专利摘要
专利摘要
本发明提供了核酸分析方法，其中将靶核酸与dsDNA结合染料混合形成混合物。任选地，该混合物中包含未标记探针。通过在加热该混合物时测定dsDNA结合染料的荧光，产生靶核酸的解链曲线。也提供了用于核酸分析的染料和染料的制备方法。
权利要求
1.一种具有下式的化合物：
式中
部分 代表任选取代的稠合的单环或多环芳环或任选取代的稠合的单环或多环含氮杂芳环；
X是氧、硫、硒、碲或选自下组的部分：C(CH3)2或NR1，其中R1是氢或C1-6烷基；
R2选自：C1-6烷基、C3-8环烷基、芳基、芳基(C1-3烷基)、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单烷基氨基烷基和二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基、亚烷基羧酸酯、亚烷基羧酰胺、亚烷基磺酸酯、任选取代的含杂原子的环状部分或任选取代的含杂原子的非环状部分；
t＝0或1；
Z是0或1个电荷；
R3选自：氢、C1-6烷基或芳基羰基，或者R2和R3一起形成-(CH2)w-，式中w是1-5；
R9和R10各自独立地选自：氢、C1-6烷基或芳基羰基；
n＝0、1或2；和
v＝0或1；限制条件是当R2和R3没有一起形成-(CH2)w-时v＝0；
当v＝0时，Q是选自下组结构的杂环：
和
当v＝1时，Q是选自下组结构的杂环：
式中R4、R5、R6、R7、R8、R12和R13独立地选自：氢、卤素、烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、烯基、聚烯基、炔基、聚炔基、烯基炔基、烷基腈硫基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷硫基、芳基羰硫基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、二烷基氨基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基、三烷基铵烷基羰硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代；以及各自任选地包含季铵部分的含杂原子的非环状部分、含杂原子的环状部分、BRIDGE-DYE或反应性基团。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R4、R5、R6、R7和R8中至少一个选自芳基羰硫基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、三烷基铵烷基羰硫基、烷基腈硫基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R4是任选取代的芳基羰硫基，选自：4-(羰硫基)-吡啶基、4-(羰硫基)-硝基苯基、4-(羰硫基)-苯基、4-(羰硫基)-N，N-二甲基苯胺基、2-(羰硫基)-吡嗪基、6-(羰硫基)-苯并吡嗪基、5-(羰硫基)-1-甲基-1，2，3-苯并三唑基或羰硫基-五氟苯基。
4.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R4是任选取代的环杂烷基羰硫基，选自：4-(羰硫基)-N-甲基哌嗪基、4-(羰硫基)-N，N-二甲基哌嗪鎓或4-(羰硫基)-吗啉基。
5.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R4是任选取代的二烷基氨基烷基羰硫基N，N-二甲基氨基甲基羰硫基。
6.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R4是任选取代的三烷基铵烷基羰硫基三甲基铵甲基羰硫基。
7.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R4是任选取代的烷基腈硫基乙腈硫基。
8.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R4是任选取代的环烷硫基1-(硫代)-双环[2.2.1]庚基。
9.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R4是任选取代的环杂烷硫基4-(硫代)-N-甲基哌啶基。
10.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R4是任选取代的三烷基铵烷硫基三甲基铵丙硫基。
11.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，R4是任选取代的核苷硫基5′-脱氧-腺苷硫基。
12.如权利要求2所述的化合物，其具有下式：
13.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R4、R5、R6、R7和R8中至少一个选自：4-(羰硫基)-吡啶基、4-(羰硫基)-硝基苯基、4-(羰硫基)-苯基、4-(羰硫基)-N，N-二甲基苯胺基、2-(羰硫基)-吡嗪基、6-(羰硫基)-苯并吡嗪基、5-(羰硫基)-1-甲基-1，2，3-苯并三唑基、羰硫基-五氟苯基、4-(羰硫基)-N-甲基哌嗪基、4-(羰硫基)-N，N-二甲基哌嗪鎓、4-(羰硫基)-吗啉基、N，N-二甲基氨基甲基羰硫基、三甲基铵甲基羰硫基、1-(硫代)-双环[2.2.1]庚基、4-(硫代)-N-甲基哌啶基、三甲基铵丙硫基、5′-脱氧-腺苷硫基或乙腈硫基。
14.如权利要求1所述的化合物，限制条件是R4、R5、R6、R7和R8中至少一个不选自：氢、卤素、烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、烯基、聚烯基、炔基、聚炔基、烯基炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷硫基或二烷基氨基，以上基团各自可被任选取代；各自任选地包含季铵部分的三甲基铵丙基；甲硫基；氨基；羟基；N，N-二甲基哌嗪基；嘧啶硫基；BRIDGE DYE或反应性基团。
15.如权利要求1所述的化合物，限制条件是R4、R5、R6和R7不选自：卤素、环烷基、烯基、聚烯基、炔基、聚炔基、烯基炔基、烷氧基或二烷基氨基，以上基团各自可被任选取代；各自任选地包含季铵部分的BRIDGE DYE或反应性基团。
16.如权利要求1所述的化合物，限制条件是R4不选自：氢、N，N-二甲基哌嗪基、嘧啶硫基、甲硫基、巯基、氨基或羟基。
17.如权利要求1所述的化合物，限制条件是R5不选自：三甲基铵丙基或苯基。
18.如权利要求1所述的化合物，限制条件是R6不选自：氢、甲基或苯基。
19.如权利要求1所述的化合物，限制条件是R7不是氢。
20.如权利要求1所述的化合物，限制条件是所述化合物不选自：G5、H5、I5、K5、L5、D6、E6、P6、R6、Y6、Z6、F7、C8、E8、G8、L8、M8、N8、O8或V8。
21.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：N7、O7、P7、Q7、R7、S7、T7、U7、V7、W7、X7、Z7、K8、P8、T8、W8、X8、Z8、A9、C9、G9、I9、I9Met、J9、J9Met、K9、L9、L9Met、M9、N9、O9、P9、Q9、R9、A10、V10、F11或H11。
22.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，
R2和R3一起形成-(CH2)w-和
v＝1。
23.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，
v＝0，和
Q是
限制条件是R2、R5和R13中至少一个不是甲基。
24.一种制备具有下式的染料的方法：
所述方法包括将具有左式的化合物与具有右式的化合物反应的步骤：
其中：
部分 代表任选取代的稠合的单环或多环芳环或任选取代的稠合的单环或多环含氮环；
A是氢，或者A代表各自独立地选自下组的一个或多个取代基：烷基、卤素、氨基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷基磺酰基、卤代烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷硫基、芳硫基、甲酰基、烷基羰基、芳基羰基、羧酸衍生物、单烷基氨基、二烷基氨基、三烷基铵、二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基、哌啶并、哌嗪并、苯二甲酰亚氨基、苯并噻唑鎓、萘并噻唑鎓；苯并噁唑鎓、萘并噁唑鎓，以上基团各自可用烷基、氨基、单烷基氨基烷基或二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基任选取代，或可任选地用烷基使氮季铵化；
t＝0或1；
Z是0或1个电荷；
X是氧或硫；
L是离去基团；
R2选自：C1-6烷基、C2-6烷基、C3-8环烷基、芳基、芳基(C1-3烷基)、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基、烷基羰基、芳基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、亚烷基羧酸酯、亚烷基羧酰胺、亚烷基磺酸酯或亚烷基磺酸；
R4选自：芳基羰硫基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、三烷基铵烷基羰硫基、烷基腈硫基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代。
R5选自：C1-6烷基、C2-6烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、单烷基氨基、二烷基氨基、三烷基铵、二烷基氨基烷基或三烷基铵烷基、芳基、杂芳基，以上基团各自可被任选取代；和
R6和R8独立地选自：氢、卤素、烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、烯基、聚烯基、炔基、聚炔基、烯基炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷硫基、芳硫基、芳基羰硫基、二烷基氨基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代；各自任选地包含季铵部分的含杂原子的环状部分或含杂原子的非环状部分、BRIDGE-DYE或反应性基团。
25.一种核酸分析方法，所述方法包括以下步骤：
将靶核酸与饱和dsDNA结合染料和设计为与靶核酸的一部分杂交的未标记探针混合，形成混合物，
使未标记探针杂交所述靶核酸，形成探针/靶标双链体，
通过在加热所述混合物时测定dsDNA结合染料的荧光，产生探针/靶标双链体的解链曲线，和
分析所述解链曲线的形状。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述分析解链曲线的形状的步骤包括产生导数解链曲线。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述分析解链曲线的形状的步骤还包括通过分析导数解链曲线上一个或多个解链峰的形状和位置进行基因分型。
28.如权利要求25所述的方法，其还包括以下步骤：
扩增所述靶核酸，
其中，所述扩增步骤在产生所述解链曲线之前进行。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述扩增步骤包括通过聚合酶链式反应进行扩增。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述聚合酶链反应是不对称的聚合酶链反应。
31.如权利要求28所述的方法，其特征在于，扩增所述靶核酸之后，将所述未标记探针与所述靶核酸混合。
32.如权利要求28所述的方法，其特征在于，扩增所述靶核酸之前，加入所述未标记探针和所述dsDNA结合染料。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述未标记探针在3’末端封端，以防止扩增期间的延伸。
34.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述未标记探针的长度至少为14个核苷酸。
35.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述混合物包含第二种未标记探针，所述分析步骤包括在所述靶核酸的两个基因座上进行基因分型。
36.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述混合物包含第二种靶核酸和设计为至少部分杂交于所述第二种靶核酸的第二种未标记探针，所述分析步骤包括在所述靶核酸的第一个基因座和第二种靶核酸的第二个基因座上进行基因分型。
37.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述靶核酸的所述部分包含单核苷酸多态性。
38.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述dsDNA结合染料的饱和百分数至少为50％。
39.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述染料选自：G5、H5、I5、K5、L5、S5、D6、E6、P6、R6、Y6、Z6、F7、N7、O7、P7、Q7、R7、S7、T7、U7、V7、W7、X7、Z7、C8、E8、G8、K8、L8、M8、N8、O8、P8、T8、V8、W8、X8、Z8、A9、C9、G9、I9、I9Met、J9、J9Met、K9、L9、L9Met、M9、N9、O9、P9、Q9、R9、A10、V10、F11或H11。
40.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述染料选自：PO-PROTM-1、BO-PROTM-1、 43、 44、 45、 Blue、POPOTM-3、BOBOTM-3、LO-PROTM-1、JO-PROTM-1、 -1、 -1、 9、 11、 15、 16、 23、TOTOTM-3、 -3、 或EvaGreenTM。
41.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述靶核酸和所述未标记探针游离在溶液中，所述靶核酸和所述未标记探针都不固定在表面上。
42.如权利要求25所述的方法，其还包括内标，其中将所述解链曲线根据内标的Tm移动。
43.一种PCR反应混合物，其包含：
靶核酸，
PCR试剂，
设计用于扩增所述靶核酸的一部分产生扩增子的一对寡核苷酸引物，和具有下式的dsDNA结合染料：
式中：
部分 代表任选取代的稠合的单环或多环芳环或任选取代的稠合的单环或多环含氮杂芳环；
X是氧、硫、硒、碲或选自下组的部分：C(CH3)2或NR1，其中R1是氢或C1-6烷基；
R2选自：C1-6烷基、C3-8环烷基、芳基、芳基(C1-3烷基)、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单烷基氨基烷基和二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基、亚烷基羧酸酯、亚烷基羧酰胺、亚烷基磺酸酯、任选取代的含杂原子的环状部分或任选取代的含杂原子的非环状部分；
t＝0或1；
Z是0或1个电荷；
R3、R9和R10各自独立地选自：氢、C1-6烷基或芳基羰基；
n＝0、1或2；和
Q是选自下组结构的杂环：
式中R5、R6、R7、R8、R12和R13独立地选自：氢、卤素、烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、烯基、聚烯基、炔基、聚炔基、烯基炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷硫基、芳硫基、芳基羰硫基、二烷基氨基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、三烷基铵烷基羰硫基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代；各自任选地包含季铵部分的含杂原子的非环状部分或含杂原子的环状部分、BRIDGE-DYE或反应性基团，和
R4选自：芳基羰硫基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、三烷基铵烷基羰硫基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基、烷基腈硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代。
44.如权利要求43所述的PCR反应混合物，其特征在于，所述染料选自：F7、N7、O7、P7、Q7、R7、S7、T7、V7、W7、X7、T8、A9、C9、I9、I9Met、J9、J9Met、K9、L9、L9Met、M9、N9、O9、P9、R9、F11或H11。
45.如权利要求43所述的PCR反应混合物，其特征在于，所述dsDNA结合染料的饱和百分数至少为50％。
46.如权利要求43所述的PCR反应混合物，其还包含设计为至少杂交于所述扩增子的一部分的未标记探针。
47.如权利要求43所述的PCR反应混合物，其还包含设计用于扩增所述靶核酸的第二部分以产生第二种扩增子的第二对寡核苷酸引物。
48.一种基因分型方法，所述方法包括以下步骤：
在dsDNA结合染料和设计为至少部分杂交于所述靶核酸的未标记探针的存在下使靶核酸解链，产生解链曲线，和
用所述解链曲线鉴定基因型，
其中所述dsDNA结合染料具有下式：
式中
部分 代表任选取代的稠合的单环或多环芳环或任选取代的稠合的单环或多环含氮杂芳环；
X是氧、硫、硒、碲或选自下组的部分：C(CH3)2或NR1，其中R1是氢或C1-6烷基；
R2选自：C1-6烷基、C3-8环烷基、芳基、芳基(C1-3烷基)、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单烷基氨基烷基和二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基、亚烷基羧酸酯、亚烷基羧酰胺、亚烷基磺酸酯、任选取代的含杂原子的环状部分或任选取代的含杂原子的非环状部分；
t＝0或1；
Z是0或1个电荷；
R3、R9和R10各自独立地选自：氢、C1-6烷基或芳基羰基；
n＝0、1或2；和
Q是选自下组结构的杂环：
式中R5、R6、R7、R8、R12和R13独立地选自：氢、卤素、烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、烯基、聚烯基、炔基、聚炔基、烯基炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷硫基、芳硫基、芳基羰硫基、二烷基氨基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、三烷基铵烷基羰硫基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代；各自任选地包含季铵部分的含杂原子的非环状部分或含杂原子的环状部分、BRIDGE-DYE或反应性基团，和
R4选自：芳基羰硫基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、三烷基铵烷基羰硫基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基、烷基腈硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代。
49.一种分析靶核酸的试剂盒，其包括：
设计为至少部分杂交于所述靶核酸的未标记探针，和
饱和dsDNA结合染料。
50.如权利要求49所述的试剂盒，其还包括
耐热聚合酶，和
设计用于扩增所述靶核酸的寡核苷酸引物。
51.如权利要求50所述的试剂盒，其特征在于，所述寡核苷酸引物包含第一引物和第二引物，其中提供的所述第一引物的摩尔量大于所述第二引物。
52.如权利要求49所述的试剂盒，其特征在于，所述未标记探针在3’末端封端。
53.如权利要求49所述的试剂盒，其特征在于，所述dsDNA结合染料的饱和百分数至少为50％。
54.如权利要求49所述的试剂盒，其特征在于，所述dsDNA结合染料的饱和百分数至少为90％。
55.如权利要求49所述的试剂盒，其特征在于，所述染料选自：N7、R7、X7、T8、O7、P8、P7、Q7、T7、V7、W8、Z8、Z7、X8、G9、C9、A9、M9、N9、I9、I9Met、J9、J9Met、K9、L9、L9Met、O9、P9、V10、F11或H11。
56.如权利要求49所述的试剂盒，其特征在于，所述染料具有下式：
式中
部分 代表任选取代的稠合的单环或多环芳环或任选取代的稠合的单环或多环含氮杂芳环；
X是氧、硫、硒、碲或选自下组的部分：C(CH3)2或NR1，其中R1是氢或C1-6烷基；
R2选自：C1-6烷基、C3-8环烷基、芳基、芳基(C1-3烷基)、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单烷基氨基烷基和二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基、亚烷基羧酸酯、亚烷基羧酰胺、亚烷基磺酸酯、任选取代的含杂原子的环状部分或任选取代的含杂原子的非环状部分；
t＝0或1；
Z是0或1个电荷；
R3、R9和R10各自独立地选自：氢、C1-6烷基或芳基羰基；
n＝0、1或2；和
Q是选自下组结构的杂环：
式中R5、R6、R7、R8、R12和R13独立地选自：氢、卤素、烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、烯基、聚烯基、炔基、聚炔基、烯基炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷硫基、芳硫基、芳基羰硫基、二烷基氨基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、三烷基铵烷基羰硫基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基、烷基腈硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代；各自任选地包含季铵部分的含杂原子的非环状部分或含杂原子的环状部分、BRIDGE-DYE或反应性基团，和
R4选自：芳基羰硫基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、三烷基铵烷基羰硫基、烷基腈硫基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代。
57.一种检测c-kit基因中的突变的方法，所述方法包括：
提供扩增混合物，其含有：
核酸样品，
设计用于扩增所述c-kit基因的基因座的一对引物，
耐热聚合酶，和
饱和dsDNA结合染料，
扩增所述核酸样品以产生扩增子，
使所述扩增子解链产生解链曲线，和
分析所述解链曲线的形状。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述分析步骤包括比较所述解链曲线的形状与获自相似的野生型扩增子的第二种解链曲线的形状。
59.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述引物对选自：
GATGCTCTGCTTCTGTACTG(SEQ ID NO.40)和
GCCTAAACATCCCCTTAAATTGG(SEQ ID NO.41)；
CTCTCCAGAGTGCTCTAATGAC(SEQ ID NO.42)和
AGCCCCTGTTTCATACTGACC(SEQ ID NO.43)；
CGGCCATGACTGTCGCTGTAA(SEQ ID NO.44)和
CTCCAATGGTGCAGGCTCCAA(SEQ ID NO.45)；
或TCTCCTCCAACCTAATAGTG(SEQ ID NO.46)和
GGACTGTCAAGCAGAGAAT(SEQ ID NO.47)。
60.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述引物对具有以下核苷酸序列：
GATGCTCTGCTTCTGTACTG(SEQ ID NO.40)和
GCCTAAACATCCCCTTAAATTGG(SEQ ID NO.41)，
其中所述扩增混合物还包含具有以下序列的引物：
CTCTCCAGAGTGCTCTAATGAC(SEQ ID NO.42)、
AGCCCCTGTTTCATACTGACC(SEQ ID NO.43)、
CGGCCATGACTGTCGCTGTAA(SEQ ID NO.44)、
CTCCAATGGTGCAGGCTCCAA(SEQ ID NO.45)、
TCTCCTCCAACCTAATAGTG(SEQ ID NO.46)、
GGACTGTCAAGCAGAGAAT(SEQ ID NO.47)。
61.一种核酸分析方法，该方法包括以下步骤：
将靶核酸与饱和dsDNA结合染料混合，形成混合物，
通过在加热所述混合物时测定dsDNA结合染料的荧光以产生所述靶核酸的解链曲线，
所述混合物中包含设计为杂交于所述靶核酸的一部分的第二种核酸，所述第二种核酸小于所述靶核酸，其解链温度与所述靶核酸不同，使所述第二种核酸杂交于所述靶核酸的一部分，
使所述第二种核酸与所述第一种核酸解链，和
分析所述解链曲线的形状。
62.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述第二种核酸是未标记探针，在产生解链曲线之前将其加入所述混合物中。
63.如权利要求62所述的方法，其还包括扩增所述靶核酸的步骤，其中所述扩增步骤在所述混合物中加入所述第二种核酸之后进行。
64.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述靶核酸具有Tm和所述第二种核酸具有第二Tm，其中所述Tm高于所述第二Tm，所述分析步骤包括分析所述解链曲线在所述Tm和所述第二Tm处的形状。
65.如权利要求61所述的方法，其特征在于，在产生所述解链曲线之后将所述第二种核酸加入所述混合物中，使所述第二种核酸与所述第一种核酸解链的所述步骤包括产生第二解链曲线。
66.如权利要求61所述的方法，其特征在于，通过PCR用第一组引物扩增所述靶核酸，通过PCR用第二组引物扩增所述第二种核酸，所述靶核酸和第二种核酸的扩增在同一反应混合物中进行。
67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，在产生所述解链曲线之前进行所述靶核酸和第二种核酸的扩增。
68.如权利要求66所述的方法，其特征在于，用第一种PCR温度分布扩增所述靶核酸，用第二种温度分布扩增所述第二种核酸。
69.如权利要求66所述的方法，其特征在于，以用于轻度不对称PCR的比率提供所述第一组引物。
70.如权利要求61所述的方法，其特征在于，已知所述核酸部分含有序列变异。
71.如权利要求61所述的方法，其特征在于，分析所述解链曲线的形状包括产生导数曲线和分析所述导数解链曲线上一个或多个解链峰的形状和位置。
72.一种PCR分析方法，所述方法包括以下步骤：
将dsDNA结合染料与包含未知初始量的靶核酸和设计用于扩增所述靶核酸的引物的样品混合，形成混合物，
在dsDNA结合染料的存在下扩增所述靶核酸，
在多个扩增循环期间，在整个温度范围中监测所述dsDNA结合染料的荧光，产生多条解链曲线，
采用所述解链曲线定量所述靶核酸的初始量。
73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述混合物还包含设计杂交于所述靶核酸的一部分形成探针/靶标双链体的未标记探针，所述温度范围包括所述探针/靶标双链体的Tm。
74.如权利要求73所述的方法，其特征在于，所述采用解链曲线定量的步骤包括采用所述解链曲线在恰好低于所述探针/靶标双链体Tm的温度时的导数值。
75.如权利要求73所述的方法，其特征在于，所述用解链曲线定量的步骤包括：
产生特定循环数的导数解链曲线，所述导数曲线具有解链峰，
测定所述解链峰的面积，和
用所述面积确定所述靶核酸的初始量。
76.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述dsDNA结合染料是饱和染料。
77.一种核酸扩增反应混合物，其包含：
靶核酸，
设计用于扩增所述核酸的基因座的一对引物，
dsDNA结合染料，
未标记探针，其设计为杂交于所述靶核酸的所述基因座，并且设计为与dsDNA结合染料结合后产生信号，在解链曲线分析后表明所述靶核酸的基因型，和耐热聚合酶。
说明书
技术领域发明领域
本发明涉及双链核酸结合染料和在双链核酸结合染料的存在下进行核酸分析的方法。
技术背景发明背景
分析DNA序列变异的方法可以大体分为两类：1)对已知序列变体的基因分型和2)对未知变体的扫描。现有多种对已知序列变体进行基因分型的方法，并可以采用使用荧光探针的单一步骤、同质的、闭管的方法(Lay MJ等，Clin.Chem 1997；43：2262-7)。相反，大部分针对未知变体的扫描技术要求PCR之后的凝胶电泳或柱分离。这些技术包括单链构象多态性(Orita O等，Proc Natl Acad Sci USA 1989；86：2766-70)、异源双链分子迁移(Nataraj AJ等，Electrophoresis 1999；20：1177-85)、变性梯度凝胶电泳(Abrams ES等，Genomics 1990；7：463-75)、温度梯度凝胶电泳(Wartell RM等，JChromatogr A 1998；806：169-85)、酶或化学切割法(Taylor GR等，Genet Anal 1999；14：181-6)以及DNA测序。通过测序识别新的突变也要求PCR之后的多个步骤，也就是循环测序和凝胶电泳。变性高效液相色谱(Xiao W等，Hum Mutat 2001；17：439-74)涉及将PCR产物注入层析柱。
最近，用于突变扫描的同质荧光方法已有报道。SYBR Green I(Molecular Probes，Eugene，Oregon)是一种在实时PCR中经常用于监测产物形成(Wittwer CT等，BioTechniques 1997；22：130-8)和解链温度(Ririe KM等，Anal.Biochem1997；245：154-60)的双链特异性DNA染料。通过使用SYBR Green I的解链曲线分析，已经在167bp以内的产物中检测到杂合子单一碱基改变的存在(Lipsky RH等，Clin Chem 2001；47：635-44)。然而，扩增后在解链分析之前，对PCR产物进行了纯化并添加了高浓度的SYBR Green I。所述方法中用以检测的SYBR Green I浓度抑制PCR反应(Wittwer CT等，BioTechniques 1997；22：130-1，134-8)；因而，该染料在扩增后添加。希望能有一种能用于检测遗传变异(包括杂合子单个碱基改变)的存在并能在PCR之前加入的染料。
单核苷酸多态性(SNP)是目前为止在人类和其它物种中间观察到的最常见的遗传变异。在这些多态性中，个体之间仅有单个碱基的变化。所述改变可能引起蛋白质中一个氨基酸的改变、改变转录速度、影响mRNA剪接、或对细胞过程没有明显作用。有时在所述改变沉默(例如，在其编码的氨基酸没有改变的情况下)的情况下，SNP基因分型可能仍具有价值，如果所述改变与由另一个遗传改变引起的独特表现型相连(关联的)。
现有多种SNP基因分型的方法。大部分采用PCR或其它扩增技术以扩增感兴趣的模板。可以使用包括凝胶电泳、质谱和荧光在内的同步或后续分析技术。均相(homogeneous)并且不需要在扩增开始后添加试剂或为了分析而对反应物手工取样的荧光技术是具有吸引力的。示范性的均相技术使用寡核苷酸引物来定位感兴趣的区域以及荧光标记或染料用于产生信号。通过使用对DNA变性温度稳定的热稳定酶，示例性的基于PCR的方法是完全闭管的，这样在加热开始以后，不需要进行添加。
对于SNP基因分型可以采用几种闭管的、同质的荧光PCR方法。这些方法包括使用有两个相互作用的发光基团的FRET寡核苷酸探针(邻近杂交探针，TaqMan探针，Molecular Beacons，Scorpions)、仅有一个荧光基团的单一寡核苷酸探针(G-淬灭探针，Crockett，A.O.和C.T.Wittwer，Anal.Biochem.2001；290：89-97以及SimpleProbes，Idaho Technology)、以及使用双链DNA染料而不是共价荧光标记的寡核苷酸探针的技术。由于不需要标记的寡核苷酸探针，可以降低设计时间和检测成本，所述染料技术是具有吸引力的。
已经公开了两种使用双链DNA染料的SNP分型技术。可将存在双链DNA染料情况下的等位基因特异性扩增用于实时PCR基因分型(Germer S等，Genome Research2000；10：258-266)。在Germer的参考文献的方法中，在存在一条共有反向引物的情况下，两条3’-碱基存在差异的等位基因特异性引物差异扩增一条或另一条等位基因。虽然不需要荧光标记的寡核苷酸，基因分型要求3条引物以及针对每种基因型的两个反应池。此外，需要监测每个循环荧光信号的实时PCR仪。
另一种基于染料的方法不需要实时监测，每种SNP基因型仅需要一个反应池，并使用解链分析(Germer S等，Genome Research 1999；9：72-79)。在这种方法中，如前面的Germer方法一样，也使用了需要3条引物的等位基因特异性扩增。此外，所述引物中的一条含GC-发夹尾部，以提高一个扩增子的解链温度，使得在一个反应池中通过解链温度进行区分成为可能。PCR扩增后检测荧光，而不需要实时采集。
发明内容发明概述
本发明的一个方面提供了一种仅需要标准PCR混合物，包括试剂、引物、以及在PCR前简单添加的本公开的“饱和”双链(ds)DNA结合染料或新型dsDNA结合染料的方法。为了本发明的目的，“饱和”染料是指该染料以为不存在染料情况下由PCR通常产生的双链DNA量(例如约10纳克/微升)提供最大荧光信号的浓度存在时，不会明显抑制PCR反应。虽然所述染料通过其饱和浓度时与PCR的相容性进行鉴别，需要理解的是所述染料能以低得多的浓度使用。扩增过程中或扩增之后，所述染料可以与使用标记引物情况下类似的方式通过解链曲线分析用于区分异源双链分子和同源双链分子(Gundry CN，等，Clin Chem.2003Mar；49(3)：396-406)。异源双链分子和同源双链分子的鉴别可以用于包括突变扫描和基因分型在内的多种分析。术语“扫描”是指将一个核酸片段与一个参照核酸片段比较以检测序列上任何差异的存在的过程。表示存在序列差异的阳性结果不一定反映序列变异的确切性质或其在核酸片段上的位置。术语“基因分型”包括检测和确定已知的核酸序列变异，这些变异包括但不限于SNP、碱基缺失、碱基插入、序列重复、重排、倒置、碱基甲基化、短串联重复数；以及在两倍体基因组的情况下，基因组是否是序列变异的纯合子或杂合子，以及一条DNA链上两个或更多序列变异的顺/反位置关系(单体型分析)。任选地，可在解链曲线分析之前的任何时间将一种或多种未标记探针加入该混合物。
术语“未标记探针”指未共价连接于染料并且设计为能完全或部分杂交于靶序列的寡核苷酸或多核苷酸。该混合物中存在的染料不能结合未标记探针或与未标记探针解离，尤其是当探针与靶序列杂交和解链时。本文所用术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”包括天然或修饰的单体或连接(包括能够通过碱基配对相互作用特异性结合靶多核苷酸的脱氧核糖核苷、核糖核苷、肽核酸核苷等)的低聚物和聚合物。任选地，可用一个或多个非荧光部分修饰未标记的探针，这些非荧光部分例如但不限于非荧光小沟结合物、生物素、间隔区、接头、磷酸、碱基类似物、非天然碱基等。在PCR混合物中提供未标记探针的实施方式中，需要未标记探针与结合靶序列的结合不像能抑制扩增的那么紧密。
本发明的另一个方面，鉴别了多种双链DNA结合染料。本发明的双链DNA结合染料能在扩增中或扩增后以对于DNA的充分饱和量存在，同时对PCR的抑制最小化。例如，在最大PCR相容浓度下，双链DNA结合染料具有至少为50％的饱和百分比。在其它实施方式中，所述饱和百分比至少为80％，更具体的至少为90％。在还有其它实施方式中，所述饱和百分比至少99％。需要理解的是，所述饱和百分比是与饱和浓度(也就是在存在预先确定的双链DNA量的情况下提供可能的最高荧光强度的浓度)的相同染料的荧光相比的荧光百分比。举例来说，预先确定的双链DNA量是100纳克/10微升，这是典型的PCR末期到达平台期时产生的DNA量。需要进一步理解到染料制剂可能包含抑制扩增的杂质。这样的杂质应该在确定饱和百分比之前去除。也需要理解的是，饱和百分比荧光强度的测量在与检测结合双链DNA的染料良好匹配的波长处进行，而且如果可能的话，不在能检测到来自游离染料或在高染料-碱基对比率下可能形成的染料结合的二级形式(例如，染料与双链DNA-染料复合物结合或与单链核酸结合)的高本底荧光的波长处检测。
在本发明的还有另一个方面，双链DNA结合染料在最大PCR相容浓度下具有大于50％的饱和度，而且具有可能与常规实时PCR仪不兼容的激发/发射光谱。用于实时PCR分析的“常规”仪器具有介于约450-490纳米的激发波长和介于约510-530纳米的发射检测波长。已经发现某些“蓝色”染料与这些系统兼容，虽然其激发/发射光谱可能有所不同。这样，在本发明的这个方面，提供了一种在PCR过程中或PCR之后使用常规实时PCR仪和双链DNA结合染料分析的方法，其中双链DNA结合染料正如在存在双链DNA的PCR缓冲液中测得的具有介于410-465纳米，尤其是介于430-460纳米的最大激发波长，并具有介于450-500纳米，尤其是介于455-485纳米的最大发射波长。适当的仪器可以使用上述激发/检测区间，或可以按照染料的激发/发射峰值进行改进。检测本发明的“蓝色”染料以及检测如荧光素和SYBR Green I等常规染料的适当区间可以包括440-470纳米的激发波长和500-560纳米的检测波长。注意到，虽然许多这些染料适合用于标准的实时PCR仪器和解链仪器操作，但调整光学器件以更好地匹配这些染料的激发/发射光谱可进一步提高它们用于定量或定性扩增分析的灵敏度。
在本发明又一方面，通过在一种或多种未标记探针和双链结合染料的存在下进行解链曲线分析进行扫描或基因分型。可在扩增期间或之后、或没有扩增的情况下进行解链曲线分析。染料可以是本公开的饱和染料或新型染料。
虽然这里所提供的实例是针对解链曲线分析的，需要理解的是，本发明的染料可以用于多种包括核酸定量、起始浓度测定、对存在一种核酸的检测、用标记探针的复合检测以及其它基于PCR的方法在内的实时定量PCR分析。
此外，虽然提及的是PCR，其它扩增方法可以与本发明的染料相容。这样的合适的方法包括链置换扩增(SDA)、依赖于核酸序列的扩增(NASBA)、级联滚环扩增(CRCA)、Qβ复制酶介导的扩增、等温和嵌合引物启动的核酸扩增(ICAN)、转录介导的扩增(TMA)等。也可采用不对称PCR。因此，当使用术语PCR的时侯，需要理解为包括PCR的变型和其它可供选择的扩增方法。相对于一条链更有利于扩增另一条链的扩增方法尤其适用于采用未标记探针的解链曲线分析。
而且，虽然参照扩增，但应理解可对未经扩增的核酸样品进行本发明的解链曲线分析。
此外，需要理解双链DNA结合染料包括嵌入剂以及其它与核酸结合的染料，只要所述染料差异结合双链和单链核酸，或产生基于双链核酸数量的差异信号。
因此，在本发明的一个实施方式中，提出了新型染料。新型染料可以是或不是饱和染料，可在扩增期间或之后使用这种新型染料，或者可在进行或未进行扩增的情况下进行解链曲线分析期间使用这种新型染料。例如，该新型染料具有下式：
式中
部分 代表任选取代的稠合的单环或多环芳环或任选取代的稠合的单环或多环含氮杂芳环；
X是氧、硫、硒、碲或选自C(CH3)2或NR1的部分，式中R1是氢或C1-6烷基；
R2选自C1-6烷基、C3-8环烷基、芳基、芳基(C1-2烷基)、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单烷基氨基烷基和二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基、亚烷基羧酸酯、亚烷基羧酰胺、亚烷基磺酸酯、任选取代的含杂原子的环状部分或任选取代的含杂原子的非环状部分；
t＝0或1；
Z是0或1个电荷；
R3选自氢、C1-6烷基或芳基羰基，或者R2和R3一起形成-(CH2)w-，式中w是1-5；
R9和R10各自独立地选自氢、C1-6烷基或芳基羰基；
n＝0、1或2；和
v＝0或1；限制条件是当R2和R3没有一起形成-(CH2)w-时v＝0；
当v＝0时，Q是选自下组结构的杂环：
和
当v＝1时，Q是选自下组结构的杂环：
式中R4、R5、R6、R7和R8独立地选自：氢、卤素、烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、烯基、聚烯基、炔基、聚炔基、烯基炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷硫基、烷基腈硫基、芳基羰硫基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、三烷基铵烷基羰硫基、二烷基氨基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代；以及各自任选地包含季铵部分的含杂原子的非环状部分、含杂原子的环状部分、BRIDGE-DYE或反应性基团。
例如，在一个实施方式中，R4、R5、R6、R7和R8中至少一个选自芳基羰硫基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、三烷基铵烷基羰硫基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基、烷基腈硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代。在另一实施方式中，所述染料选自N7、O7、P7、Q7、R7、S7、T7、U7、V7、W7、X7、Z7、K8、P8、T8、W8、X8、Z8、A9、C9、G9、I9、I9Met、J9、J9Met、K9、L9、L9Met、M9、N9、O9、P9、Q9、R9、A10、V10、F11或H11。在一种方法中，将这些染料用于PCR扩增。在另一方法中，将这些染料与靶核酸和未标记的探针一起用于解链曲线分析。这些染料可用于本文所述的各种其它方法。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种核酸分析方法，该方法包括以下步骤：将靶核酸与饱和dsDNA结合染料和设计以杂交靶核酸一部分的至少一种未标记探针混合，形成混合物，使未标记探针能够杂交靶核酸以形成探针/靶标双链体，在加热混合物时通过测定dsDNA结合染料的荧光产生探针/靶标双链体的解链曲线，以及分析解链曲线的形状。例如，可通过产生导数解链曲线分析解链曲线的形状，例如分析导数解链曲线上一个或多个解链峰的形状和位置。可任选地在靶核酸扩增期间或之后进行此分析。上述饱和染料或其它饱和染料可用于此方法。
在本发明的又一实施方式中，提供了分析靶核酸的试剂盒，该试剂盒包括设计为至少能与靶核酸部分杂交的未标记探针和饱和dsDNA结合染料。该试剂盒可任选地包括其它组分，例如设计用于扩增靶核酸的耐热聚合酶和寡核苷酸引物。
在本发明的另一实施方式中，提供了检测c-kit基因中突变的方法，该方法包括提供含有核酸样品、设计用于扩增c-kit基因的基因座的一种或多种引物对、耐热聚合酶和饱和dsDNA结合染料的扩增混合物，扩增核酸样品以产生扩增子，使扩增子解链产生解链曲线，分析解链曲线的形状。例如，引物包括选自下组的任何引物或全部引物：GATGCTCTGCTTCTGTACTG(SEQ ID NO.40)和GCCTAAACATCCCCTTAAATTGG(SEQ ID NO.41)；CTCTCCAGAGTGCTCTAATGAC(SEQ ID NO.42)和AGCCCCTGTTTCATACTGACC(SEQ ID NO.43)；CGGCCATGACTGTCGCTGTAA(SEQ ID NO.44)和CTCCAATGGTGCAGGCTCCAA(SEQ ID NO.45)；以及TCTCCTCCAACCTAATAGTG(SEQ ID NO.46)和GGACTGTCAAGCAGAGAAT(SEQ ID NO.47)。
在又一实施方式中，提供了一种核酸分析方法，该方法包括以下步骤：将靶核酸与饱和dsDNA结合染料混合形成混合物，在加热混合物时通过测定dsDNA结合染料的荧光产生靶核酸的解链曲线，该混合物中包括设计为能与靶核酸的一部分杂交的第二种核酸，第二种核酸小于靶核酸并且解链温度与靶核酸不同，使第二种核酸与靶核酸的部分杂交，使第二种核酸与第一种核酸解链，以及分析解链曲线的形状。在一个实施方式中，第二种核酸是可在产生靶核酸的解链曲线之前或之后加入的未标记探针，而在另一实施方式中，第二种核苷酸是较小的扩增子，例如可在扩增靶核酸的单一混合物中产生的扩增子。
本发明另一实施方式是一种PCR分析方法，该方法包括以下步骤：将dsDNA结合染料与含有未知起始量的靶核酸和设计用于扩增靶核酸的引物的样品混合，形成混合物，在dsDNA结合染料的存在下扩增靶核酸，在多个扩增循环期间的整个温度范围中监测dsDNA结合染料的荧光以产生多个解链曲线，用该解链曲线定量靶核酸的起始量。在扩增期间可使用未标记探针和/或饱和染料。
本领域技术人员通过理解以下说明性实施方式的详述后，可明白本发明的其它特征。
发明详述
由于SYBR Green I在PCR过程中表现出荧光的巨大变化，SYBR Green I成为一种广泛用于解链分析的染料(Wittwer CT等，Biotechniques 1997；22：130-1，134-8；Wittwer CT等所著《实时PCR》(Real-Time PCR)，见Persing D等编，DiagnosticMolecular Microbiology：Principles and Applications，ASM出版社，2004，印刷中)。SYBR Green I最初在解链分析中用以区分Tm值差别2℃或更大的不同PCR产物(Ririe KM等，Anal Biochem 1997；245：154-160)。随后，将SYBR Green I用于鉴别碱基缺失(Aoshima T等，Clin Chem 2000；46：119-22)、基因型二核苷酸重复(MarzilianoN等，Clin Chem 2000；46：423-5)以及鉴别多种序列改变(Lipsky RH等，Clin Chem2001；47：635-44；Pirulli D等，Clin Chem 2000；46：1842-4；Tanriverdi S等，J ClinMicrobiol.2002；40：3237-44；Hladnik U等，Clin Exp Med.2002；2：105-8)。然而，基因型之间Tm差异可能很小并可能挑战现有仪器的分辨率。事实上，已经认为SYBR Green I“不能在常规基因分型应用中使用”(von Ahsen N等，Clin Chem 2001；47：1331-1332)。采用通常使用的双链特异性DNA染料的解链曲线基因分型可导致随着解链转变区间加宽的Tm值提高(Douthart RJ等，Biochemistry 1973；12：214-20)和基因型之间Tm差异的压缩(图5D)。这些因素降低了SYBR Green I用于区分基因型的能力。
杂合的DNA由4种不同的单链组成，这些单链在变性并冷却时能产生2种同源双链分子和2种异源双链分子。理论上，所有4种产物具有不同的Tm值并且解链曲线应该是所有4种双链向单链转变的合成。然而，双链特异性DNA染料可能在解链过程中重新分布(Aktipis S等，Biochemistry 1975；14：326-31)，这引起染料从低解链温度的异源双链分子上释放并重新分布在更高解链温度的同源双链分子上。因为在与PCR相容的浓度下SYBR Green I没有饱和(Wittwer CT等，Biotechniques 1997；22：130-1，134-8；图9)，这样的重新分布是可能的并与缺少异源双链分子解链转变相一致(图5D)。
本发明染料能在基因分型和扫描的应用中使用。在仅扩增一种PCR产物并且序列是纯合的情况下，只形成同源双链分子。使用本发明的染料，不同同源双链分子之间Tm值差异没有被压缩(图5C)，并且可以显著区分基因型，即使是SNP。本发明染料也可以用于鉴别和区分反应中存在的多种产物，例如通过纯合的多个基因基因座或多个目标的扩增而产生的同源双链分子。相反，大概是由于染料的重新分布，使用SYBR Green I在大多数情况下只能观察到少数产物(见图7A)。
当扩增一个或多个杂合靶标时，使用本发明的染料可以容易地观察到异源双链分子。检测并鉴定异源双链分子的能力对于检测杂合基因型以及扫描未知突变来说尤其有用。采用用于实时PCR的诸如SYBR Green I、SYBR Gold以及溴化乙锭等不能观察到其中异源双链分子产物的传统双链DNA染料是不可能实现这一点的。
在解链过程中，异源双链分子的链可以与其完全互补的链重新结合并形成同源双链分子。由于在PCR结束时产物浓度很高，这一重新结合过程快速发生。通过限制产物处于其解链温度附近(尤其是处于异源双链和同源双链产物Tm值之间)的时间，所述的重新结合能被最小化。除了解链过程中链的重新结合，链与其完全匹配的或错配的互补链的选择性杂交受到冷却速度的影响。在这里所表示的条件下，快速冷却最有利于异源双链分子形成，而在低于-0.1℃/秒的速度下，异源双链分子经常会消失(图2)。这与变性HPLC技术相反，后者的冷却速度慢得多(-0.01至约-0.02℃/秒)，却仍有效形成异源双链分子(Xiao W等，Hum Mutat 2001；17：439-74)。同源双链分子和异源双链分子形成的相对速度也许非常依赖于产物大小，使用小的扩增子获得的结果对于dHPLC中更通常使用的更大的产物而言可能不具有典型性。
通过以更低的速度解链、花费更多的分析时间，可以提高纯合基因型之间的辨别力。DNA浓度对Tm的影响是解链曲线基因分型中潜在误差的一个来源。在PCR条件下使用50％GC含量的随机100bp的扩增子时，0.05μM和0.5μM的产物之间Tm值差异约为0.7℃(von Ahsen N等，Clin Chem 2001；47：1956-61；Wetmur JG，Grit RevBiochem Mol Biol 1991；26：227-59)。当不同纯合基因型的Tm值非常接近的时候，这一改变可能是重要的。然而，不同PCR样品趋向于以相同产物浓度达到平台期，因此扩增后浓度差异通常是最小的。同时，可以通过实时荧光估计扩增子浓度并为获得甚至更高的基因分型精度调节Tm值。另外，可以使用不对称PCR自动限制PCR产物的终浓度。
用本发明染料有可能将所有单个碱基杂合子与纯合子加以区分。在杂合子检测中，绝对解链温度和DNA浓度的影响不象使用涉及到区分纯合基因型的方法那么重要。异源双链分子影响解链曲线的形状，尤其是在转变的“早期”低温部分。通过平移X轴重叠解链转变的“晚期”高温部分，可使得不同的解链曲线温度匹配。然后可以以更高的精确度推断异源双链分子是否存在。因此，即使在未经PCR扩增的样品中，对DNA浓度的关注可能并不重要。
无论仪器的精确度如何，有些基因型的Tm值会是几乎相同的。检测具有相同Tm值的纯合变异的一种方法是将变体共同混合。获得的异源双链分子会在比纯合子更低的温度下解链，在标准化的解链曲线中表现出在主要解链转变之前的下降。
因而，使用目前可以利用的PCR扩增装置，本发明染料可以在解链曲线转变中鉴别目前不能用SYBR Green I鉴别的异源双链分子。图7A中说明了SYBR Green I不能简便地鉴别低温解链转变的一个可能原因。当存在几个稳定性递增的DNA片段时，使用SYBR Green I的低温峰与使用染料如染料S5(结构见实施例1)的相比很小。在解链过程中，SYBR Green I可能从低温双链分子上释放，只连接于在更高温度下解链的双链。这引起每个后继的峰比前一个高，使得最低温度的峰即便能够观察到也很小。正如图7B中所看到的，用染料S5可容易地检测到低温解链的产物，而用SYBR Green I却不能检测到。
使用染料S5的优点导致了对其它与PCR相容并在PCR相容浓度下适于基因分型的双链DNA染料的区别。许多用于本发明的方法中的染料属于花青家族。花青染料是在连接两个含氮杂环的链上含一个或多个二价“-C(R)＝”部分的那些染料。基团“R”可能是氢或任何碳取代基，例如氢或烷基，包括可以被任选取代的C1-6烷基。需要理解的是在其中有一个以上二价“-C(R)＝”部分的花青染料中，每个“R”可以是独立选择的。正如由这里所述的说明性通式所进一步定义的，这样的花青染料可以是单体或二聚体。许多花青染料，例如二价部分是＝N-、-C(R)＝N-等的染料也很合适。除了花青染料，预计其它dsDNA结合染料家族也可用于本文所述的PCR反应混合物、方法和组合物，这些家族包括但不限于吖啶基染料、菲啶鎓插入剂和菲咯啉基金属插入剂。
用于本文所述PCR反应和解链曲线混合物、方法和组合物的示例性染料包括PO-PROTM-1、BO-PROTM-1、SYTO 9、SYTO 43、SYTO 44、SYTO 45、SYTOX Blue、POPOTM-1、POPOTM-3、BOBOTM-1、BOBOTM-3、LO-PROTM-1、JO-PROTM-1、YO-PRO -1、TO-PRO -1、SYTO 11、SYTO 13、SYTO 15、SYTO 16、SYTO 20、SYTO 23、TOTOTM-3、YOYO -3(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)、GelStar (Cambrex Bio Science Rockland Inc.，Rockland，ME)、噻唑橙(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)、EvaGreenTM(Biotium，Hayward，CA)、BEBO、BETO、BOXTO(TATAA Biocenter AB.， Sweden)和本文所述的各种新型染料，其中大部分是饱和染料。
用于本文所述PCR反应混合物、方法和组合物的示例性花青染料也包括具有吡啶鎓、嘧啶鎓、喹啉鎓、异喹啉鎓或嘌呤鎓核心结构的不对称花青的单体或二聚体，以及具有通式I所述结构的那些花青染料：
式I
式中
部分 代表任选取代的稠合的单环或多环芳环或含氮杂芳环；
X是氧、硫、硒、碲或选自C(CH3)2或NR1的部分，式中R1是氢或烷基，包括C1-6烷基和C2-6烷基；
R2是包括C1-6烷基和C2-6烷基的烷基、包括C3-8环烷基的环烷基、芳基、包括芳基(C1-3烷基)的芳烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单烷基氨基烷基和二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基、烷基和芳基羰基、烷基和芳基羧酰胺、烷基和芳基磺酰基、亚烷基羧酸酯、亚烷基羧酰胺、亚烷基磺酸酯、亚烷基磺酸酯等、含杂原子的环状部分、或者含杂原子的非环状部分，这些基团各自可被任选取代；示范性含杂原子的部分包括任选取代的杂烷基，包括甲氧基甲基、乙氧基乙基等；杂环基，包括哌啶基等；烷基磺酸酯和芳基磺酸酯，包括甲基磺酸酯、4-氯苯基磺酸酯等；烷氧基，包括甲氧基、乙氧基等；氨基，包括甲基氨基、二甲基氨基等；羰基衍生物，包括烷基羰基和芳基羰基、烷基氨基羰基、烷氧基羰基等；杂烯基，包括烯基氨基烷基、烯氧基烷基、烷基氨基烯基、烷氧基烯基、亚烷基氨基烷基等；杂烯丙基(heteroallyl)；酯；胺；酰胺；磷-氧键和磷-硫键；包括含有杂原子的部分，如美国专利号5,658,751和PCT公开号WO 00/66664所述；将各自的公开内容全部纳入本文作为参考；
t＝0或1；
Z是0或1个电荷；
R3、R9和R10各自独立地选自氢、包括C1-6烷基和C2-6烷基的烷基或芳基羰基；
n＝0、1或2；和
Q是杂环，如吡啶鎓、嘧啶鎓、喹啉鎓或嘌呤鎓，各自可被任选取代。
本文所用术语“烷基”通常指含有1-约12个碳原子的直链或任选具有支链的烃部分，例如包括但不限于：甲基(Me)、乙基、丙基、丁基、十二烷基、4-乙基戊基等。
本文所用术语“环烷基”通常指含有3-约14个碳原子的至少一部分形成一个或两个环的直链或任选具有支链的烃部分，例如包括但不限于：环丙基、环戊基、环己基、4-甲基环己基、2，3-二甲基环戊基、3，5-二甲基环己基乙基等。
本文所用术语“芳基”通常指环状芳族部分，例如包括但不限于：苯基(Ph)、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯并、吡唑并、异噁唑基、异噻唑基、噁唑基、噻唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基(quinazalinyl)等。
本文所用术语“任选取代的”通常指用取代基任选取代母体基团上存在的一个或多个氢原子或孤电子对，包括碳、氮、氧或硫原子上存在的氢原子或孤电子对，取代基例如：卤素；羟基；氨基；硝基；巯基(thio)；磺酸酯；腈、烷基腈、烷基腈硫基；烷基、环烷基、卤代烷基、卤代环烷基；烷氧基、环烷氧基、卤代烷氧基；单烷基和二烷基氨基；三烷基铵；氨基烷基；单烷基和二烷基氨基烷基；三烷基铵烷基；三烷基铵烷硫基；烷硫基；环烷硫基、环杂烷硫基、核苷硫基；烷基、卤代烷基、环烷基和芳基羰基；芳基羰硫基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基；三烷基铵烷基羰硫基；烷基、卤代烷基、环烷基和芳基羰氧基；烷基、卤代烷基、环烷基和芳基磺酰基；苯二甲酰亚氨基；苯并噻唑或萘并噻唑；苯并噁唑或萘并噁唑和羧基衍生物，如羧酸、酯、硫酯和酰胺。应理解，取代邻近氢原子，包括双氢和连位氢，可以使取代这些邻近氢的取代基分别一起形成螺环或稠环。
应理解，各上述术语可以化学相关方式组合使用，以表示其它部分，如芳烷基指本文所述芳基连接于本文所述烷基所形成的结构，包括但不限于：苄基、苯乙基、皮考啉基、3，5-二甲氧基皮考啉-4-基等。
需要认识到，这里所描述的花青染料结构可以包含手性中心。在这些情况下，除了另有说明以外，需要理解在这些花青染料结构的描述中包括了所有立体异构体。这样的立体异构体包括单纯的光学活性异构体、外消旋混合物、以及含任何相对量的一种或多种立体异构构型的非对映异构体的混合物。
也需要认识到，这里所描述的花青染料结构可以包含几何中心。在这些情况下，除了另有说明以外，需要理解在花青染料结构的描述中包括了所有几何异构体。这样的几何异构体包括单纯形式或多种混合的几何构型形式的顺式、反式、E和Z异构体。也需要理解，取决于花青染料结构中所包含的双键的特性，这样的双键异构体可以根据如溶剂成分、溶剂极性、离子强度等条件在顺式和反式之间、或是E和Z构型之间互相转化。
进一步需要认识到，当电荷Z大于0时，可能存在结构式I的化合物的几种共振结构。例如，如结构式I所述，电荷Z在形式上可位于氮原子上，或者，电荷可位于杂环Q上。结构式I的带电化合物的共振结构可以通过结构式I的化合物的双键-单键构型的重新排列(如以下示例性结构)进行描述：
式中 、X、R2、R3、R9、R10和Q与式I中的定义相同，t＝1、Z＝1和n＝1。本文所述花青染料化合物包括几种可能的共振结构中的任何一种。应理解，形式电荷的位置以及优选的共振结构受 、X、R2、R3、R9、R10和Q部分的性质的影响。
也需要理解，在结构式I的化合物携带净电荷的情况下(诸如当Z＝1时，或在结构式I的化合物上存在如铵基团、或磺酸基团等带电的取代物的情况下)，这些结构式I的化合物伴有平衡离子。这里所包括的花青染料结构的描述中包括任何单价、二价或多价平衡离子。示例性的平衡离子包括如碘化物、氯化物、溴化物、氢氧化物、氧化物、醋酸根、三氟醋酸根、一磷酸根、二磷酸根、三磷酸根等带负电的平衡离子，以及如锂、钠、钾、铯、铵、多烷基铵等带正电的平衡离子。这样的平衡离子可能源于所用的合成方法、纯化方案、或其它离子交换过程。
相信平衡离子的性质或种类似乎不会影响这里所述的花青染料的功能性。需要认识到，当这里所述的染料溶于用于实践这里所述的PCR反应混合物、方法和组合物的溶剂或其它介质中时，伴随的平衡离子可以与溶剂或其它介质中存在的其它平衡离子交换。这样的附加平衡离子可以是溶剂离子、盐、缓冲液、和/或金属。
需要认识到，R2基团实际上可以是结构式I的母体化合物(其中t＝Z＝0)与具有式R2-L的化合物之间发生亲核反应产生的任何基团：
其中L是合适的离去基团，R2的定义如上所述。例如，R2是任选取代的烷基、酰基、芳基、磺酸或磺酰基，各自可被任选取代。示范性离去基团L包括但不限于：卤素，如氯和溴；酰化产物，如乙酸根或酯(acetate)、甲酸根或酯和三氟乙酸根或酯；磺酸根或酯，如甲磺酸根或酯、三氟甲磺酸根或酯和甲苯基磺酸根或酯；硫酸根或酯，如甲基硫酸根或酯等。
在一个示范性实施方式中，Q是杂环，例如但不限于：
式中R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12、R13和R14各自独立地选自氢、卤素、氨基、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、烷基磺酰基、卤代烷基磺酰基、芳基磺酰基、甲酰基、烷基羰基、芳基羰基、羧酸衍生物、单烷基氨基、二烷基氨基、三烷基铵、二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基、三烷基铵烷硫基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、烯基、聚烯基、炔基、聚炔基、烯基炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷硫基、芳硫基、烷基腈硫基、芳基羰硫基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、三烷基铵烷基羰硫基、其它硫酯、二烷基氨基、环烷硫基、环杂烷硫基、核苷硫基(以上基团各自可被任选取代)、哌啶并、哌嗪并(各自可被烷基、氨基、单烷基氨基烷基或二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基任选取代，或可任选地用烷基使氮季铵化)。
在另一示范性实施方式中，R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12、R13和R14之一是含有杂原子的部分，如美国专利号5,658,751所述。在另一示范性实施方式中，R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12、R13和R14之一是反应性基团，包括但不限于：卤素、羟基、醇盐(alkoxide)、胺、羧酸、卤化物、醇、醛、硫醇、烷硫基和芳硫基、烷基磺酰基和芳基磺酰基、琥珀酰亚胺基酯、酮和异硫氰酸酯，它们可用于将部分连接于染料核心结构，例如通过形成碳碳键、胺、酰胺、醚、硫醚、二硫键、酮、硫脲和席夫碱。在另一示范性实施方式中，R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12、R13和R14之一是具有下式的BRIDGE-DYE：
式中 、X、R2、t、Z、R3、R9、R10、Q和n的定义与式I相同，BRIDGE是直链或支链、环状或杂环的、饱和或不饱和、具有1-16个非氢原子如碳、氮、磷、氧或硫的单个共价键或共价连接，从而使得该连接含有烷基、醚、硫醚、胺、酯或酰胺键；碳碳单键、双键、三键或芳香键；磷-氧、磷-硫、氮-氮或氮-氧键；或者芳香键或杂芳键的任何组合。应理解，在一些实施方式中，此二聚体结构是关于BRIDGE对称的，在其它实施方式中，此二聚体结构是不关于BRIDGE对称的，例如，在BRIDGE两侧各自出现时各自独立地选择 、X、R2、t、Z、R3、R9、R10和n。
用于本发明的示范性染料也包括具有吡啶鎓或嘧啶鎓核心结构的式I花青染料，其中X是氧或硫；部分 代表任选取代的稠合苯并、任选取代的稠合萘并、任选取代的稠合吡啶并、任选取代的稠合嘧啶并、任选取代的稠合喹啉并等；n＝0或1；t＝0或1；R2是烷基，如甲基和乙基；任选取代的芳基，如苯基或甲苯基；亚烷基磺酸酯，如亚丙基磺酸；或者烷基磺酰基，如CH3(CH2)mSO2，式中m是0、1、2或3；Q是选自下组结构的杂环：
式中
R4是氢，烷氧基，包括甲氧基、乙氧基、丙氧基等；烷硫基，包括甲硫基、乙硫基等；杂环基烷基，包括任选取代的哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基等；或者包含带电基团的杂环基烷基，包括4，4-二甲基哌嗪-1-基等；或反应性基团，包括卤素、羟基、烷氧基、巯基、烷基和芳硫基、烷基和芳基磺酰基、氨基、甲酰基、烷基和芳基羰基、羧基衍生物等；
R5是C1-6烷基，包括甲基、乙基、丁基、仲丁基、异丁基等；任选取代的苯基；或者(CH2)3N+(Me)3；和
R6、R7和R8各自独立地是氢或甲基。
本文所用示范性染料也包括具有吡啶鎓或嘧啶鎓核心结构的式I花青染料，其中X是氧或硫；部分 代表任选取代的稠合苯并(形成任选取代的苯并噁唑鎓或苯并噻唑鎓环)或者任选取代的稠合萘并(形成任选取代的萘并噁唑鎓或萘并噻唑鎓环)；n＝0或1；t＝0或1；R2是烷基如甲基，芳基如苯基或甲苯基，亚烷基磺酸酯如亚丙基磺酸，或烷基磺酰基如CH3(CH2)mSO2，式中m是0、1、2或3；Q是4-吡啶鎓或4-嘧啶鎓杂环。
本文所用示范性染料也包括用于本文所述PCR反应混合物、方法和组合物的花青染料，它具有喹啉鎓核心结构，通式为式II：
式II
用饱和染料进行核酸解链分析专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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