专利摘要

本发明提供一种具有抗胶质瘤活性的化合物缬氨霉素B，提供从海泥中分离培养到活性物质产生菌小链霉菌,并从中制备获得活性物质缬氨霉素B。所述的小链霉菌保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为小链霉菌P11‑23B，(StreptomycesparvulusP11‑23B)保藏编号CCTCCNO：M2015675，保藏日2015.11.12。缬氨霉素B具有显著抑制多种脑胶质瘤细胞增殖、明显阻滞胶质瘤细胞周期于G0/G1期、降低胶质瘤细胞不同代谢途径的多个关键酶的蛋白水平表达，具有独特的抗肿瘤作用。因此，缬氨霉素B可在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。缬氨霉素B化学结构式为： CCTCCNO：M2015675 20151112

权利要求

1.一种抗胶质瘤活性物质缬氨霉素B(Valinomycin B)，其特征在于，具有以下化学结构式：

2.一种小链霉菌P11-23B，其特征在于，所述的小链霉菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为小链霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)，保藏编号CCTCC NO：M 2015675，保藏日2015.11.12，保藏地址：中国武汉。

3.权利要求1所述的抗胶质瘤活性物质缬氨霉素B的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)小链霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)发酵菌液的制备：

取小链霉菌P11-23B的菌落接种到含有一定量的液体菌种培养基的大三角烧瓶中，将含有P11-23B菌种的培养液在室温条件下振荡培养一定时间后以制备菌种液，最后将菌种液转入含有一定量的液体发酵培养基的大三角烧瓶，在室温条件下振荡发酵培养一定时间后，得到具有抗肿瘤活性的P11-23B的发酵菌液；

所述的液体菌种培养基和液体发酵培养基均为液体高氏培养基；所述的用量为100-200mL；所述的大三角培养瓶为250或500mL；所述的室温培养温度为20～30℃；所述的振荡的转速为160-180rpm；所述的培养时间为5～15天；

(2)缬氨霉素B的提取分离纯化

菌株P11-23B的发酵菌液用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析分离，分别用70％和100％的甲醇洗脱，100％的甲醇洗脱液合并后经减压浓缩得到的残留物用HPLC分离，得到纯化合物缬氨霉素B；

所述柱层析的十八烷基硅烷键合硅胶用量与上量的样品量比例是40～60g：1.0g；所述的高效液相分离条件是:Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent 1260DAD检测器，Agilent Zorbax SB-C₁₈色谱柱250×9.4mm,5μm，100％甲醇为流动相，柱温26℃,检测波长210nm，流速为1.0mL/min；

(3)缬氨霉素B的结构鉴定：

根据一维和二维的NMR光谱、高分辨质谱数据、以及化学降解方法鉴定缬氨霉素B的结构。

4.权利要求2所述的小链霉菌的制备方法，其特征在于，通过以下步骤分离培养而获得：

(1)小链霉菌P11-23B的分离培养：

取空气干燥的海泥用海水稀释成一定的浓度，取一定量的样品稀释液均匀分散到含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下培养一定时间后,将不同的菌落分别转移到另一含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下继续培养一定时间，最后将单一菌落(P11-23B)接种到斜面培养基培养后置4℃冰箱保存备用；

所述的海泥和海水是从浙江舟山东海海域中获得；所述样品稀释液的浓度为1×10^-6～1×10^-4g/mL；所述的样品稀释液的取样量为100～300μL；所述培养皿所含的固体培养基为高氏琼脂(Gause′s agar)培养基或其它固体培养基；所述的斜面培养基为高氏琼脂培养基或其它固体斜面培养基；所述的室温培养温度为20～30℃；所述的培养时间为7～15天；

(2)小链霉菌P11-23B的菌种鉴定：

上述步骤(1)分离培养所获得的菌株用目前实验室普遍使用的16S rDNA序列分析方法鉴定菌株P11-23B的种类，确定为小链霉菌，分类命名为Streptomyces parvulus P11-23B，已被中国典型培养物保藏中心-武汉中心保藏，保藏编号CCTCC NO：M2015675。

5.根据权利要求1所述的活性物质缬氨霉素B在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为缬氨霉素B活性成分单独，或与其它药物或与有效成分一起，与药学上可接受的载体组成的药物。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式为液体制剂、固体制剂、胶囊制剂、缓释制剂、纳米制剂。

说明书

技术领域

本发明属医药领域，涉及从海洋放线菌小链霉菌(Streptomyces parvulus P11-23B)中制备抗肿瘤活性化合物缬氨霉素B(Valinomycin B)的方法及该化合物在制备治疗脑胶质瘤药物方面的应用。

背景技术

脑胶质瘤是脑颅内最常见和最恶性的脑肿瘤，占所有恶性脑肿瘤的70％。世界卫生组织统计数据表明：恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35～54岁患者的第3位死亡原因，严重危害人类的健康及生命。胶质瘤由于所处的位置特殊，手术难度大而且不容易将肿瘤全部切除，所以放疗和药物对胶质瘤的治疗尤为重要。可是，目前抗胶质瘤药物严重缺乏，替莫唑胺是唯一可选择的单独用于胶质瘤治疗的药物。而且，包括替莫唑胺在内的现有治疗胶质瘤药物的疗效有限,多有严重不足,突出表现为:(1)多为化学品,毒副作用大；(2)肿瘤细胞对药物的严重耐药性；(3)血脑屏障阻碍了药物到达脑内发挥其疗效。因此，临床上需要克服以上缺陷，疗效更好、安全性更高和作用机制独特的新型抗胶质瘤药物。

大量研究证明：过度的糖酵解(Glycolysis)、旺盛的谷氨酰胺分解(Glutaminolysis)和脂类合成(Lipogenesis)是胶质瘤细胞代谢不同于正常细胞代谢的突出特征。胶质瘤细胞从微环境中摄取大量葡萄糖在糖酵解环节由胶质瘤细胞特异依赖而高表达的多个关键酶包括己糖激酶2(HK2)、磷酸果糖激酶/果糖2,6-二磷酸酶(PFKFB3)、丙酮酸激酶M2(PKM2)和乳酸脱氢酶5(LDH5)等共同参与产生大量中间产物和终产物乳酸，这些中间产物是肿瘤细胞合成生物大分子的起始原料,而乳酸分泌至细胞外可抑制机体免疫细胞对肿瘤细胞的清除能力,可促进肿瘤细胞扩散,高表达的糖酵解关键酶HK2还可提高肿瘤细胞对放疗和替莫唑胺化疗的抗性。同时，谷氨酰胺酶(GLS)主导的旺盛的谷氨酰胺分解，为生物分子的合成提供大量的氮源，而高表达的脂肪酸合成酶(FASN)主导的活跃的脂类合成有利于细胞膜的生成。不难理解，正是肿瘤细胞高度利用其代谢中间产物合成生物大分子DNA、RNA、蛋白质和生物膜的能力促使其快速无限制地增殖,调控肿瘤代谢不同环节的关键酶可有效抑制肿瘤细胞的增殖。因此，靶向胶质瘤代谢不同环节关键酶的多靶点作用的药物可能具有更好的抗肿瘤疗效。缬氨霉素B(Valinomycin B)是从海洋细菌小链霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)中分离得到的新化合物，该化合物对多种不同胶质瘤细胞的增殖具有显著的抑制作用，可明显降低胶质瘤细胞糖酵解、谷氨酰胺分解和脂类合成途径中数个关键酶的蛋白表达水平，具有独特的抗肿瘤作用机制，因此，缬氨霉素B在制备抗胶质瘤药物方面具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有抗胶质瘤活性的化合物缬氨霉素B(Valinomycin B，化合物1)，所述的缬氨霉素B为一新化合物，其化学结构式为：

本发明的另一个目的是提供缬氨霉素B(Valinomycin B)的制备方法，通过以下步骤实现：

(1)小链霉菌Streptomyces parvulus P11-23B发酵菌液的制备

取链霉菌Streptomyces parvulus P11-23B的菌落接种到含有一定量的液体菌种培养基的大三角烧瓶中，将含有P11-23B菌种的培养液在室温条件下振荡培养一定时间后以制备菌种液。最后将菌种液转入含有一定量的液体发酵培养基的大三角烧瓶，在室温条件下振荡发酵培养一定时间后，得到具有抗肿瘤活性的P11-23B的发酵菌液。

所述的液体菌种培养基和液体发酵培养基均为液体高氏培养基；所述的用量为100-200mL；所述的大三角培养瓶为250或500mL；所述的室温培养温度为20～30℃；所述振荡的转速为160-180rpm；所述的培养时间为5～15天。

(2)缬氨霉素B(Valinomycin B)的提取分离纯化

菌株P11-23B的发酵菌液用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物，乙酸乙酯萃取物用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱层析分离，分别用70％和100％的甲醇洗脱，100％的甲醇洗脱液合并后经减压浓缩得到的残留物用HPLC分离，得到纯化合物缬氨霉素B(Valinomycin B)。

所述柱层析的ODS用量与上量的样品量比例是40～60g:1.0g；所述的高效液相分离条件是:Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent 1260DAD检测器，Agilent Zorbax SB-C₁₈色谱柱(250×9.4mm,5μm)，100％甲醇为流动相，柱温26℃,检测波长210nm，流速为1.0mL/min。

(3)缬氨霉素B(Valinomycin B)的结构鉴定

缬氨霉素B(Valinomycin B)的结构是根据它们的一维和二维的NMR光谱、高分辨质谱数据、以及化学降解等方法来鉴定的。

本发明的第三个目的是提供一种小链霉菌P11-23B，所述的菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为小链霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)，保藏编号CCTCC NO：M 2015675，保藏日2015.11.12，保藏地址：中国武汉。

本发明的第四个目的是提供所述的小链霉菌P11-23B的制备方法，是一种从海泥中分离具有抗胶质瘤活性的菌株P11-23B的方法，通过以下步骤分离培养而获得：

(1)小链霉菌(Streptomyces parvulus P11-23B)的分离培养

取空气干燥的海泥用海水稀释成一定的浓度，取一定量的样品稀释液均匀分散到含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下培养一定时间后,将不同的菌落分别转移到另一含有固体培养基的培养皿中，在室温条件下继续培养一定时间。最后将生长良好的单一菌落(P11-23B)接种到斜面培养基培养后置4℃冰箱保存备用。

所述的海泥和海水是从浙江舟山东海海域中获得；所述样品稀释液的浓度为1×10^-6～1×10^-4g/mL；所述的样品稀释液的取样量为100～300μL；所述培养皿所含的固体培养基为高氏琼脂(Gause′s agar)培养基或其它固体培养基；所述的斜面培养基为高氏琼脂培养基或其它固体斜面培养基；所述的室温培养温度为20～30℃；所述的培养时间为7～15天。

(2)小链霉菌(Streptomyces parvulus P11-23B)的菌种鉴定

上述步骤(1)分离培养所获得的菌株用目前实验室普遍使用的16S rDNA序列分析方法鉴定菌株P11-23B的种类，确定为小链霉菌，分类命名为Streptomyces parvulus P11-23B，已被中国典型培养物保藏中心-武汉中心保藏，保藏编号CCTCC NO：M 2015675。

本发明的第五个目的是提供缬氨霉素B在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。所述的缬氨霉素B可显著抑制多种胶质瘤细胞的增殖，阻滞胶质瘤细胞周期于G0/G1期，降低胶质瘤细胞糖酵解、谷氨酰胺分解和脂类合成途径中多个关键酶的蛋白水平表达，具有独特的肿瘤作用机制。

所述药物为缬氨霉素B活性成分单独，或缬氨霉素B与其它药物或与有效成分一起，与药学上可接受的载体组成的药物。所述药物的制剂形式为：液体制剂、固体制剂、胶囊制剂、缓释制剂、纳米制剂。

本发明从海泥中分离培养到活性物质产生菌小链霉菌Streptomyces parvulus P11-23B,并从中发现了新的活性物质缬氨霉素B(Valinomycin B)。缬氨霉素B显著抑制多种脑胶质瘤细胞增殖，明显阻滞胶质瘤细胞周期于G₀/G₁期，降低胶质瘤细胞不同代谢途径的多个关键酶的蛋白水平表达，具有独特的抗肿瘤作用机制。因此，缬氨霉素B在制备治疗脑胶质瘤药物方面具有应用前景。

附图说明

图1是小链霉菌Streptomyces parvulus P11-23B的菌落图。

图2-6是缬氨霉素B(Valinomycin B)的氢谱。

图7-11是缬氨霉素B(Valinomycin B)的碳谱。

图12是缬氨霉素B(Valinomycin B)的¹H-¹H COSY谱。

图13-16是缬氨霉素B(Valinomycin B)的HSQC谱。

图17-23是缬氨霉素B(Valinomycin B)的HMBC谱。

图24是缬氨霉素B(Valinomycin B)的高分辨质谱。

图25是缬氨霉素B(Valinomycin B)对胶质瘤细胞增殖的抑制作用。

图26是缬氨霉素B(Valinomycin B)阻滞胶质瘤U87-MG细胞周期于G0/G1期。

图27是缬氨霉素B(Valinomycin B)阻滞胶质瘤U251细胞周期于G0/G1期。

图28是缬氨霉素B(Valinomycin B)降低胶质瘤U87-MG细胞不同代谢途径关键酶的蛋白表达水平(CON：U87-MG细胞对照组；1：缬氨霉素B处理组；DMSO：二甲基亚砜溶剂对照组；HK2:己糖激酶：PFKFB3:磷酸果糖激酶/果糖2,6-二磷酸酶；PKM2:丙酮酸激酶M2；GLS:谷氨酰胺酶；FASN：脂肪酸合成酶；β-ACTIN:β-肌动蛋白，内部参照)。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。但是，本发明不限于这些实施例。

实施例1.小链霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)的分离培养

取空气干燥的海泥1克用海水稀释成浓度为1×10^-6g/mL的样品稀释液，取200μL的样品稀释液均匀分散到含有高氏琼脂(Gause′s agar)固体培养基的培养皿中，在28℃条件下培养7天后,将不同的菌落分别转移到另一含有高氏琼脂固体培养基的培养皿中，在28℃条件下继续培养7天。最后将生长良好的单一菌落(P11-23B)接种到高氏琼脂斜面培养基培养后置4℃冰箱保存备用。

实施例2.小链霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)的菌种鉴定

使用16S rDNA序列分析方法鉴定所获得菌株P11-23B的种类。

2.1实验试剂及仪器

PCR试剂：EX Taq酶(TaKaRa)，dNTP(TaKaRa)，引物(Invitrogen合成)，引物序列是:TACGGYTACCTTGTTACGACTT和AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；

Marker：DL500

实验仪器：离心机，电泳仪，PCR仪，ABI 3730XL测序仪。

2.2实验步骤

细菌基因组DNA抽提；

电泳检测

PCR扩增

a.PCR反应体系

b.PCR反应条件

10℃∞，

c.电泳检测，

d.测序：切胶纯化测序，

e.分析结果：拼接序列。

2.3实验结果

拼接后的序列为：

AACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGACCTTCACGGGCATCTGTGAAGGTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGTCCAGAGATGGGCGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCAAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTCAACCC。

以上获得的16S rDNA序列与美国NIH的NCBI GenBank数据库比较，其结果表明：菌株P11-23B的16S rDNA序列与GenBank库中的Streptomyces parvulus strain PFS10的16S rDNA序列有99％的相似性(登录号:KJ789323.1)。因此，本发明所获得的海洋菌株P11-23B定为小链霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)(附图1)。小链霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)菌株已被中国典型培养物保藏中心-武汉中心保藏，保藏编号CCTCC NO：M 2015675。

实施例3.小链霉菌P11-23B(Streptomyces parvulus P11-23B)发酵菌液的制备

取链霉菌Streptomyces parvulus P11-23B的菌落接种到含有200mL液体高氏培养基的500mL三角烧瓶中，将含有P11-23B菌种的培养液在28℃条件下旋转(180rpm)振摇培养7天后得到菌种液。将5mL菌种液转入含有200mL液体高氏培养基的500mL三角烧瓶中，在28℃条件下旋转(180rpm)振摇培养7天，得到具有抗肿瘤活性的P11-23B的发酵菌液。

实施例4.缬氨霉素B(Valinomycin B)的提取分离纯化

取实施例3获得的发酵菌液(50.0升)用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物(7.56克)，乙酸乙酯萃取物用十八烷基硅烷键合硅胶(ODS，500克)柱层析分离，分别用2000mL的70％和100％的甲醇洗脱，100％的甲醇洗脱液合并后经减压浓缩得到的残留物(1.38克)用HPLC分离(仪器：Agilent 1260；层析柱：Agilent Zorbax SB-C₁₈，250×9.4mm，5μm；流动相:100％甲醇；柱温：26℃；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min)，得到缬氨霉素B(156mg,t_R18.34min)。

缬氨霉素B为无色粉末；分子式C₅₃H₈₈N₆O₁₈；[α]_D²⁵+36.8.7(c 0.36,MeOH)；IR(KBr)2967，2936，2873，1743，1655，1193，1094，1027mm；高分辨质谱(HRESIMS)为m/z[M-H]^-1095.6051(计算值C₅₃H₈₇N₆O₁₈1095.6077)。经手性氨基酸柱和气相色谱分析，并与标准品对照，缬氨霉素B的酸水解产物鉴定为D-缬氨酸(D-Val)、L-缬氨酸(L-Val)、L-乳酸(L-Lac)、D-α-羟基异戊酸(D-Hiv)、D-α-羟基丁酸(D-Hbu)。

根据缬氨霉素B的¹H谱(附图2-6)、¹³C谱(附图7-11)、¹H-¹H COSY谱(附图12)、HSQC谱(附图13-16)、HMBC谱(附图17-23)、高分辨质谱图(附图24)和化学降解，缬氨霉素B的结构鉴定为新化合物，其¹³C和¹H NMR信号归属见表一。

表一、缬氨霉素B的碳和氢信号归属(in CDCl₃)

实施例5.缬氨霉素B的活性研究

5.1.缬氨霉素B抑制肿瘤细胞增殖的作用

大鼠脑胶质瘤C6细胞和人脑胶质瘤U251细胞用DMEM和10％FBS培养基在37℃和5％二氧化碳的孵化箱中培养，而人脑胶质瘤U87-MG和SHG-44细胞分别用MEM培养基和RPMI-1640培养基在37℃和5％二氧化碳的孵化箱中培养，经过三代培养的细胞用于本发明的实验研究。

用磺酰罗丹明B(SRB)法测定肿瘤细胞存活率，阿霉素(Doxorubicin)用于阳性药对照。细胞接种于96孔板中，贴壁24h后加入不同浓度的缬氨霉素B。药物处理72h后用SRB染色，用酶标仪测定515nm处的吸收光度值，检测肿瘤细胞的存活率，计算缬氨霉素B抑制胶质瘤细胞增殖的IC₅₀值。实验结果表明：缬氨霉素B显著抑制胶质瘤细胞的增殖，其IC₅₀值分别为0.25-0.41μM(表二,附图25)。

表二、缬氨霉素B抑制胶质瘤细胞增殖的作用(IC₅₀:μM)

5.2.缬氨霉素B阻滞胶质瘤细胞周期于G₀/G₁期

用碘化丙啶(PI)DNA染色后,流式细胞仪分析缬氨霉素B对胶质瘤U87-MG和U251细胞生长周期的影响。将胶质瘤U87-MG和U251细胞分别用缬氨霉素B(0.8μM)处理12h、24h、48h、或和72h后，收集细胞并与冰冻的70％乙醇混合后在4℃条件下过夜。过夜后的混合液经离心(1900rpm，7分钟)分离得到的细胞用PBS洗涤两次。细胞重新分散在含有RNase A的PBS中，在37℃孵化30分钟，最后用碘化丙啶(PI)在4℃黑暗处染色30分钟。用FACScan流式细胞仪分析缬氨霉素B对U87-MG和U251细胞周期的改变。实验结果显示：(1)与对照组比较,缬氨霉素B(0.8μM)处理胶质瘤U87-MG细胞12h、24h和48h后,细胞周期的G₀/G₁期细胞比例分别增加了40.92％,32.54％和31.30％(表三，附图26)。

表三、缬氨霉素B对胶质瘤U87-MG细胞周期的影响

(2)与对照组比较,缬氨霉素B(0.8μM)处理胶质瘤U87-MG细胞12h、24h、48h和72h后,细胞周期的G₀/G₁期细胞比例分别增加了40.92％,32.54％和31.30％(表四，附图27)。

表四、缬氨霉素B对胶质瘤U251细胞周期的影响

以上结果说明，缬氨霉素B阻滞于胶质瘤细胞周期于G₀/G₁期。

5.3.缬氨霉素B对胶质瘤细胞不同代谢途径关键酶的影响

蛋白样品的制备：人胶质瘤U87-MG细胞用MEM和10％FBS培养基在37℃和5％二氧化碳的孵化箱中培养，经过三代培养的细胞用于本发明的实验研究。细胞(1.5×10⁷)接种于10厘米的培养皿中，贴壁24h后加入缬氨霉素B(5.0μM或10.0μM)共培养48小时后，先用冰冷的PBS缓冲液洗两次，后冰冷的裂解缓冲液(200μL)裂解15分钟。裂解液经4℃低温高速(11200rpm)离心,上清液为蛋白样品。

蛋白含量的测定：使用BCA试剂盒测定各个蛋白样品的蛋白含量。将试剂盒中试剂A和B以50：1比例配成工作试剂液，用牛血清白蛋白(BSA)将标准品BCA稀释配成不同浓度的BCA标准溶液。取10μL标准溶液或蛋白样品液和200μL工作试剂液混匀后在37℃孵化30分钟.孵化液用酶标仪在562nm波长测定吸收度。以BCA量为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。从回归方程计算各蛋白样品液的蛋白含量。

Western Blotting：含等量蛋白(15μg)的各样品用10％十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,将凝胶电泳蛋白图谱转到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上,PVDF膜用还有5％去脂牛奶的0.1％TBST在室温下封闭2小时。封闭后的PVDF膜先与HK2、PFKFB3、PKM2、FASN和GLS酶的一抗在4℃孵育过夜,用TBST洗膜；后与HRP标记的二抗在室温孵育2小时。TBST洗膜三次后,用增强化学发光试剂检测免疫反应性,然后显影,水洗,定影,水洗,晾干,观察实验结果。以β-肌动蛋白(β-ACTIN)作为内参对照。

实验结果表明：与阴性对照组(没有药物处理的U87-MG细胞)比较，缬氨霉素B(10.0μM)显著降低肿瘤细胞不同代谢途径的关键酶HK2,PFKFB3,FASN和GLS的蛋白水平表达(附图28)。这个结果提示，缬氨霉素B可能通过影响胶质瘤糖酵解、谷氨酰胺分解和脂类合成的关键酶而产生其抗肿瘤活性，具有独特的多靶点抗肿瘤作用机制。

综上所述，本发明证明缬氨霉素B显著抑制多种胶质瘤细胞的增殖，阻滞肿瘤细胞周期于G₀/G₁期，显著降低胶质瘤细胞不同代谢过程中多个关键酶的蛋白水平表达,具有独特的抗肿瘤作用机制，所以，由缬氨霉素B制备的相关药物在治疗脑胶质瘤方面具有应用前景。

缬氨霉素B及制备和医药用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。