专利摘要

专利摘要

本发明涉及一种铜绿微囊藻的抑制方法，使用鱼腥草提取物进行抑制，本发明抑制剂原料来源丰富易得，对蓝藻水华的治理过程环保，不会对水体产生二次污染。

权利要求

1.一种铜绿微囊藻的抑制方法，使用鱼腥草提取物进行抑制。 

2.如权利要求1所述的抑制方法，其特征在于：所述鱼腥草提取物使用水或有机溶剂进行提取。 

3.如权利要求2所述的抑制方法，其特征在于：所述鱼腥草提取物使用水进行提取的方法是：将干鱼腥草打碎成粉，将鱼腥草粉末和蒸馏水按质量比为1:5-1:15浸提3天以上，过滤，制得鱼腥草提取液即鱼腥草提取物。 

4.如权利要求3所述的抑制方法，所述抑制方法中使用鱼腥草的水提取物抑制铜绿微囊藻时的用量为：以细胞密度为8.0×10⁵cells/mL的铜绿微囊藻培养液计，培养液中鱼腥草的水提取液含量大于等于5%。 

5.如权利要求4所述的抑制方法，所述铜绿微囊藻培养液中鱼腥草的水提取液含量大于等于10%。 

6.如权利要求2所述的抑制方法，所述鱼腥草提取物使用有机溶剂进行提取的方法是：将鱼腥草打碎成粉，将鱼腥草粉末和有机溶剂按质量比为1:3-1:8浸提3h以上，然后将浸提液放入烘箱30-40℃烘干，制得鱼腥草提取物。 

7.如权利要求6所述的抑制方法，所述有机溶剂选自丙酮、乙酸乙酯、石油和乙醇中的一种或几种。 

8.如权利要求7所述的抑制方法，所述有机溶剂为乙酸乙酯。 

9.如权利要求6所述的抑制方法，所述抑制方法中使用鱼腥草的有机溶剂提取物抑制铜绿微囊藻时的用量为：以50ml细胞密度为6-7×10⁵cells/mL的铜绿微囊藻培养液计，培养液中鱼腥草的有机溶剂提取物含量大于等于5mg。 

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种铜绿微囊藻的抑制方法。

背景技术

水华是目前社会较为关注和亟待解决的水域生态环境问题之一，探索有效的防治方法对保护水环境有着重要的意义。铜绿微囊藻是常见的水华蓝藻，可产生微囊藻毒素，当其富集于鱼类或贝类中并通过食物链传递至人体，会对人类健康构成威胁，有效防治蓝藻水华的发生具有重要的现实意义。

国内外已有大量关于抑藻方面的研究，其中关于利用植物分离出化感物质抑藻的报道不少，如从橘皮中提取的黄酮类物质具有良好的抑藻作用，分离自蓖齿眼子菜的半日花烷型二萜类可显著抑制羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)的生长,分离自小球藻的C18脂肪酸对近头状伪蹄形藻(Pseudokirchneriella subcapitata)有显著的抑制作用。但未见使用生物材料鱼腥草对铜绿微囊藻进行抑制的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种铜绿微囊藻的抑制方法，本发明使用鱼腥草提取物进行抑制，本发明抑制剂原料来源丰富易得，对蓝藻水华的治理过程环保，不会对水体产生二次污染。

本发明采用的技术方案是：

一种铜绿微囊藻的抑制方法，使用鱼腥草提取物进行抑制。

所述鱼腥草提取物使用水或有机溶剂进行提取。

所述鱼腥草提取物使用水进行提取的方法是：将干鱼腥草打碎成粉，将鱼腥草粉末和蒸馏水按质量比为1:5-1:15浸提3d以上，过滤，制得鱼腥草提取液即鱼腥草提取物。

所述鱼腥草提取物使用有机溶剂进行提取的方法是：将鱼腥草打碎成粉，将鱼腥草粉末和有机溶剂按质量比为1:3-1:8浸提3h以上，然后将浸提物放入烘箱30-40℃烘干，制得鱼腥草提取物。

所述有机溶剂选自丙酮、乙酸乙酯、石油和乙醇中的一种或几种，优选乙酸乙酯。

所述抑制方法中使用鱼腥草的水提取液抑制铜绿微囊藻时的用量为：以细胞密度为8.0×10⁵cells/mL的铜绿微囊藻培养液计，其中鱼腥草的水提取液含量大于等于5%，优选含量大于等于10%；

所述抑制方法中使用鱼腥草的有机溶剂提取物抑制铜绿微囊藻时的用量为：以50ml细胞密度为6-7×10⁵cells/mL的铜绿微囊藻培养液计，培养液中鱼腥草的有机溶剂提取物含量大于等于5mg。

对于铜绿微囊藻的抑制，也可以直接使用鱼腥草鲜全草的汁液进行抑制。

附图说明

图1为实施例1不同浓度的鱼腥草水提取液对铜绿微囊藻的抑制作用测试图；

图2为实施例4不同浓度的鱼腥草丙酮粗提物对铜绿微囊藻的抑制作用测试图；

图3为实施例4不同浓度的鱼腥草乙酸乙酯粗提物对铜绿微囊藻的抑制作用测试图；

图4为实施例4不同浓度的鱼腥草石油醚粗提物对铜绿微囊藻的抑制作用测试图；

图5为实施例4不同浓度的鱼腥草乙醇粗提物对铜绿微囊藻的抑制作用测试图；

图6为实施例4中第5天各处理组对铜绿微囊藻的抑制作用测试图。

具体实施方式

实施例1

本实施例铜绿微囊藻PCC7806(M.aeruginosat PCC7806）由中国科学院水生生物研究所藻种库提供，采用BG-11培养基培养，BG-11培养基主要成分：NaNO3，1.5g/L；K2HPO4·3H2O，0.04g/L；MgSO4·7H2O，0.075g/L；CaCl2·2H2O，0.036g/L；柠檬酸，0.006g/L；柠檬酸铁铵，0.006g/L；EDTA，0.001g/L；Na2CO3，0.02g/L；A5solution，0.1mL；其中A5solution配方：H3BO3，2.86g/L；MnCl2·4H2O，1.86g/L；ZnSO4·7H2O，0.22g/L；Na2MoO4·2H2O，0.39g/L；CuSO4.·5H2O，0.08g/L；Co（NO3）2·6H2O，0.05g/L。

将铜绿微囊藻进行扩大培养。培养条件为：光照强度4000lx，光暗比为12h：12h，温度（25±1）℃，每天摇动3-5次，使藻细胞进入对数生长期。

抑制率（inhibition rate）按以下计算公式计算得出：

IR=（1－N／N₀）×100%

式中，IR---抑制率；N---处理组藻密度（cells ml^-1）；N₀---对照组藻密度（cells ml^-1）。

使用粉碎机将晒干的鱼腥草打碎成粉，过150目筛子。鱼腥草粉末和蒸馏水按质量比为1:10浸提4d，过滤，滤液即为鱼腥草水提取液。

取对数生长期的铜绿微囊藻分5组分别放入5只100mL锥形瓶中，再加入不同稀释倍数的BG-11培养基使各组培养基最终密度相等，藻细胞最终密度均为8.0×10⁵cells/mL，分别向5只锥形瓶中加入鱼腥草水提取液并使藻液最终体积为50mL，以及使鱼腥草水提取液在藻液的最终含量分别为0、5%、10%、20%、40%，使用铜绿微囊藻进行扩大培养的相同条件进行培养。每隔24h进行细胞计数，连续测定5d，并根据抑制率公式求出各提取液对藻类的抑制率(IR)。

抑制率测定结果见图1，由图1可以看出，鱼腥草水提取液在藻液中含量越高，其抑制效果越好，当含量超过10%时，5天后即可完全抑制铜绿微囊藻的生长。

实施例2

方法总体同实施例1，不同处在于制备鱼腥草水提取液时鱼腥草粉末和蒸馏水按质量比为1:15浸提6d。

实施例3

方法总体同实施例1，不同处在于制备鱼腥草水提取液时鱼腥草粉末和蒸馏水按质量比为1:5浸提3d。

实施例4

使用粉碎机将鱼腥草打碎成粉，过150目筛子。称取4份鱼腥草粉末各18g，分别用丙酮、乙酸乙酯、石油醚、乙醇4种有机溶剂各120mL通过索氏提取仪提取3h，然后将浸提物放入40℃烘箱烘干，得到4份鱼腥草有机溶剂提取物即依次为丙酮粗提物、乙酸乙酯粗提物、石油醚粗提物和乙醇粗提物。

取对数生长期的铜绿微囊藻分别放入4组各5只100mL锥形瓶中，再加入不同稀释倍数的BG-11培养基使各组培养基最终密度相等，藻细胞最终密度均为6-7×10⁵cells/mL，4组锥形瓶中分别加入丙酮粗提物、乙酸乙酯粗提物、石油醚粗提物和乙醇粗提物，并使藻液最终体积为50mL，各组中5只锥形瓶中粗提物的最终浓度分别为0、0.1g/L、0.5g/L、2.5g/L、12.5g/L，各组使用铜绿微囊藻进行扩大培养的相同条件进行培养。每隔24h进行细胞计数，连续测定5d，并根据抑制率公式求出各提取物对藻类的抑制率(IR)。

抑制率测定结果见图2～6，由图2～6可以看出，鱼腥草有机溶剂提取物对铜绿微囊藻有明显的抑制作用，且表现为一定的时间和剂量效应，即随着时间的延长及粗提物浓度的增加，各处理组对铜绿微囊藻的抑制率逐渐升高。并且乙酸乙酯粗提物的效果最好。

铜绿微囊藻的抑制方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。