙酮纯提物的抑制率随着时间的增加而增大，并表现出浓度效应。高剂量组在第四天的抑制率达到了97.78%；EC50按第五天计算，结果为0.03g/L，即纯化后的粗提物抑藻效果较纯化前显著。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实验材料：

1.1

铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)和斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)由中国科学院水生生物研究所藻种库提供；采用BG-11培养基培养。

新鲜大葱，购于芜湖市菜市场。

无水甲醇、无水丙酮、无水石油醚和无水乙醇、烯丙硫醇、环戊硫醇均为分析纯。

BG-11培养基主要成分

NaNO₃，1.5 g/L；K₂HPO₄?3H₂O，0.04 g/L；MgSO₄?7H₂O，0.075 g/L；CaCl₂?2H₂O，0.036 g/L；柠檬酸，0.006 g/L；柠檬酸铁铵，0.006 g/L；EDTA，0.001 g/L；Na₂CO₃，0.02 g/L；A₅ solution，0.1 mL； 

A₅ solution配方：H₃BO₃，2.86 g/L；MnCl₂?4H₂O，1.86 g/L；ZnSO₄?7H₂O，0.22 g/L；Na₂MoO₄?2H₂O，0.39 g/L；CuSO₄.?5H₂O，0.08 g/L；Co(NO₃)₂?6H₂O，0.05 g/L。

1.2

实验前用对铜绿微囊藻进行扩大培养。培养条件为：光照强度4000 lx，光暗比为12h:12h，温度(25±1)℃。每天摇动3~5次，使铜绿微囊藻细胞进入对数生长期。

1.3 测定方法

铜绿微囊藻密度用荧光分光光度计计数；大葱葱白成分分析使用岛津GC-MS QP2010plus气质联用仪。

1.4 数据处理

化感物质对藻类的抑制率(inhibition rate)公式为：

IR = (1-N/N₀)×100%

式中，IR—抑制率；N—加入浸提液组的荧光值；N₀—对照组的荧光值。将大葱浸提液最终浓度与生长抑制率作一元线性回归，求出半效应浓度EC₅₀(mL/L)。

数据采用Excel 2010软件处理，各组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有极显著差异。

实施例1：

取新鲜大葱葱白去皮、磨碎、按葱白与有机溶剂(无水甲醇、无水丙酮、无水石油醚、75%乙醇)的比例均为100g：400mL。浸提两天后过滤，收集滤液，经减压浓缩挥干有机溶剂，将粗提物置已恒重的烧杯中，挥干至恒重，得到葱白的无水甲醇粗提取物、葱白的无水丙酮粗提物、葱白的无水石油醚粗提物、葱白的乙醇粗提取物。

实施例2：

将葱白的无水丙酮粗提取物，用无水丙酮稀释至10%，装入滴液漏斗中，由滴液漏斗向层析柱（大孔树脂XAD1180）滴流，上样完全后，用蒸馏水洗柱，直至层析柱中流出的蒸馏水与95%乙醇（ml/ml）混合不产生混浊为止，再用2BV的丙酮进行洗脱，层析柱中洗脱液的洗脱速率恒定为 0.5BV/h，再经减压浓缩挥干无水丙酮，即可，得到葱白的无水丙酮纯提物。  

实施例3：

将实施例1所制的四种葱白粗提物(葱白的无水甲醇粗提取物、葱白的无水丙酮粗提物、葱白的无水石油醚粗提物、葱白的乙醇粗提取物)分别溶解于二甲亚砜中(DMSO)，控制DMSO终浓度<l％(溶剂DMSO水溶液在试验条件下的抑制率为1.06％，该值已包含在抑制率计算时的误差内)再加入BG-11培养基配成浓度为0.1g/L。在无菌条件下通过0.22μm的微孔滤膜过滤以消除微生物，得到四种样品溶液。

取对数生长期的铜绿微囊藻分别放入已灭菌的100mL锥形瓶中，藻细胞最终浓度为5.5×10⁵ cells/mL，分别加入四种样品溶液溶液，使最终体积为50mL，最终浓度为0.1g/L。同时设不加粗提物的空白对照组(CK），每种处理组设3个平行，培养条件同1.2。每隔24h进行荧光值的测定，连续测5天。

其结果如表1、表2所示：

表1 四种葱白的粗提物对铜绿微囊藻的抑制率(%)

表2 四种葱白的粗提物对铜绿微囊藻抑制的EC₅₀

表1 显示的是在铜绿微囊藻起始密度相同条件下，葱白的无水丙酮粗提物在第四天抑制率达到了90.32%，第五天铜绿微囊藻几乎完全被杀死；浓度相同的葱白的无水甲醇粗提物、葱白的无水石油醚粗提物、葱白的75%乙醇粗提物在第五天的抑制率分别为81.66%、82.35%和87.28%。这说明，葱白的无水甲醇粗提物、葱白的无水石油醚粗提物、葱白的75%乙醇粗提物对铜绿微囊藻的抑制效果要差些。表2 显示的是四种葱白粗提物对铜绿微囊藻抑制的EC₅₀值。结果表明，葱白的无水丙酮粗提物的EC₅₀最小，为2.49g/L。葱白的无水甲醇粗提物、葱白的无水石油醚粗提物、葱白的75%乙醇粗提物的EC₅₀相差不大，且均大于葱白的无水丙酮粗提物。再次证明葱白的无水丙酮粗提物抑藻活性最佳。

实施例4：

称实施例2所制的纯提物溶解于DMSO中，再加入BG-11培养基配成溶液，在无菌条件下通过0.22μm的微孔滤膜过滤以消除微生物，得到葱白的无水丙酮纯提物溶液。

取对数生长期的铜绿微囊藻分别放入已灭菌的100mL锥形瓶中，藻细胞最终浓度为5.5×10⁵ cells/mL，加入葱白的无水丙酮纯提物溶液，并使最终体积为50mL。锥形瓶中葱白的无水丙酮提物溶液最终浓度分别为 0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L，同时设置不加提取液的空白对照组(CK)，每组设3个平行，培养条件同1.2。每隔24h进行荧光值的测定，连续测五天。

其结果如表3、表4所示：

表3 葱白的无水丙酮纯提物对铜绿微囊藻的抑制率(%)

表4 葱白的无水丙酮纯提物对对铜绿微囊藻抑制的EC₅₀

表3 显示，随着时间的增加抑制率呈增大趋势，且具有浓度效应。在第四天，高剂量组的抑制率就达到了97.78%，在第五天铜绿微囊藻几乎完全被抑制；其他处理组在第五天的抑制率分别为：58.93%和80.57%。表4显示，随着浓度的增大，EC₅₀值逐渐减小。表明纯化后的葱白的无水丙酮纯提物抑藻效果非常显著。

实施例5

对葱白的无水丙酮纯提物进行气质联用(GC-MS)分析。气相色谱条件为，进样口温度：260℃气化，流速：1.50mL/min，分流比：100:1，柱类型：RTX-5，30×0.25×0.25，升温程序：初始温度40℃，保持2min后，在10℃/min速度下加热至250℃，保持5min；质谱条件为，离子源温度：200℃，接口温度：250℃，检测器电压：0.81 kV，扫描间隔时间：0.5Sec，扫描荷质比：400-700aum，进样体积：1μL。应用NIST质谱数据库，分析质谱图，分析各组分物质。通过GC-MS分析鉴定出6种含量较高的化合物，主要为含硫化合物，分别为：烯丙硫醇 、环戊硫醇 、苯并噻吩-2-羧酸 、3，4-二甲基噻吩 此外还有醚和酯。

实施例6：

将对数生长期的铜绿微囊藻藻液加入已灭菌的100 mL锥形瓶中，藻细胞的最终密度为3.0×10⁵ cells/mL，并使体积最终保持为50mL。锥形瓶中烯丙硫醇、环戊硫醇单独以及两种醇混合(1:1)的最终浓度分别为0、0.01、0.03、0.09 、0.27和0.81g/L。其中，两种醇混合时每种醇的浓度均为单独时的一半，同时设只加藻液的空白对照组(CK)，每组设3个平行，各组置于1.2相同条件下培养，每隔24h进行荧光值的测定。

其结果如表5、6、7、8、9、10所示：

表5 烯丙硫醇对铜绿微囊藻的抑制率(%)

表6 环戊硫醇对铜绿微囊藻的抑制率(%)

表7 烯丙硫醇和环戊硫醇时对铜绿微囊藻的抑制率(%)

表8 烯丙硫醇对铜绿微囊藻抑制的EC₅₀

表9 环戊硫醇对铜绿微囊藻抑制的EC₅₀

表10 烯丙硫醇和换环戊硫醇联合时对铜绿微囊藻抑制的EC₅₀

表5、6和7显示，单独和联合时对铜绿微囊藻的抑制率随着时间的延长，浓度的增大，均呈增大趋势。单独抑藻时，烯丙硫醇在第三天的抑制率最大达到90.51%，环戊硫醇在第四天的抑制率最大达到90.11%；联合抑藻在第三天的抑制率最大达到97.90%；单独和联合作用均在第五天几乎完全将铜绿微囊藻杀死。单独抑藻时，二者在第一天和第二天的抑制率均未达到50%，故半抑制浓度按照其他天计算，表8、9和10显示的是单独和联合抑藻的EC₅₀，烯丙硫醇单独作用时EC₅₀分别为0.22、0.08和0.04 g/L；环戊硫醇单独作用时EC₅₀分别为0.21、0.08和0.05g/L；二者联合作用时，五天的半抑制浓度分别是0.56、0.35、0.13、0.05和0.02 g/L。结果表明，单独作用时烯丙硫醇的抑藻效果好于环戊硫醇，联合抑藻时的抑藻效果好于单独抑藻。

表11 联合作用评价参数

从表11中可看出，根据毒性单位法，M<1，此方法评价结果为协同效应；根据相加指数法，当M<1时AI=1/M-1，计算得AI>0，即为协同效应；根据相似性参数法，通过尝试法计算得λ>1，评价为协同效应。通过上述3种方法对烯丙硫醇和环戊硫醇进行联合效应评价，均表现为协同效应，充分说明了烯丙硫醇和环戊硫醇对铜绿微囊藻具有协同作用，同时证明了二者联合比单独时对铜绿微囊藻的抑制效果要好。

抑藻剂专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。