专利摘要

专利摘要

本发明提供了一种粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子，并提出了其在宿主菌中的作用。本发明的粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子，其序列为SEQIDNO：2所示序列。本发明还提供所述的锚蛋白重复子在宿主菌中的抑制作用。本发明的第三个目的是提供锚蛋白重复子对磷脂酶A1在大肠杆菌中表达的促进作用。本发明还提供含有粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子的重组载体和重组菌株。由实验可知，粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子的表达对宿主菌具有明显的抑制作用；粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子对磷脂酶A1在大肠杆菌中的高活性表达具有较大的促进作用。

权利要求

1.粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子，所述重复子序列为SEQ ID NO：2所示序列。

2.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子在宿主菌中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述应用为锚蛋白重复子在宿主菌中表达时对宿主菌的抑制作用。

4.根据权利要求3所述的应用，所述应用为锚蛋白重复子与磷脂酶A1在宿主菌中共表达时对宿主菌的抑制作用。

5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌。

6.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子对磷脂酶A1在大肠杆菌中表达中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用为粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子对磷脂酶A1在大肠杆菌中表达时起促进作用。

8.重组载体，其含有权利要求1所示的粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子。

9.重组菌株，其含有权利要求1所示的粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种粘质沙雷氏菌锚定蛋白重复子。 

背景技术

锚定蛋白最早是在各种真核生物中发现，是一种广泛存在的受体蛋白，典型的锚定蛋白包括四个部分：锚蛋白重复子组成的结合域，隐蛋白结合域，致死域和C-末端域。研究表明，锚蛋白重复子结构广泛存在于各种细胞和组织中，一般认为锚蛋白重复子参与蛋白间相互作用。原核细胞中也存在大量的锚蛋白重复子，参与各种分子内和分子间的相互作用，在某些病原菌如嗜肺军团菌和立克次氏体中，锚蛋白重复子还参与效应蛋白的分泌。在粘质沙雷氏菌中也存在这样的锚蛋白重复子，经比对此锚蛋白重复子序列在粘质沙雷氏菌和耶尔森氏菌中氨基酸相似度较高。目前关于粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子还尚未有相关的研究。 

发明内容

本发明提供了粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子的序列，并研究了其在宿主菌中的作用，以及其对磷脂酶A1在大肠杆菌中表达时的作用。 

本发明的第一个目的是提供粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子，所述重复子序列为SEQ ID NO：2所示序列。 

本发明的第二个目的是提供粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子在宿主菌中的应用。 

所述应用为锚蛋白重复子在宿主菌中表达时对宿主菌的抑制作用。 

所述应用为锚蛋白重复子与磷脂酶A1在宿主菌中共表达时对宿主菌的抑制作用。 

所述宿主菌为大肠杆菌。 

本发明的第三个目的是提供粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子对磷脂酶A1在大肠杆菌中表达中的应用。 

所述应用为粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子对磷脂酶A1在大肠杆菌中表达时起促进作用。 

本发明的第四个目的是提供一种重组载体，其含有权利要求1所示的粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子，例如所述载体可以是pET-28a（+）。 

本发明的第五个目的是提供一株重组菌株，其含有权利要求1所示的粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子。 

将锚蛋白重复子基因导入大肠杆菌中构建基因工程菌，发现锚蛋白重复子单独表达及与磷脂酶A1基因共表达时均对宿主菌的生长具有明显的抑制作用。可发现粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子的表达对宿主菌具有明显的抑制作用，不论是其单独表达还是和其他基因共表达。 

将锚蛋白重复子与磷脂酶A1基因在大肠杆菌中共表达时，可发现，粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子对磷脂酶A1基因在大肠杆菌中的高活性表达具有较大的促进作用。本发明为粘质沙雷氏菌致病机制及进一步提高磷脂酶A1活性的研究提供了一个新的思路。 

附图说明

图1为重组质粒plaS-pET-28的构建示意图； 

图2 为在IPTG诱导和无IPTG诱导条件下plaS-pET-28/BL21的生长曲线；

图3 为plaA-pET-28、plaA-plaS-pET-28质粒图谱；

图4 为在IPTG诱导和无IPTG诱导条件下plaA-pET-28/BL21和plaA-plaS-pET-28/BL21的生长曲线；

图5为粘质沙雷氏菌PL-06镜检图片；

图6为锚蛋白重复子序列的蛋白结构域预测图；

图7为锚蛋白重复子序列的三级结构预测图。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。 

材料和试剂： 

所用限制性内切酶，T4 DNA连接酶，PCR试剂，质粒提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒等均购于上海生工生物工程公司；引物合成和测序由上海英骏生物技术有限公司完成；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。

KLB培养基的制备方法：1%（W/V）胰蛋白胨，0.5%（W/V）酵母提取物，1%（W/V）氯化钠，NaOH调pH值至7.2，121℃灭菌20min。待冷凉至50~60℃时加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素。 

实施例1 粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子的制备

取出从4℃冰箱中保藏的粘质沙雷氏菌PL-06，挑取单克隆接种至LB液体培养基中， 37℃，200r/min过夜培养10-12小时经显微镜观察及16SrDNA鉴定，证实与GenBank中公布的各种粘质沙雷氏菌的16SrDNA的同源性为99%，从而确定该菌株为粘质沙雷氏菌，镜检图片如图5，16SrDNA序列如序列表中序列1，genbank登录号：JX138534。

根据基因组全序列已公布的粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子序列（GenBank: AY091641.1）为参照设计上游引物SF和下游引物SR： 

上游引物SF：5’- CATGCCATGGTA CCTGAAGGGCGTCGCTT -3’ 

下游引物SR：5’- CCCCTCGAGA CTGCTGCGCGTAGTG -3’。

以上述的粘质沙雷氏菌PL-06基因组为模板，进行PCR扩增，PCR体系和步骤如下： 

模板DNA(约1μg/μl)    1μL

PB-1                    1μL         

PB-2                    1μL

10× PCR Buffer          5μL

10mmol/L dNTP           2μL

25mmol/L MgCl₂                     4μL

Taq DNA 聚合酶(5U/μl)  1μL

dd H₂O                   35μL

总体积为50μL，98℃预变性 5min，95℃变性35s，55℃退火35s， 72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸8min。

利用PCR技术将其基因组中编码锚蛋白重复子序列的基因plaS扩增出来，并进行基因测序。得到的锚蛋白重复子plaS的基因序列见序列表中序列2。其氨基酸序列见序列表中序列3。 

如图6所示，根据蛋白结构域预测，锚蛋白重复子序列包含至少四个锚蛋白结构域，是由核苷酸序列翻译的蛋白质序列预测得到的，使用的工具为：InterPro数据库（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）；三级结构如图7所示：预测时使用工具为SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/），根据三级结构可见很多的重复螺旋结构。 

本发明的粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子也可以通过人工合成序列的方法获得。 

实施例2重组菌株plaS-pET-28/BL21的构建及其菌体生长情况

①    将实施例1扩增得到的产物plaS胶回收，用限制性内切酶NcoI、XhoI双酶切上述回收产物及pET-28a（+）质粒载体，酶切体系如下：

DNA               10μL 

NcoI              1μL

XhoI              1μL

Buffer K          5μL

灭菌双蒸水        33μL 

总体积             50μL。

混匀后，37℃温浴2h，结束后每50μL反应液加入10μL 6×Loading Buffer终止反应，回收酶切片段（约0.7kb和5.4kb），将这两个片段用T4 DNA连接酶连接，连接反应体系如下： 

PCR双酶切产物                  12μL

pET-28a（+）双酶切产物     8μL

Ligase                                 2μL

10×Ligase Buffer                  5μL

灭菌双蒸水                      23μL

总体积                              50μL。

16℃过夜连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，随机挑取单克隆，使用SF和SR引物扩增plaS基因，确认构建成功，得到plaS-pET-28 重组质粒（见图1）。 

②将重组质粒plaS-pET-28通过CaCl₂法转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，得到重组大肠杆菌plaS-pET-28/BL21。 

③将步骤②得到的plaS-pET-28/BL21接种于KLB培养基中37℃，200r/min振荡过夜培养，将得到的培养物以1%(V/V)接种量转接至KLB培养基中，至OD₆₀₀值为0.9时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导，每隔1小时测定一次OD₆₀₀值，绘制生长曲线，如图2。由生长曲线可知，粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子的表达对宿主菌表现明显的抑制作用。 

实施例3重组菌株plaA-pET-28/BL21和plaA-plaS-pET-28/BL21的构建及其菌体生长情况

①    以上述粘质沙雷氏菌PL-06基因组为模板，进行PCR扩增，扩增得到磷脂酶A1基因plaA（见序列表中序列4）和磷脂酶A1基因+锚蛋白重复子基因即plaA-plaS（见序列表中序列5），其中序列4中划横线部分为plaA序列和plaS序列交叉共有的部分，序列5中划横线的部分是plaS序列；

其中，PCR扩增plaA时的引物：

上游引物AF: CATGCCATGGGCAGTATGCCTTTAAGT，

下游引物AR: CCCCTCGAGAGGCATTGGCCTTCGCCTC。

扩增条件如下： 

AF                               1μL         

AR                                1μL

10× PCR Buffer                             5μL

10mmol/L dNTP                 2μL

25mmol/L MgCl₂              4μL

Taq DNA 聚合酶(5U/μl)          1μL

dd H₂O                        35μL。

总体积为50μL，98℃预变性 5min，95℃变性35s，55℃退火35s， 72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸8min。 

PCR扩增plaA-plaS时的引物： 

上游引物ASF: CGGGATCCATGAGTATGCCTTTAAG，

下游引物ASR: CGGAATTCTTACTGCTGCGCGTAGTGCGTG。

扩增条件如下： 

ASF                          1μL         

ASR                           1μL

10× PCR Buffer              5μL

10mmol/L dNTP               2μL

25mmol/L MgCl₂               4μL

Taq DNA 聚合酶(5U/μl)      1μL

dd H₂O                       35μL。

总体积为50μL，98℃预变性 5min，95℃变性35s，55℃退火35s， 72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸8min。 

②    将步骤①得到的plaA，plaA-plaS基因片段（约为1kb和1.7kb）胶回收，用限制性内切酶EcoRI、BamH I双酶切上述回收产物及pET-28a（+）质粒载体，将plaA，plaA-plaS基因分别与pET-28a（+）质粒载体用T4 DNA连接酶连接； 

其中，酶切反应体系如下： DNA                 10μL 

BamH I               1μL

EcoR I             1μL

Buffer K        5μL

灭菌双蒸水      33μL 

总体积            50μL。

37℃温浴2h，结束后每50μL反应液加入10μL 6×Loading Buffer终止反应。 

连接反应体系如下： 

PCR双酶切产物                   12μL

pET-28a（+）双酶切产物       8μL

Ligase                                  2μL

10×Ligase Buffer              5μL

灭菌双蒸水                       23μL

总体积                           50μL

16℃过夜连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，随机挑取单克隆，应用上述扩增plaA时的引物和方法进行扩增plaA，应用上述扩增plaA-plaS时的引物和方法进行扩增plaA-plaS，确认构建成功后，得到plaA-pET-28和plaA-plaS-pET-28重组质粒（图3）。

③将步骤②得到的重组质粒通过CaCl₂法转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，得到重组大肠杆菌plaA-pET-28/BL21和plaA-plaS-pET-28/BL21。 

④将plaA-pET-28/BL21和plaA-plaS-pET-28/BL21接种于KLB培养基中37℃，200r/min振荡过夜培养，以1%接种量 (V/V，)转接至KLB培养基中，至OD₆₀₀值为0.9时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导，每隔1小时测定一次OD₆₀₀值，绘制生长曲线，如图4。由生长曲线可知，在大肠杆菌中表达磷脂酶A1时，粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子的表达也对宿主菌表现明显的抑制作用。 

实施例4 重组菌株plaS-pET-28/BL21，plaA-pET-28/BL21和plaA-plaS-pET-28/BL21磷脂酶A1酶活测定

磷脂酶A1酶活的测定参照国标GBT 23535-2009脂肪酶酶活测定方法。酶活力定义为：在一定条件下1min 内水解卵磷脂产生1微摩尔(μmol)游离脂肪酸所需的酶量即为一个酶活力单位(U)。测定结果见表1。

。 

如表1所示，可知，（1）相对于plaA-pET-28/BL21菌株，plaA-plaS-pET-28/BL21的磷脂酶A1的酶活明显较高；（2）plaA-plaS-pET-28/BL21中磷脂酶A1大部分是胞外表达的，而且活性较高；（3）plaA-plaS-pET-28/BL21上清中的蛋白浓度含量很高。由此可见粘质沙雷氏菌锚蛋白重复子对磷脂酶A1的大肠杆菌高活性表达有较大的促进作用。 

研究表明其在磷脂酶A1基因在大肠杆菌中表达过程中可以促进磷脂酶A1的高效表达，因此也被认为是磷脂酶A1辅助蛋白。磷脂酶A1作为诸多致病菌的毒力因子，其致病性可能与锚蛋白重复子有关。 

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

序列表

<110>  安徽工程大学

<120>  粘质沙雷氏菌锚定蛋白重复子及其应用

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  1407

<212>  DNA

<213>  粘质沙雷氏菌

<400>  1

tgcaagtcga gcggtagcac aggggagctt gctccctggg tgacgagcgg cggacgggtg       60

agtaatgtct gggaaactgc ctgatggagg gggataacta ctggaaacgg tagctaatac      120

cgcataacgt cgcaagacca aagaggggga ccttcgggcc tcttgccatc agatgtgccc      180

agatgggatt agctagtagg tggggtaatg gctcacctag gcgacgatcc ctagctggtc      240

tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc      300

agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt gtgtgaagaa      360

ggccttcggg ttgtaaagca ctttcagcga ggaggaaggt ggtgaactta atacgttcat      420

caattgacgt tactcgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata      480

cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg cggtttgtta      540

agtcagatgt gaaatccccg ggctcaacct gggaactgca tttgaaactg gcaagctaga      600

gtctcgtaga ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa atgcgtagag atctggagga      660

ataccggtgg cgaaggcggc cccctggacg aagactgacg ctcaggtgcg aaagcgtggg      720

gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgctgtaa acgatgtcga tttggaggtt      780

gtgcccttga ggcgtggctt ccggagctaa cgcgttaaat cgaccgcctg gggagtacgg      840

ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt      900

ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tactcttgac atccagagaa ctttccagag      960

atggattggt gccttcggga actctgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt     1020

tgtgaaatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tatcctttgt tgccagcggt     1080

tcggccggga actcaaagga gactgccagt gataaactgg aggaaggtgg ggatgacgtc     1140

aagtcatcat ggcccttacg agtagggcta cacacgtgct acaatggcat atacaaagag     1200

aagcgacctc gcgagagcaa gcggacctca taaagtatgt cgtagtccgg attggagtct     1260

gcaactcgac tccatgaagt cggaatcgct agtaatcgta gatcagaatg ctacggtgaa     1320

tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt gcaaaagaag     1380

taggtagctt aaccttcggg agggcgc                                         1407

<210>  2

<211>  772

<212>  DNA

<213>  粘质沙雷氏菌锚定蛋白重复子

<400>  2

atgcctgaag ggcgtcgctt gcggcgagcg ctggcgatag ccttactggc gctggccgcg       60

gtgaccggtt tactgatgat ggctaaggag caacagatgg ggcaggagat ttcaccgttt      120

gacggccgcg gcaacccggc gctggctcag gcggtggcgc gcggcgatgc gcagggcatc      180

catgcgcagg ctacgcagga tcgcttgcgc gaacggggcg atcggcaggt cacgctgttg      240

cagtgggcgg tgctttcgca gcagccggcc agcgtgcagg cgttactgga tctcggggcc      300

gacccgtcgg tagcggggct ggacggcaac agcgcgctgc acaccgcggc gatactgcaa      360

gacgcgcagt atctgcggtt actgctggct gaaggggcgc aggtgaacgt gcgcaatgcc      420

gttaccggcg ccacgccgct tgcggcggcg gtgctggccg ggcgcgagga gcaactgcgg      480

ttgttgctgg cggccggggc ggacaccgcc ctgagcgatc ggctggggga taccccgctg      540

catctggcgg cgaagatcaa cgcgccgcat ctggcgctgt tgctgttgca ggccggggcc      600

gatgcccagg cgcgcaatca gcagggttat gcgttccagt tttatttctc acaaacgccg      660

gcgcatttgc agaatgacga gctgaaggcg cagttccgcg agctggataa atggctgcag      720

gggcgccgcc tggccacgca ctacgcgcag cagtaa                                756

<210>  3

<211>  251

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  3

Met Pro Glu Gly Arg Arg Leu Arg Arg Ala Leu Ala Ile Ala Leu Leu

1               5                   10                  15     

Ala Leu Ala Ala Val Thr Gly Leu Leu Met Met Ala Lys Glu Gln Gln

            20                  25                  30         

Met Gly Gln Glu Ile Ser Pro Phe Asp Gly Arg Gly Asn Pro Ala Leu

        35                  40                  45             

Ala Gln Ala Val Ala Arg Gly Asp Ala Gln Gly Ile His Ala Gln Ala

    50                  55                  60                 

Thr Gln Asp Arg Leu Arg Glu Arg Gly Asp Arg Gln Val Thr Leu Leu

65                  70                  75                  80 

Gln Trp Ala Val Leu Ser Gln Gln Pro Ala Ser Val Gln Ala Leu Leu

                85                  90                  95     

Asp Leu Gly Ala Asp Pro Ser Val Ala Gly Leu Asp Gly Asn Ser Ala

            100                 105                 110        

Leu His Thr Ala Ala Ile Leu Gln Asp Ala Gln Tyr Leu Arg Leu Leu

        115                 120                 125            

Leu Ala Glu Gly Ala Gln Val Asn Val Arg Asn Ala Val Thr Gly Ala

    130                 135                 140                

Thr Pro Leu Ala Ala Ala Val Leu Ala Gly Arg Glu Glu Gln Leu Arg

145                 150                 155                 160

Leu Leu Leu Ala Ala Gly Ala Asp Thr Ala Leu Ser Asp Arg Leu Gly

                165                 170                 175    

Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Lys Ile Asn Ala Pro His Leu Ala

            180                 185                 190        

Leu Leu Leu Leu Gln Ala Gly Ala Asp Ala Gln Ala Arg Asn Gln Gln

        195                 200                 205            

Gly Tyr Ala Phe Gln Phe Tyr Phe Ser Gln Thr Pro Ala His Leu Gln

    210                 215                 220                

Asn Asp Glu Leu Lys Ala Gln Phe Arg Glu Leu Asp Lys Trp Leu Gln

225                 230                 235                 240

Gly Arg Arg Leu Ala Thr His Tyr Ala Gln Gln

                245                 250    

<210>  4

<211>  966

<212>  DNA

<213> plaA

<400>  4

atgggcagta tgcctttaag ttttacctct gcagtatccc cggtggccgc gatccctaca       60

cctcgcgccg ttgccgagac ggcgacggcg gcgcagtctg cggcagcgcc ggcaaatccg      120

gcgccggtgg ccactccctc tcagaactcg ctcaatgcgc aggccctgtt gaatacgctg      180

gtcggcgata tctccgcggc ggcgccgacg gcggcggcag cgccgggcgt gacccggggg      240

cagcaatcgc aggaaggtga ttatgcgttg gcgctgttgg ccaaggacgt ttattcactg      300

aacggtcagg gtgccgctgg gttcaaccgc ttgagcgaca gcgcgctgct cggtttcggc      360

atcgatcccg ccagcctgca cgacgcgggc agcggtttcc aggccggggt ttacagcaac      420

gacaagcagt atgtgttggc gtttgccggc accaacgact ggcgcgactg gctgagcaac      480

gtgcggcaag cgacgggcta tgatgatgtg cagtacaatc aggcggttgc cgccgccaaa      540

agcgccaagg cggtcttcgg cgatgcgctg gtgatcgccg gtcattcgct cggcggcggt      600

ctggcggcca cggcggcgct ggcgaccggc accgtcgcgg tcaccttcaa tgcggccggg      660

gtgtcagatt acacgctgaa tcgcctgggt atcgatccgg cggcggcgaa gaaagacgcc      720

gaagccggcg gcatccgtcg ttacagcgaa caatatgaca tgccgaccag cacccgggaa      780

tcgacttcgc tgatcccgga cgccattggc cacaacatca ccctggccaa caacgatacc      840

ctgaccggta tcgatgactg gcggccgagc aagcatctgg atcgcagcct gacggcgcac      900

ggcatcgaca aggtgataag ctcgatggcg gaacaaaagc cgtgggaggc gaaggccaat      960

gcctga                                                                966

<210>  5

<211>  1711

<212>  DNA

<213> plaA-plaS

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粘质沙雷氏菌锚定蛋白重复子及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。