改善的氨基脂质和递送核酸的方法

IPC分类号 : C07D345/00,C07D517/00,A61K9/127

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专利摘要

本发明提供用于向细胞递送治疗剂的优良组合物和方法。具体地，这些包括新型脂质和核酸-脂质颗粒，其提供有效的核酸包封和在体内包封的核酸向细胞的有效递送。本发明的组合物是高度有效的，由此允许以相对低的剂量有效地敲低特定的靶蛋白。另外，与本领域先前已知的组合物和方法相比，本发明的组合物和方法毒性较小，并且提供较高的治疗指数。

说明书

相关技术的描述

例如，治疗性核酸包括小干扰RNA(siRNA)，微小RNA(miRNA)，反义寡核苷酸，核酶，质粒，和免疫刺激性核酸。这些核酸通过各种机制作用。在siRNA或miRNA的情形中，这些核酸可以通过称为RNA干扰(RNAi)的过程下调特定蛋白的胞内水平。在将siRNA或miRNA引入到细胞质中后，这些双链的RNA构建体可以结合称为RISC的蛋白。所述siRNA或miRNA的有义链由RISC复合物置换，提供在RISC内的模板，所述模板可以识别并结合具有与所结合的siRNA或miRNA的序列互补的序列的mRNA。已经结合互补mRNA后，RISC复合物将mRNA裂解，并且释放出所裂解的链。RNAi可以通过靶向相应的编码蛋白合成的mRNA的特异性破坏而提供特定蛋白的下调。

RNAi的治疗性应用非常广泛，因为siRNA和miRNA构建体可以用针对靶蛋白的任何核苷酸序列合成。迄今为止，siRNA构建体已经在体外和体内模型中都表现出特异性下调靶蛋白的能力。另外，目前正在临床研究中对siRNA构建体进行评估。

然而，siRNA或miRNA构建体目前面对两个问题，第一，其对血浆中核酸酶消化的敏感性，第二，当其以游离siRNA或miRNA进行系统施用时，其进入细胞内区室的能力有限，在所述细胞内区室中其可以结合RISC。这些双链构建体可以通过在分子内结合化学修饰的核苷酸接头而被稳定，所述化学修饰的核苷酸接头例如硫代磷酸酯基团。然而，这些化学修饰仅提供对核酸酶消化的有限的保护，并且可能降低构建体的活性。可以通过使用载体系统如聚合物、阳离子脂质体或通过对构建体进行化学修饰如通过共价附着胆固醇分子而促进siRNA或miRNA的细胞内递送[参考文献]。然而，需要有改善的递送系统来提高siRNA和miRNA分子的功效并且减少或消除对化学修饰的需要。

反义寡核苷酸和核酶也可以抑制mRNA翻译成蛋白质。在反义构建体的情形中，这些单链脱氧核酸具有与靶蛋白mRNA的序列互补的序列，并且可以通过沃森-克里克碱基配对与mRNA结合。这种结合防止靶mRNA的翻译和/或引发mRNA转录物的RNA酶H降解。因此，反义寡核苷酸具有极大的作用特异性(即，下调特定疾病相关的蛋白)的潜力。迄今为止，这些化合物已经在一些体外和体内模型中显示是有希望的，所述模型包括炎性疾病、癌症、和HIV的模型(在Agrawal，Trends in Biotech.(生物科技趋势)14：376-387(1996)中综述)。反义也可以通过与染色体DNA特异性杂交而影响细胞活性。目前正在进行某些反义药物的高级人类临床评估。这些药物的靶标包括bcl2和载脂蛋白B基因和mRNA产物。

免疫刺激性核酸包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。在脱氧核糖核酸的情形中，已经表明某些序列或基序在哺乳动物中引发免疫刺激。这些序列或基序包括CpG基序，富含嘧啶的序列和回文序列。据信脱氧核糖核酸中的CpG基序由内体受体、toll样受体9(TLR-9)特异性识别，然后其引发先天性和获得性免疫刺激途径。还已经报道了一些免疫刺激性核糖核酸序列。据信这些RNA序列通过与toll-样受体6和7(TLR-6和TLR-7)结合而引发免疫激活。另外，还报道了双链RNA是免疫刺激性的，并且据信通过与TLR-3结合而激活。

使用治疗性核酸的一个公知的问题涉及磷酸二酯核苷酸间键合的稳定性和该接头对核酸酶的敏感性。血清中外切核酸酶和内切核酸酶的存在导致具有磷酸二酯接头的核酸的快速消化，并且因此，在存在血清或在细胞内的条件下，治疗性核酸可能具有非常短的半衰期。(Zelphati，O.，等，Antisense.Res.Dev.(反义研究发展)3：323-338(1993)；和Thierry，A.R.，等，在Gene Regulation：Biology of Antisense RNA and DNA(基因调控：反义RNA和DNA的生物学)(编辑Erickson，RP和Izant，JG；Raven Press，NY(1992)的第147-161页)。由于这些和其它已知的问题，目前正处于开发中的治疗性核酸不利用在天然核酸中发现的基本磷酸二酯化学。

通过减少血清或细胞内降解的化学修饰部分克服了这一问题。已经检测了在下列中的修饰：核苷酸间磷酸二酯桥接(bridge)(例如，使用硫代磷酸酯，甲基磷酸酯或氨基磷酸酯键)，核苷酸碱基(例如，5-丙炔基-嘧啶)，或糖(例如，2’-修饰的糖)(Uhlmann E.，等，Antisense：Chemical Modifications(反义：化学修饰).Encyclopedia of Cancer(癌症百科全书)，卷X.，第64-81页Academic Press Inc.(学院出版公司)(1997))。其他人已经尝试用2’-5’糖连接(参见，例如，美国专利号5,532,130)提高稳定性。已经尝试了其它的改变。然而，这些技术方案无一被证明是完全令人满意的，并且在体内游离的治疗性核酸仍然仅具有有限的功效。

另外，如上述关于siRNA和miRNA所述，存在与治疗性核酸有限的穿过细胞膜的能力相关的问题(参见，Vlassov，等，Biochim.Biophys.Acta(生物化学和生物物理学学报)1197：95-1082(1994))和与系统性毒性相关的问题，如补体介导的过敏反应，改变的凝结特性，和血细胞减少(cytopenia)(Galbraith，等，Antisense Nucl.Acid Drug Des.(反义核酸药物和疾病)4：201-206(1994))。

为了尝试提高功效，研究者还利用基于脂质的载体系统来递送化学修饰的或未修饰的治疗性核酸。在Zelphati，O和Szoka，F.C.，J.Contr.Rel.41：99-119(1996)中，作者提到阴离子(常规的)脂质体、pH敏感的脂质体、免疫脂质体、促溶脂质体、和阳离子脂质/反义团聚体的使用。相似的siRNA已经在阳离子脂质体中进行系统施用，并且已报道这些核酸-脂质颗粒在包括非人灵长类动物的哺乳动物中提供靶蛋白的改善的下调(Zimmermann等，Nature(自然)441：111-114(2006))。

尽管取得这一进步，在本领域中存在对改善适于常规治疗应用的核酸-脂质颗粒和组合物的需求。优选地，这些组合物将以高效率包封核酸，具有高的药物∶脂质比率，保护所包封的核酸免于在血清中降解和清除，适于系统递送，并且提供所包封的核酸的细胞内递送。另外，这些核酸-脂质颗粒应该是良好耐受性的，并且提供充分的治疗指数，以致以有效剂量的核酸进行的患者治疗不与对所述患者的显著的毒性和/或危险相关。本发明提供这样的组合物、制备所述组合物的方法、和使用所述组合物将核酸引入到细胞中(包括用于治疗疾病)的方法。

简述

本发明提供新型的氨基脂质，以及包含所述氨基脂质的脂质颗粒。这些脂质颗粒可以进一步包含活性剂，并且可以按照本发明的相关方法用于将所述活性剂递送至细胞中。

在一个实施方案中，本发明包括具有下述结构(I)的氨基脂质：

或其盐，其中

R¹和R²是相同的或不同的，并且独立地是任选取代的C₁₂-C₂₄烷基，任选取代的C₁₂-C₂₄烯基，任选取代的C₁₂-C₂₄炔基，或任选取代的C₁₂-C₂₄酰基；

R³和R⁴是相同的或不同的，并且独立地是任选取代的C₁-C₆烷基，任选取代的C₁-C₆烯基，或任选取代的C₁-C₆炔基或R³和R⁴可以连接形成任选取代的4-6个碳原子和1或2个杂原子的杂环，所述杂原子选自氮和氧；

R⁵不存在或是氢或C₁-C₆烷基，以提供季化的胺；

m，n，和p是相同的或不同的，并且独立地是0或1，条件是m，n，和p不同时是0；

q是2，3，或4；并且

Y和Z是相同的或不同的，并且独立地是O，S，或NH。

在一个实施方案中，所述氨基脂质是具有结构(I)的氨基脂质，其中q为2。

在某些实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构(II)：

或其盐，其中

R⁵不存在或是氢或C₁-C₆烷基，以提供季化的胺；

m，n，和p是相同的或不同的，并且独立地是0或1，条件是m，n，和p不同时是0；

Y和Z是相同的或不同的，并且独立地是O，S，或NH。

在具体的实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构(III)：

其中

N为2，3，或4。

在一个具体的实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构：

在另一个实施方案中，本发明提供具有下述结构的氨基脂质：

在进一步相关的实施方案中，本发明包括包含一种或多种本发明上述氨基脂质的脂质颗粒。在某些实施方案中，颗粒还包含中性脂质和能够减少颗粒聚集的脂质。在一个具体的实施方案中，所述脂质颗粒基本上由下述组成：(i)DLin-K-C2-DMA；(ii)中性脂质，其选自DSPC，POPC，DOPE，和SM；(iii)胆固醇；和(iv)PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA，其摩尔比率为约20-60％DLin-K-C2-DMA∶5-25％中性脂质∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA。在一个具体的实施方案中，所述脂质颗粒基本上由下述组成：(i)DLin-K²-DMA；(ii)中性脂质，其选自DSPC，POPC，DOPE，和SM；(iii)胆固醇；和(iv)PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA，其摩尔比率为约20-60％DLin-K²-DMA∶5-25％中性脂质∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA。

在另外相关的实施方案中，本发明包括还包含治疗剂的本发明的脂质颗粒。在一个实施方案中，所述治疗剂是核酸。在不同的实施方案中，所述核酸是质粒、免疫刺激性寡核苷酸、siRNA、微小RNA、反义寡核苷酸、或核酶。

在另一个相关的实施方案中，本发明包括一种药物组合物，其包含本发明的脂质颗粒和药用赋形剂、载体或稀释剂。

在其它相关的实施方案中，本发明还包括调控细胞的多肽表达的方法，所述方法包括向细胞提供本发明的脂质颗粒或药物组合物。在具体的实施方案中，所述脂质颗粒包含治疗剂，所述治疗剂选自siRNA，微小RNA，反义寡核苷酸，和能够表达siRNA、微小RNA、或反义寡核苷酸的质粒，并且其中所述siRNA、微小RNA、或反义RNA包括这样的多核苷酸，其特异性结合编码所述多肽的多核苷酸，或其互补体，以使所述多肽的表达减少。在另一个实施方案中，所述核酸是编码所述多肽或其功能变体或其片段的质粒，以使所述多肽或其功能变体或片段的表达增加。

在进一步相关的实施方案中，本发明包括治疗受试者中特征在于多肽过量表达的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供本发明的脂质颗粒或药物组合物，其中治疗剂选自siRNA，微小RNA，反义寡核苷酸，和能够表达siRNA、微小RNA或反义寡核苷酸的质粒，并且其中所述siRNA、微小RNA、或反义RNA包括这样的多核苷酸，其特异性结合编码所述多肽的多核苷酸，或其互补体。

在另一个相关的实施方案中，本发明包括治疗受试者中特征在于多肽的低表达的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供本发明的药物组合物，其中所述治疗剂是编码所述多肽或其功能变体或片段的质粒。

在进一步的实施方案中，本发明包括在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者提供本发明的药物组合物，其中所述治疗剂是免疫刺激性寡核苷酸。在具体的实施方案中，将所述药物组合物与疫苗或抗原组合提供给患者。

在相关实施方案中，本发明包括一种疫苗，其包含本发明的脂质颗粒和与疾病或病原体相关的抗原。在一个实施方案中，所述脂质颗粒包含免疫刺激性核酸或寡核苷酸。在具体的实施方案中，所述抗原是肿瘤抗原。在另一个实施方案中，所述抗原是病毒抗原、细菌抗原、或寄生虫抗原。

本发明还包括制备本发明的脂质颗粒和药物组合物的方法，以及有效用于制备这些脂质颗粒和药物组合物的试剂盒。

在具体的实施方案中，本发明的任何组合物或方法可以包括本文所述的本发明其它阳离子脂质中的任一种作为阳离子脂质。在具体的实施方案中，所述阳离子脂质是DLin-K²-DMA或DLin-K6-DMA。

几副附图的简述

图1是提议的阳离子脂质膜破坏作用的作用机制的图以及分成首基、接头和烃链结构域的DLinDMA的结构图。当分离时，阳离子脂质和内体膜阴离子脂质如磷脂酰丝氨酸采用圆柱分子形状，其与以双分子层构型包装是相容的。然而，当阳离子和阴离子脂质混合在一起时，它们结合形成离子对，其中结合的首基的横截面积小于分离时单个首基面积的总和的横截面积。因此，离子对采用分子“圆锥”形，其促进形成倒转的、非双分子层相，诸如所示的六边H_II相。倒转相不支持双分子层结构，并且与膜融合和膜破坏相关(Hafez，I.M.，等，Gene Ther(基因治疗)8，1188-1196(2001)和Cullis，P.R.，等，Chem Phys Lipids(脂质化学和物理学)40，127-144(1986))。

图2A-B是描述包含各种阳离子脂质的核酸-脂质颗粒的体内沉默活性的图。图1A描述DLinDAP(▼)，DLinDMA(▲)，DLin-K-DMA(■)和DLin-K-C2-DMA(●)制剂在小鼠FVII模型中的沉默活性。所有的核酸-脂质颗粒使用预成型囊泡(PFV)法制备并且由可电离的阳离子脂质，DSPC，胆固醇和PEG-脂质(40/10/40/10mol/mol)组成，其中FVII siRNA-与-总脂质的比率为～0.05(wt/wt)。数据点表示为PBS对照动物的百分数，并且表示组平均数(n＝5)±s.d，并且在同一研究中比较所有的制剂。图2B表明首基延伸对DLin-K-DMA活性的影响。DLin-K-DMA(■)具有在DMA首基和缩酮环接头之间添加的另外的亚甲基基团，从而产生DLin-K-C2-DMA(●)，DLin-K-C3-DMA(▲)和DLin-K-C4-DMA(▼)。在小鼠FVII模型中评估每种脂质的PFV制剂的活性。数据点表示为PBS对照动物的百分数，并且表示组平均数(n＝4)±s.d。

图3是描述在向小鼠施用各种剂量的包含包封的FVII siRNA的所示核酸-脂质颗粒制剂后残留的FVII的量的图。

图4是描述在向大鼠施用各种剂量的包含包封的FVII siRNA的所示核酸-脂质颗粒制剂后残留的FVII的量的图。

图5是比较在向小鼠或大鼠施用两种包含包封的FVII siRNA的核酸-脂质颗粒制剂(DLin-K-C2-DMA或DLin-K-DMA)后残留的FVII的量的图。

图6是比较在向小鼠施用不同浓度的三种不同的包含包封的FVII siRNA的核酸-脂质颗粒制剂(DLin-K6-DMA，DLin-K-C2-DMA，和DLin-K-DMA)后残留的FVII的量的图。

图7是描述在向动物施用各种剂量的包含包封的FVII siRNA的所示核酸-脂质颗粒制剂后残留的FVII的量的图。C2表示DLin-K-C2-DMA；C3表示DLin-K-C3-DMA；和C4表示DLin-K-C4-DMA。

图8是显示在施用不同剂量的核酸-脂质颗粒制剂后残留的FVII的量的图，其中所述核酸-脂质颗粒制剂包含不同的所示阳离子脂质：DLinDAP(●)，DLinDMA(▲)，DLin-K-DMA(■)，或DLIN-K-C2-DMA(◆)。

图9A-B示例KC2-SNALP制剂的功效。图9A是显示在小鼠中相对于DLin-K-C2-DMA PFV制剂KC2-SNALP的提高的功效的图。在小鼠FVII模型中，将KC2-SNALP(○)的体内功效与未最优化的DLin-KC2-DMA PFV制剂(●)的体内功效进行比较。数据点表示为PBS对照动物的百分数，并且表示组平均数(n＝5)±s.d。图9B描述KC2-SNALP在非人灵长类动物中的功效。食蟹猴(Cynomolgus monkeys)(n＝3/组)通过头静脉以15分钟的静脉内输注(5mL/kg)接受配制在KC2-SNALP中的0.03，0.1，0.3或1mg/kg siTTR，或1mg/kg siApoB，或PBS。在施用后48小时处死动物。在肝脏样品中确定相对于GAPDH mRNA水平的TTR mRNA水平。数据点表示组平均值±s.d。^*＝P＜0.05；^**＝P＜0.005。

详述

本发明部分是基于新型阳离子脂质的鉴定，所述阳离子脂质在用在脂质颗粒中用于体内递送治疗剂时提供良好的结果。具体地，本发明提供包含本发明所述的阳离子脂质的核酸-脂质颗粒组合物(还称为制剂或脂质体制剂)，所述核酸-脂质颗粒组合物在体内提供增加的核酸活性和该组合物的显著耐受性，与先前所述的核酸-脂质颗粒组合物比较时，预计其与治疗指数的显著提高相关。

如在所附的实施例中所述，利用合理的设计方法来发现用于递送核酸(包括，例如，RNAi治疗剂)的下一代脂质颗粒系统中的新型脂质。使用这种方法，描述了关于可电离的阳离子脂质的重要的结构-活性考虑，并且基于DLinDMA结构，设计并表征了多种脂质。表明包含称为DLin-K-C2-DMA的阳离子脂质的核酸-脂质颗粒在啮齿动物和非人灵长类动物中是良好耐受的，并且其在啮齿动物中以低至0.01mg/kg的siRNA剂量表现出体内活性，以及在非人灵长类动物中表现出对治疗显著基因(TTR)的沉默。特别地，在该工作中获得的TTR沉默(ED₅₀～0.3mg/kg)，在非人灵长类动物中相对于先前的LNP-siRNA介导的沉默的报道，表现活性的显著提高。认为在该研究中观察到的功效代表迄今为止在非人灵长类动物中关于RNAi治疗剂观察到的最高水平的功效。

因此，在某些实施方案中，本发明特别提供用于递送siRNA分子的改善的组合物。在本发明中表明这些组合物有效下调蛋白水平和/或靶蛋白的mRNA水平。本发明的脂质颗粒和组合物可以用于各种目的，包括在体外或体内向细胞递送缔合的或包封的治疗剂。因此，本发明提供在需要治疗的受试者中治疗疾病或病症的方法，其通过使所述受试者接触与适当的治疗剂相缔合的本发明的脂质颗粒而进行。

如本发明所述，本发明的脂质颗粒特别有效用于递送核酸，包括，例如，siRNA分子和质粒。因此，本发明的脂质颗粒和组合物可以用来在体外和体内调节靶基因和蛋白的表达，其通过使细胞接触本发明的脂质颗粒而进行，其中所述脂质颗粒与减少靶基因表达的核酸(例如，siRNA)缔合，或与可以用来增加需要的蛋白的表达的核酸(例如，编码该所需要的蛋白的质粒)缔合。

下文更详细地描述本发明的阳离子脂质、以及包含其的脂质颗粒和组合物、和它们递送治疗剂和调控基因与蛋白表达的应用的多种示例性的实施方案。

A.氨基脂质

本发明提供新型的氨基脂质，其有利地用于本发明的脂质颗粒中用于向细胞体内递送治疗剂，其包括具有下述结构的氨基脂质。

在本发明的一个实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构(I)：

其中

R⁵不存在或是氢或C₁-C₆烷基，以提供季化的胺(quaternary amine)；

m，n，和p是相同的或不同的，并且独立地是0或1，条件是m，n，和p不同时是0；

q是2，3，或4；并且

Y和Z是相同的或不同的，并且独立地是O，S，或NH。

在一个具体的实施方案中，q是2。

“烷基”意指包含1-24个碳原子的直链的或支链的、无环或环状的、饱和的脂族烃。代表性的饱和直链烷基包括甲基，乙基，正丙基，正丁基，正戊基，正己基等；而饱和的支链烷基包括异丙基，仲丁基，异丁基，叔丁基，异戊基等。代表性的饱和环烷基包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基等；而不饱和的环烷基包括环戊烯基和环己烯基等。

“烯基”意指在相邻碳原子之间包含至少一个双键的如上定义的烷基。烯基包括顺式和反式异构体。代表性的直链和支链烯基包括乙烯基，丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，异丁烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-甲基-1-丁烯基，2-甲基-2-丁烯基，2，3-二甲基-2-丁烯基等。

“炔基”意指在相邻碳之间另外包含至少一个三键的任意如上定义的烷基或烯基。代表性的直链和支链的炔基包括乙炔基，丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，1-戊炔基，2-戊炔基，3-甲基-1丁炔基等。

“酰基”意指其中连接点的碳被氧代基团取代的任意烷基，烯基，或炔基，如下文所述。例如，-C(＝O)烷基，-C(＝O)烯基，和-C(＝O)炔基是酰基基团。

“杂环”意指5元至7元单环、或7元至10元双环的杂环，其是饱和的、不饱和的、或芳香的，并且其包含1或2个独立选自氮、氧和硫的杂原子，并且其中氮和硫杂原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化，杂环包括任意上述杂环稠合到苯环上的双环。杂环可以通过任意杂原子或碳原子连接。杂环包括如下文定义的杂芳基。杂环包括吗啉基，吡咯烷酮基(pyrrolidinonyl)，吡咯烷基，哌啶基，piperizynyl，己内酰脲基(hydantoinyl)，戊内酰胺基(valerolactamyl)，环氧乙烷基(oxiranyl)，氧杂环丁烷基(oxetanyl)，四氢呋喃基(tetrahydrofuranyl)，四氢吡喃基(tetrahydropyranyl)，四氢吡啶基(tetrahydropyridinyl)，四氢嘧啶基(tetrahydroprimidinyl)，四氢苯硫基(tetrahydrothiophenyl)，四氢噻喃基(tetrahydrothiopyranyl)，四氢嘧啶基(tetrahydropyrimidinyl)，四氢苯硫基(tetrahydrothiophenyl)，四氢噻喃基(tetrahydrothiopyranyl)等。

术语“任选地取代的烷基”，“任选地取代的烯基”，“任选地取代的炔基”，“任选地取代的酰基”，和“任选地取代的杂环”意指，当取代时，至少一个氢原子被取代基取代。在氧代取代基(＝O)的情形中，两个氢原子被取代。在这一点上，取代基包括桥氧基(oxo)，卤素，杂环，-CN，-OR^x，-NR^xR^y，-NR^xC(＝O)R^y，-NR^xSO₂R^y，-C(＝O)R^x，-C(＝O)OR^x，-C(＝O)NR^xR^y，-SO_nR^x和-SO_nNR^xR^y，其中n是0，1或2，R^x和R^y是相同的或不同的，并且独立地为氢，烷基或杂环，并且所述烷基和杂环取代基的每一种可以进一步被下列中的一种或多种取代：桥氧基，卤素，-OH，-CN，烷基，-OR^x，杂环，-NR^xR^y，-NR^xC(＝O)R^y，-NR^xSO₂R^y，-C(＝O)R^x，-C(＝O)OR^x，-C(＝O)NR^xR^y，-SO_nR^x和-SO_nNR^xR^y。

“卤素”意指氟，氯，溴和碘。

在某些实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构(II)：

或其盐，其中

R¹和R²是相同的或不同的，并且独立地是任选地取代的C₁₂-C₂₄烷基，任选地取代的C₁₂-C₂₄烯基，任选地取代的C₁₂-C₂₄炔基，或任选地取代的C₁₂-C₂₄酰基；

R³和R⁴是相同的或不同的，并且独立地是任选地取代的C₁-C₆烷基，任选地取代的C₁-C₆烯基，或任选地取代的C₁-C₆炔基或R³和R⁴可以连接形成任选地取代的4-6个碳原子和1或2个杂原子的杂环，所述杂原子选自氮和氧；

R⁵不存在或是氢或C₁-C₆烷基，以提供季化的胺；

m，n，和p是相同的或不同的，并且独立地是0或1，条件是m，n，和p不同时是0；

Y和Z是相同的或不同的，并且独立地是O，S，或NH。

在某些实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构(III)：

其中

n是2，3，或4。

在一个具体的实施方案中，n是2。

在某些实施方案中，本发明的氨基脂质具有下述结构之一：

在一些实施方案中，本发明的方法可能需要使用保护基。保护基方法是本领域技术人员所公知的(参见，例如，Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基团)，Green，T.W.等，Wiley-Interscience，New York City，1999)。简言之，在本发明情形中的保护基是减少或消除官能团的不需要的反应性的任何基团。可以将保护基添加到官能团上，以在某些反应过程中掩蔽其反应性，然后去除以暴露原始的官能团。在一些实施方案中，使用“醇保护基”。“醇保护基”是减少或消除醇官能团的不需要的反应性的任意基团。可以使用本领域公知的技术添加和去除保护基。

本发明的化合物可以通过已知的有机合成技术制备，包括在实施例中更详细描述的方法。通常，上述结构(I)的化合物可以通过下述反应路线1或2而制备，其中所有取代基如上文定义，除非另外指明。

可以按照反应路线1制备结构(I)的化合物，其中m为1，p为0。酮1和格利雅试剂2，其中P是醇保护基如三苯甲基，可以购买或按照本领域普通技术人员已知的方法制备。1和2的反应产生醇3。3的去保护，例如，通过用弱酸处理，然后用适当的溴化试剂如三溴化磷进行溴化，分别产生4和5。用6处理溴化物5产生杂环化合物7。接着，用胺8处理7产生结构(I)的化合物，其中m是1，并且R⁵不存在(9)。用氯化物10进一步处理9产生结构(I)的化合物，其中m是1，并且R⁵存在。

1.反应路线1

可以按照反应路线2制备结构(I)的化合物，其中m和p是0。酮1和溴化物6可以购买或按照本领域普通技术人员已知的方法制备。1和6的反应产生杂环12。用胺8处理12产生结构(I)的化合物，其中m为0并且R⁵不存在(13)。用10进一步处理13产生结构(I)的化合物，其中w为0并且R⁵存在。

2.反应路线2

在某些实施方案中，其中m和p为1，且n为0，本发明的化合物可以按照反应路线3制备。化合物12和13可以购买或按照本领域普通技术人员已知的方法制备。12和13的反应产生结构(I)的化合物，其中R⁵不存在(14)。在其它实施方案中，其中R⁵存在，可以用10处理13来获得结构15的化合物。

3.反应路线3

在某些其它实施方案中，其中m或p为1，且n为0，本发明的化合物可以按照反应路线4制备。化合物16可以购买或按照本领域普通技术人员已知的方法制备，并且与13反应产生结构(I)的化合物，其中R⁵不存在(17)。其中R⁵存在的其它结构(I)的实施方案可以通过用10处理17产生结构18的化合物进行制备。

4.反应路线4

在结构(I)的某些具体的实施方案中，其中n为1，且m和p为0，本发明的化合物可以按照反应路线5制备。化合物19可以购买或按照本领域普通技术人员已知的方法制备。19与甲醛反应，然后去除任选的醇保护基(P)，生成醇20。对20进行溴化，然后用胺8处理生成22。然后，可以用正丁基锂和R¹I处理化合物22，然后进一步用正丁基锂和R²I处理，生成结构(I)的化合物，其中R⁵不存在(23)。用10进一步处理23生成结构(I)的化合物，其中R⁵存在(24)。

5.反应路线5

在具体的实施方案中，本发明的氨基脂质是阳离子脂质。当用于本文时，术语“氨基脂质”意指包括具有一个或两个脂肪酸或脂肪烷基链和氨基首基(包括烷基氨基或二烷基氨基基团)的那些脂质，其中所述氨基首基可以在生理pH下质子化以形成阳离子脂质。

其它氨基脂质将包括具有备选的脂肪酸基团和其它二烷基氨基基团的那些，包括其中的烷基取代基是不同的那些(例如，N-乙基-N-甲基氨基-，N-丙基-N-乙基氨基-等)。对于其中的R¹¹和R¹²均为长链烷基或酰基基团的那些实施方案，它们可以是相同的或不同的。通常，具有较不饱和的酰基链的氨基脂质更容易限定尺寸，特别是当复合物必须限定低于约0.3微米的尺寸时，以用于过滤除菌目的。优选包含碳链长度在C₁₄-C₂₂范围内的不饱和脂肪酸的氨基脂质。其它构架也可以用来分离氨基脂质的氨基基团和脂肪酸或脂肪烷基部分。适当的构架是本领域技术人员已知的。

在某些实施方案中，本发明的氨基或阳离子脂质具有至少一个可质子化的或可去质子化的基团，以使所述脂质在生理pH(例如pH 7.4)或低于生理pH的pH时带正电荷，并且在第二pH优选地在生理pH或高于生理pH时是中性的。当然，应该理解，由于pH的作用添加或去除质子是一种平衡过程，并且所称的带电荷或中性脂质是指主要种类的性质，并且不需要所有脂质以带电荷的或中性形式存在。本发明的应用不排除具有多于一个可质子化或可去质子化的基团的脂质，或者是两性离子的脂质。

在某些实施方案中，本发明所述的可质子化的脂质的可质子化的基团具有在约4-约11范围内的pKa。最优选的是约4-约7的pKa，因为这些脂质在较低的pH配制阶段将是阳离子，而颗粒在约pH 7.4的生理pH很大程度上(但不是完全)将是表面中性的。这一pKa的一个益处是至少一些与所述颗粒的外表面缔合的核酸在生理pH下将失去其静电相互作用，并且通过简单的透析去除；因此极大地减少颗粒被清除的容易性。

B.脂质颗粒

本发明还提供包含一种或多种上述氨基脂质的脂质颗粒。脂质颗粒包括，但不限于，脂质体。当用于本文时，脂质体是一种具有包绕水性内部的含脂质膜的结构。脂质体可以具有一个或多个脂质膜。本发明考虑单分子层脂质体，其称为单层的，并且考虑多分子层脂质体，其称为多层的。当与核酸复合时，脂质颗粒还可以是脂质复合物(lipoplexes)，其由在DNA层之间夹持的阳离子脂质双分子层组成，例如，如在Felgner，Scientific American(美国科学)中所述。

本发明的脂质颗粒可以进一步包含一种或多种另外的脂质和/或其它成分，诸如胆固醇。其它脂质可以包含在本发明的脂质体组合物中，用于各种目的，诸如防止脂质氧化或将配体附着到脂质体表面。本发明的脂质体中可以存在多种脂质中的任一种，包括两亲的、中性、阳离子、和阴离子脂质。这样的脂质可以单独使用或组合使用。可以存在的另外的脂质成分的具体实例在下文中描述。

在某些实施方案中，本发明的脂质颗粒包含上述氨基脂质、非阳离子或中性脂质、和抑制颗粒聚集的缀合的脂质。在某些实施方案中，本发明的脂质颗粒包含上述氨基脂质、非阳离子或中性脂质、固醇、和抑制颗粒聚集的缀合的脂质。在具体的实施方案中，这些脂质颗粒进一步包含除本发明的氨基脂质以外的阳离子脂质。

在本发明的脂质颗粒中可以存在的另外的成分包括双层稳定成分，诸如聚酰胺低聚物(参见，例如，美国专利号6,320,017)，肽，蛋白质，去污剂，脂质-衍生物，如偶联到磷脂酰乙醇胺上的PEG和缀合到神经酰胺上的PEG(参见，美国专利号5,885,613)。

在形成过程中减少颗粒聚集的脂质的实例包括，诸如聚乙二醇(PEG)-修饰的脂质，单唾液酸苷(monosialoganglioside)Gm1，和聚酰胺低聚物(“PAO”)(在美国专利号6,320,017中所述)。在形成过程中防止聚集的其它具有不带电荷、亲水性、立体障碍结构部分的化合物，如PEG，Gm1或ATTA，也可以偶联到脂质上，以用于本发明的方法和组合物。例如，ATTA-脂质记述在美国专利号6,320,017中，并且例如，PEG-脂质缀合物记述在美国专利号5,820,873，5,534,499和5,885,613中。典型地，被选择用于减少聚集的脂质成分的浓度为约1-15％(按脂质的摩尔百分数)。

有效用于本发明的PEG-修饰的脂质(或脂质-聚氧乙烯缀合物)的具体的实例可以具有多种“锚定”脂质部分，以将PEG部分锚定在脂囊泡的表面上。适合的PEG-修饰的脂质的实例包括PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸，PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)，其记述在同时待审的USSN 08/486,214中，其通过引用结合于此，PEG-修饰的二烷基胺和PEG-修饰的1，2-二酰氧基丙烷-3-胺。特别优选的是PEG-修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。

在具体的实施方案中，PEG-脂质选自：

在空间结构大的结构部分如PEG或ATTA缀合到脂质锚定物上的实施方案中，脂质锚定物的选择取决于所述缀合物与脂质颗粒采用何种类型的缔合。公知的是，mePEG(mw2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mePEG(mw2000)-diastearoylphosphatidylethanolamine)(PEG-DSPE)将保持与脂质体缔合，直到所述颗粒从循环中清除，这可能是数天。其它缀合物，如PEG-CerC20具有相似的保持能力。然而，PEG-CerC14在暴露于血清时，迅速从制剂中交换出去，在一些测定中T_1/2小于60分钟。如在美国专利申请SN 08/486,214中所示，至少三个特征影响交换速率：酰基链的长度，酰基链的饱和度，和立体障碍首基的尺寸。具有这些特征的适当变化的化合物可以有效用于本发明。对于一些治疗应用，PEG-修饰的脂质在体内快速由核酸-脂质颗粒脱落可能是优选的，并且因此该PEG-修饰的脂质将具有相对较短的脂质锚定物。在其它治疗应用中，核酸-脂质颗粒表现出较长的血浆循环寿命可能是优选的，并且因此该PEG-修饰的脂质将具有相对较长的脂质锚定物。

应该注意到，防止聚集的化合物不必须需要脂质缀合物正确行使功能。溶液中游离的PEG或游离的ATTA可以足以防止聚集。如果颗粒在配制后是稳定的，PEG或ATTA可以在施用给受试者之前透析去掉。

术语“非阳离子脂质”是指任何两亲性脂质以及任何其它的中性脂质或阴离子脂质。在本发明的脂质颗粒(例如，SNALP)中所用的非阳离子脂质，可以是能够产生稳定的复合物的多种中性不带电荷的、两性离子、或阴离子脂质中的任一种。

术语“中性脂质”是指在所选的pH下表现出不带电荷的或中性两性离子形式的多种脂质种类中的任一种。在生理pH下，所述脂质包括，例如，二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，鞘磷脂，脑磷脂，胆固醇，脑苷脂，和二酰基甘油。

术语“阴离子脂质”是指在生理pH下带负电荷的任何脂质。这些脂质包括，但不限于，磷脂酰甘油，心磷脂(cardiolipins)，二酰基磷脂酰丝氨酸，二酰基磷脂酸(diacylphosphatidic acids)，N-十二酰磷脂酰乙醇胺(N-dodecanoyl phosphatidylethanolamines)，N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺(N-succinyl phosphatidylethanolamines)，N-戊二酰磷脂酰乙醇胺(N-glutarylphosphatidylethanolamines)，赖氨酰磷脂酰甘油(lysylphosphatidylglycerols)，棕榈酰油酰磷脂酰甘油(palmitoyloleyolphosphatidylglycerol)(POPG)，和其它与中性脂质连接的阴离子修饰基团。所述脂质包括，例如，二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，鞘磷脂，二氢鞘磷脂(dihydrosphingomyelin)，脑磷脂，和脑苷脂。例如，对用于本文所述的颗粒中的中性脂质的选择通常受脂质体尺寸和脂质体在血流中的稳定性的考虑指导。优选地，中性脂质成分是具有两个酰基基团的脂质，(即，二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺)。具有多个有不同的链长度和饱和度的酰基链基团的脂质是可获得的，或可以通过公知的技术分离或合成。在一组实施方案中，包含具有C₁₄-C₂₂范围内的碳链长度的饱和脂肪酸的脂质是优选的。在另一组实施方案中，使用具有碳链长度在C₁₄-C₂₂范围内的单不饱和或二不饱和脂肪酸的脂质。另外，可以使用具有饱和的和不饱和的脂肪酸链的混合物的脂质。优选地，本发明所用的中性脂质为DOPE，DSPC，POPC，或任何相关的磷脂酰胆碱。有效用于本发明的中性脂质还可以由鞘磷脂，二氢鞘磷脂，或具有其它首基如丝氨酸和肌醇的磷脂组成。

非阳离子脂质的非限制性实例包括磷脂，如磷脂酰胆碱(lecithin)，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰胆碱(lysolecithin)，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，鞘磷脂，卵鞘磷脂(ESM)，脑磷脂，心磷脂，磷脂酸，脑苷脂，双十六烷基磷酸酯(dicetylphosphate)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine)(DSPC)，二油酰磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine)(DOPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine)(DPPC)，二油酰磷脂酰甘油(dioleoylphosphatidylglycerol)(DOPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(dipalmitoylphosphatidylglycerol)(DPPG)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl-phosphatidylcholine)(POPC)，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)，棕榈酰油酰-磷脂酰甘油(POPG)，二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)，二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)，单甲基-磷脂酰乙醇胺，二甲基-磷脂酰乙醇胺，二反油酰(dielaidoyl)-磷脂酰乙醇胺(DEPE)，硬脂酰油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)，溶血磷脂酰胆碱，二亚油酰磷脂酰胆碱(dilinoleoylphosphatidylcholine)，以及它们的混合物。也可以使用其它二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。在这些脂质中的酰基优选是来源于具有C₁₀-C₂₄碳链的脂肪酸的酰基基团，例如，月桂酰，肉豆蔻酰，棕榈酰，硬脂酰，或油酰。

非阳离子脂质的其它实例包括固醇如胆固醇及其衍生物，如胆甾烷醇(cholestanol)，胆甾烷酮(cholestanone)，胆甾烯酮(cholestenone)，和粪醇(coprostanol)。

在一些实施方案中，在脂质颗粒如SNALP中存在的非阳离子脂质包括胆固醇或由胆固醇组成，例如，磷脂-游离的SNALP。在其它实施方案中，在脂质颗粒如SNALP中存在的非阳离子脂质包括一种或多种磷脂或由一种或多种磷脂组成，例如，胆固醇-游离的SNALP。在进一步的实施方案中，在SNALP中存在的非阳离子脂质包括一种或多种磷脂和胆固醇的混合物或由一种或多种磷脂和胆固醇的混合物组成。

适用于本发明的非阳离子脂质的其它实例包括含有非磷的脂质，诸如例如，硬脂胺，十二烷胺，十六烷胺，乙酰棕榈酸酯，甘油蓖麻醇酸酯(glycerolricinoleate)，十六烷基硬脂酸酯(hexadecyl stereate)，异丙基肉豆蔻酸酯(isopropyl myristate)，两性丙烯酸聚合物，三乙醇胺-硫酸月桂酯(triethanolamine-lauryl sulfate)，烷基-芳基硫酸酯聚乙氧基化脂肪酸酰胺，双十八烷基二甲基溴化铵，神经酰胺，鞘磷脂等。

非阳离子脂质典型地占在所述颗粒中存在的总脂质的约13mol％-约49.5mol％，约20mol％-约45mol％，约25mol％-约45mol％，约30mol％-约45mol％，约35mol％-约45mol％，约20mol％-约40mol％，约25mol％-约40mol％，或约30mol％-约40mol％。

脂质混合物的固醇成分，当存在时，可以是在脂质体、脂囊泡或脂质颗粒制备领域中方便使用的那些固醇中的任一种。优选的固醇是胆固醇。

除上述具体描述的那些之外，本发明的脂质颗粒还可以包含其它阳离子脂质，其在大约生理pH下携带净正电荷。所述阳离子脂质包括，但不限于，N，N-二油基-N，N-二甲基氯化铵(″DODAC″)；N-(2，3-二油基氧基)丙基-N，N-N-三乙基氯化铵(″DOTMA″)；N，N-二硬脂酰-N，N-二甲基溴化铵(″DDAB″)；N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(″DOTAP″)；1，2-二油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(“DOTAP.Cl”)；3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(″DC-Chol″)，N-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N-2-(精胺酰胺基)乙基)-N，N-二甲基三氟乙酸铵(″DOSPA″)，双十八烷基酰氨基甘氨酰羧基精胺(″DOGS″)，1，2-dileoyl-sn-3-磷酸乙醇胺(″DOPE″)，1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(“DODAP”)，N，N-二甲基-2，3-二油基氧基)丙胺(“DODMA”)，和N-(1，2-二肉豆蔻基氧基丙烷-3-基)-N，N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(″DMRIE″)。另外，可以使用多种商购的阳离子脂质制剂，诸如，例如，LIPOFECTIN(包括DOTMA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)，和LIPOFECTAMINE(包括DOSPA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)。在具体的实施方案中，阳离子脂质是氨基脂质。

在多个实施方案中，在本发明的脂质颗粒中包括两亲性脂质。“两亲性脂质”是指这样的任意适当的物质，其中所述脂质物质的疏水部分朝向疏水相，而亲水部分朝向水相。所述化合物包括，但不限于，磷脂，氨基脂质，和鞘脂。代表性的磷脂包括鞘磷脂，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，磷脂酸，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，或二亚油酰磷脂酰胆碱。也可以使用其它缺磷的化合物，诸如鞘脂，糖鞘脂(glycosphingolipid)家族，二酰基甘油，和β-酰氧基酸(β-acyloxyacids)。另外，所述两亲性脂质可以容易地与其它脂质如三甘油酯和固醇混合。

可设计的融合脂质也适合包含在本发明的脂质颗粒中。所述脂质颗粒几乎没有与细胞膜融合的趋向，并且当给定的信号事件发生时才递送其载运物。这允许脂质颗粒在注射到器官或疾病部位后在其开始与细胞融合之前更平均地分布。例如，信号事件可以是pH、温度、离子环境或时间的改变。在后一种情形中，融合延迟或“掩盖(cloaking)”成分，诸如ATTA-脂质缀合物或PEG-脂质缀合物，可以随时间简单地由所述脂质颗粒膜交换出来。到脂质颗粒适当地分布在体内时，其卸下充足的掩盖剂以成为融合的。关于其它信号事件，选择与疾病部位或靶细胞相关的信号，如在炎症部位增加的温度是合乎需要的。

在某些实施方案中，使用对细胞类型或组织特异性的靶向结构部分使本发明的脂质颗粒具有靶向性是合乎需要的。先前已经描述了使用多种靶向结构部分，如配体、细胞表面受体、糖蛋白、维生素(例如，核黄素)和单克隆抗体使脂质颗粒具有靶向性(参见，例如，美国专利号4,957,773和4,603,044)。靶向结构部分可以包括完整的蛋白或其片段。靶向机制通常需要靶向剂(target agent)以靶向结构部分易于与靶标如细胞表面受体相互作用的方式位于脂质颗粒的表面。在本领域中多种不同的靶向剂和方法是已知的，例如，包括记述在Sapra，P.和Allen，TM，Prog.Lipid Res.(脂质研究进展)42(5)：439-62(2003)；和Abra，RM等，J.Liposome Res.(脂质体研究杂志)12：1-3，(2002)中的那些。

已经提议了将具有亲水聚合物链如聚乙二醇(PEG)链的表面包被的脂质颗粒(即，脂质体)用于靶向(Allen，等，Biochimica et Biophysica Acta 1237：99-108(1995)；DeFrees，等，Journal of the American Chemistry Society(美国化学学会杂志)118：6101-6104(1996)；Blume，等，Biochimica et Biophysica Acta 1149：180-184(1993)；Klibanov，等，Journal of Liposome Research(脂质体研究杂志)2：321-334(1992)；美国专利号5,013556；Zalipsky，Bioconjugate Chemistry(生物缀合物化学)4：296-299(1993)；Zalipsky，FEBS Letters(FEBS通信)353：71-74(1994)；Zalipsky，在Stealth Liposomes第9章(Lasic和Martin编)CRC Press，Boca Raton Fl(1995)中。在一种方法中，用于使脂质颗粒具有靶向性的配体如抗体与形成所述脂质颗粒的脂质的极性首基连接。在另一种方法中，将靶向配体附着到形成亲水聚合物包被的PEG链的远端(Klibanov，等，Journal of Liposome Research(脂质体研究杂志)2：321-334(1992)；Kirpotin等，FEBS Letters(FEBS通信)388：115-118(1996))。

可以使用用于偶联靶向剂的标准方法。例如，可以使用磷脂酰乙醇胺，其可以被激活用于附着靶向剂，或使用衍生的亲脂性化合物，诸如脂质衍生的博来霉素。例如，可以使用结合蛋白质A的脂质体来构建抗体靶向的脂质体(参见，Renneisen，等，J.Bio.Chem.(生物化学杂志)，265：16337-16342(1990)和Leonetti，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(美国国家科学院学报)，87：2448-2451(1990)。抗体缀合的其它实例公开在美国专利号6,027,726中，其教导通过引用结合于此。靶向结构部分的实例还包括其它对细胞成分特异的蛋白质，包括与赘生物或肿瘤相缔合的抗原。用作靶向结构部分的蛋白质可以通过共价键附着到脂质体上(参见，Heath，Covalent Attachment of Proteins to Liposomes(蛋白质与脂质体的共价附着)，149 Methods in Enzymology(149种酶学方法)111-119(Academic Press，Inc.1987))。其它靶向方法包括生物素-抗生物素蛋白系统。

在一个示例性的实施方案中，所述脂质颗粒包含本发明的氨基脂质、中性脂质(除氨基脂质外)、固醇(例如，胆固醇)和PEG-修饰的脂质(例如，PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA)的混合物。在某些实施方案中，所述脂质混合物由本发明的氨基脂质、中性脂质、胆固醇和PEG-修饰的脂质组成或基本上由这些组成。在特别优选的实施方案中，所述脂质颗粒由以约20-70％氨基脂质∶5-45％中性脂质∶20-55％胆固醇∶0.5-15％PEG-修饰的脂质的摩尔比率的上述混合物组成或基本上由这些组成。

在具体的实施方案中，所述脂质颗粒由DLin-K-C2-DMA，DSPC，Chol，和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA三者中的任一种组成或基本上由这些组成，例如，其摩尔比率为约20-60％DLin-K-C2-DMA∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA。

在具体的实施方案中，摩尔脂质比率约为40/10/40/10(mol％DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG或DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-C-DOMG或DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMA)或35/15/40/10mol％DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG或DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-C-DOMG或DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMA。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被替换为POPC，DOPE或SM。

在具体的实施方案中，所述脂质颗粒由DLin-K²-DMA，DSPC，Chol，和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA这三者中的任一种组成或基本上由这些组成，例如，其摩尔比率为约20-60％DLin-K²-DMA∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA。在具体的实施方案中，摩尔脂质比率约为40/10/40/10(mol％DLin-K²-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG或DLin-K²-DMA/DSPC/Chol/PEG-C-DOMG或DLin-K²-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMA)或35/15/40/10mol％DLin-K²-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG或DLin-K²-DMA/DSPC/Chol/PEG-C-DOMG或DLin-K²-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMA。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被替换为POPC，DOPE或SM。

在具体的实施方案中，所述脂质颗粒由DLin-K6-DMA，DSPC，Chol，和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA这三者中的任一种组成或基本上由这些组成，例如，其摩尔比率为约20-60％DLin-K6-DMA∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA。在具体的实施方案中，摩尔脂质比率约为40/10/40/10(mol％DLin-K6-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG或DLin-K6-DMA/DSPC/Chol/PEG-C-DOMG或DLin-K6-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMA)或35/15/40/10mol％DLin-K6-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG或DLin-K6-DMA/DSPC/Chol/PEG-C-DOMG或DLin-K6-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMA。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被替换为POPC，DOPE或SM。

C.治疗剂-脂质颗粒组合物和制剂

本发明包括包含本发明的脂质颗粒和活性剂的组合物，其中所述活性剂与所述脂质颗粒相缔合。在具体的实施方案中，所述活性剂是治疗剂。在具体的实施方案中，所述活性剂包封在所述脂质颗粒的水性内部。在其它实施方案中，所述活性剂存在于该脂质颗粒的一个或多个脂质层中。在其它实施方案中，所述活性剂与脂质颗粒的外部或内部脂质表面结合。

当用于本文时，“完全包封”是指在颗粒中的核酸在暴露于血清或显著降解游离核酸的核酸酶测定后不被显著地降解。在完全包封的系统中，在通常降解100％的游离核酸的处理中，优选少于25％的颗粒核酸被降解，更优选少于10％，最优选少于5％的颗粒核酸被降解。备选地，完全包封可以通过Oligreen 测定来确定。Oligreen 是一种超敏荧光核酸染料(可从Invitrogen Corporation(Invitrogen公司)，Carlsbad，CA获得)，用于定量溶液中的寡核苷酸和单链DNA或RNA。完全包封还表示所述颗粒是血清稳定性的，即，它们在体内施用时不会迅速分解成它们的成分部分。

活性剂，当用于本文时，包括能够对细胞、组织、器官、或受试者表现出需要的作用的任何分子或化合物。例如，所述作用可以是生物学的、生理学的、或化妆用的作用。活性剂可以是任何类型的分子或化合物，包括，例如，核酸，肽和多肽，其包括，例如，抗体，诸如，例如，多克隆抗体，单克隆抗体，抗体片段；人源化抗体，重组抗体，重组人抗体，和Primatized^TM抗体，细胞因子，生长因子，凋亡因子，分化诱导因子，细胞表面受体及其配体；激素；和小分子，包括小的有机分子或化合物。

在一个实施方案中，所述活性剂是治疗剂，或其盐或衍生物。治疗剂衍生物可以本身是有治疗活性的，或者其可以是前体药物，其在进一步修饰后变成活性的。因此，在一个实施方案中，与未修饰的试剂相比，治疗剂衍生物保留一些或全部的治疗活性，而在另一个实施方案中，治疗剂衍生物缺乏治疗活性。

在不同的实施方案中，治疗剂包括任何治疗有效的试剂或药物，诸如消炎化合物，抗抑郁药，刺激药，止痛药，抗生素，节制生育用药，退热药，血管舒张药，抗血管发生药，细胞血管剂(cytovascular agents)，信号转导抑制剂，心血管药，例如，抗心律不齐剂，血管收缩药，激素和类固醇。

在某些实施方案中，所述治疗剂是肿瘤药，其也可以称为抗肿瘤药(anti-tumor drug)，抗癌药，肿瘤药，抗肿瘤剂(antineoplastic agent)等。按照本发明可以使用的肿瘤药的实例包括，但不限于，阿霉素(adriamycin)，爱克兰(alkeran)，别嘌醇(allopurinol)，六甲蜜胺(altretamine)，氨磷汀(amifostine)，阿那曲唑(anastrozole)，araC，三氧化砷(arsenic trioxide)，硫唑嘌呤(azathioprine)，贝沙罗汀(bexarotene)，biCNU，博来霉素(bleomycin)，白消安静脉内用药(busulfan intravenous)，白消安口服用药(busulfan oral)，卡培他滨(capecitabine)(Xeloda)，卡铂(carboplatin)，卡莫司汀(carmustine)，CCNU，塞来考昔(celecoxib)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，顺铂(cisplatin)，克拉屈滨(cladribine)，环孢素A(cyclosporin A)，阿糖胞苷(cytarabine)，胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)，柔红霉素(daunorubicin)，环磷酰胺(cytoxan)，柔红霉素(daunorubicin)，地塞米松(dexamethasone)，右雷佐生(dexrazoxane)，dodetaxel，多柔比星(doxorubicin)，多柔比星(doxorubicin)，DTIC，表柔比星(epirubicin)，雌莫司汀(estramustine)，磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)，依托泊苷和VP-16，依西美坦(exemestane)，FK506，氟达拉滨(fludarabine)，氟尿嘧啶(fluorouracil)，5-FU，吉西他滨(gemcitabine)(Gemzar)，吉妥珠单抗-奥佐米星(gemtuzumab-ozogamicin)，乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)，羟基脲胶囊剂(hydrea)，羟基脲(hydroxyurea)，伊达比星(idarubicin)，异环磷酰胺(ifosfamide)，甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)，干扰素(interferon)，伊立替康(irinotecan)(Camptostar，CPT-111)，来曲唑(letrozole)，亚叶酸(leucovorin)，克拉屈滨注射剂(leustatin)，亮丙立德(leuprolide)，左旋咪唑(levamisole)，litretinoin，甲地孕酮(megastrol)，美法仑(melphalan)，L-PAM，美司钠(mesna)，甲氨喋呤(methotrexate)，甲氧沙林(methoxsalen)，光辉霉素(mithramycin)，丝裂霉素(mitomycin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，氮芥(nitrogen mustard)，紫杉醇(paclitaxel)，帕米膦酸盐(pamidronate)，培加酶(Pegademase)，喷司他丁(pentostatin)，卟吩姆钠(porfimer sodium)，泼尼松(prednisone)，美罗华(rituxan)，链佐星(streptozocin)，STI-571，他莫昔芬(tamoxifen)，泰索帝(taxotere)，temozolamide，替尼泊苷(teniposide)，VM-26，托泊替康(topotecan)(Hycamtin)，托瑞米芬(toremifene)，维甲酸(tretinoin)，ATRA，戊柔比星(valrubicin)，硫酸长春碱制剂(velban)，长春碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)，VP16，和长春瑞滨(vinorelbine)。按照本发明可以使用的肿瘤药的其它实例是玫瑰树碱(ellipticin)和玫瑰树碱类似物或衍生物，埃坡霉素(epothilones)，细胞内激酶抑制剂和喜树碱(camptothecins)。

1.核酸-脂质颗粒

在某些实施方案中，本发明的脂质颗粒与核酸缔合，形成核酸-脂质颗粒。在具体的实施方案中，所述核酸部分或完全包封在所述脂质颗粒中。当用于本文时，术语“核酸”意指包括任何寡核苷酸或多核苷酸。含有多至50个核苷酸的片段一般称为寡核苷酸，并且较长的片段称为多核苷酸。在具体的实施方案中，本发明的寡核苷酸长度为20-50个核苷酸。

在本发明的情形中，术语“多核苷酸”和″寡核苷酸″是指核苷酸或核苷单体的聚合物或低聚物，其由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)连接组成。术语“多核苷酸”和″寡核苷酸″还包括包含功能相似的非天然存在的单体、或其部分的聚合物或低聚物。所述修饰的或取代的寡核苷酸通常比天然形式优选，因为其具有这样的特性，诸如例如，提高的细胞摄入和在存在核酸酶条件下提高的稳定性。

寡核苷酸分类为脱氧核糖寡核苷酸或核糖寡核苷酸。脱氧核糖寡核苷酸由称为脱氧核糖的5-碳糖组成，该5-碳糖在该糖的5′和3′碳与磷酸共价连接以形成交互的、不分支的聚合物。核糖寡核苷酸由相似的重复结构组成，其中所述5-碳糖是核糖。

在本发明所述的脂质-核酸颗粒中存在的核酸包括已知的任何形式的核酸。本文所用的核酸可以是单链DNA或RNA，或双链DNA或RNA，或DNA-RNA杂合体。双链DNA的实例包括结构基因，包含控制和终止区的基因，和自我复制系统如病毒或质粒DNA。双链DNA的实例包括siRNA和其它RNA干扰试剂。单链核酸包括，例如，反义寡核苷酸，核酶，微小RNA，和形成三股螺旋的寡核苷酸。

本发明的核酸可以是各种长度的，这通常取决于核酸的具体形式。例如，在具体的实施方案中，质粒或基因长度可以为约1,000至100,000个核苷酸残基。在具体的实施方案中，寡核苷酸长度可以在约10至100个核苷酸的范围内。在不同的相关实施方案中，单链的，双链的，和三链的寡核苷酸，长度可以在约10至约50个核苷酸的范围内，长度在约20至约50个核苷酸范围内，约15至约30个核苷酸范围内，约20至约30个核苷酸范围内。

在具体的实施方案中，本发明的寡核苷酸(或其链)与靶多核苷酸特异性杂交或与其互补。“可特异性杂交”和“互补”是用来指示足以在DNA或RNA靶标和寡核苷酸之间发生稳定的和特异性结合的互补程度的术语。应该理解，寡核苷酸不必与其可特异性杂交的靶核酸序列是100％互补的。当寡核苷酸与靶标的结合干扰该靶标分子的正常功能而引起其用途或表达的丧失时，并且存在充分的互补程度，以在需要特异性结合的条件下，即，在体内测定或治疗性治疗的情形中的生理条件下，或在体外测定的情形中在进行测定的条件下，足以避免该寡核苷酸与非靶标序列之间的非特异性结合，则所述寡核苷酸是可特异性杂交的。因此，在其它实施方案中，与该寡核苷酸所靶向或特异性杂交的基因或mRNA序列的区域相比较，该寡核苷酸包括1、2或3个碱基取代。

RNA干扰核酸

在具体的实施方案中，本发明的核酸-脂质颗粒与RNA干扰(RNAi)分子缔合。使用RNAi分子的RNA干扰方法可以用来破坏目的基因或多核苷酸

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