IPC分类号 : C07G5/00I,A61K36/28I,A61P39/06I,A23K20/10I,A23L33/105I
专利摘要
专利摘要
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及长裂苦苣菜生物碱初级分离物及其分离方法和应用。本发明通过超声方法长裂苦苣菜提取其中的生物碱成分，并利用制备色谱分离得到若干具有抗氧化能力的初级分离物，对长裂苦苣菜中生物碱类化合物的开发利用具有重要的现实意义。
权利要求
1.长裂苦苣菜生物碱初级分离物，其特征在于，所述初级分离物由包括以下步骤的方法制备得到：
(1)制备长裂苦苣菜提取物，长裂苦苣菜提取物由包括以下步骤的方法制备得到：
以75％乙醇为溶剂，将长裂苦苣菜制成液料比为30mL/g的提取溶液，调节提取溶液的pH为5，进行超声提取，超声提取的功率为700W，温度为55℃，超声时间为30min，超声提取后，静置，取上清液，旋转蒸发后冷却干燥即得；
(2)采用制备色谱法分离步骤(1)得到的长裂苦苣菜提取物，具体条件如下：
采用C18硅胶柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速10mL/min，柱温27-33℃，波长为255-265nm，梯度洗脱程序为：
在0-5min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为60％，流动相B的体积由5％变为40％；
在5-15min的时间范围内，流动相A的体积由60％变为30％，流动相B的体积由40％变为70％；
在15-30min的时间范围内，流动相A的体积由30％变为20％，流动相B的体积由70％变为80％；
在30-35min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％；
收集峰高范围在420-2000mAU的馏分即得。
2.根据权利要求1所述的长裂苦苣菜生物碱初级分离物，其特征在于，步骤(2)中，柱温为30℃，波长为260nm。
3.长裂苦苣菜生物碱初级分离物的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括以下步骤：
(1)制备长裂苦苣菜提取物，长裂苦苣菜提取物由包括以下步骤的方法制备得到：
以75％乙醇为溶剂，将长裂苦苣菜制成液料比为30mL/g的提取溶液，调节提取溶液的pH为5，进行超声提取，超声提取的功率为700W，温度为55℃，超声时间为30min，超声提取后，静置，取上清液，旋转蒸发后冷却干燥即得；
(2)采用制备色谱法分离步骤(1)得到的长裂苦苣菜提取物，具体条件如下：
采用C18硅胶柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速10mL/min，柱温27-33℃，波长为255-265nm，梯度洗脱程序为：
在0-5min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为60％，流动相B的体积由5％变为40％；
在5-15min的时间范围内，流动相A的体积由60％变为30％，流动相B的体积由40％变为70％；
在15-30min的时间范围内，流动相A的体积由30％变为20％，流动相B的体积由70％变为80％；
在30-35min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％；收集峰高范围在420-2000mAU的馏分即得。
4.根据权利要求3所述的长裂苦苣菜生物碱初级分离物的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，柱温为30℃，波长为260nm。
5.根据权利要求1所述的长裂苦苣菜生物碱初级分离物用于制备抗氧化制剂的应用。
说明书
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及长裂苦苣菜生物碱初级分离物及其分离方法和应用。
背景技术
长裂苦苣菜(Sonchus brachyotus DC.)系菊科苦苣菜属一年生草本植物，又名苦菜、苦曲菜、苦曲曲、苦苣菜、苣荬菜、苦荬菜等。长裂苦苣菜药用历史悠久，据我国最早的医学专著《神农本草经》和李时珍的《本草纲目》记载，其味苦性寒，有清热解毒，消肿排脓，凉血化瘀，清肺止咳，益肝利尿，消食和胃之功效，用以治疗急性痢疾、肠炎、痔疮肿痛等症。长裂苦苣菜中的化学成分有β-谷甾醇，木犀草素，芹菜素和槲皮素，还有一些挥发油成分，研究表明，长裂苦苣菜具有抗菌、将血压、降胆固醇、抗肿瘤、治疗肝炎和抗氧化等多方面作用。但迄今为止，长裂苦苣菜中有效的抗氧化活性成分尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长裂苦苣菜生物碱初级分离物。
本发明的再一目的在于提供上述初级分离物的分离方法。
本发明的再一目的在于提供上述初级分离物的应用。
根据本发明具体实施方式的长裂苦苣菜生物碱初级分离物，其由包括以下步骤的方法制备得到：
(1)制备长裂苦苣菜提取物；
(2)采用制备色谱法分离步骤(1)得到的长裂苦苣菜提取物，具体条件如下：
采用C18色谱柱，以0.1％甲酸-水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速10mL/min，柱温27-33℃，波长为255-265nm，梯度洗脱程序为在0-5min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为60％，流动相B的体积由5％变为40％；在5-15min的时间范围内，流动相A的体积由60％变为30％，流动相B的体积由40％变为70％；在15-30min的时间范围内，流动相A的体积由30％变为20％，流动相B的体积由70％变为80％；在30-35min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％；收集峰高范围在420-2000mAU的馏分即得。
在反相色谱柱中，长裂苦苣菜生物碱提取物流出色谱柱的顺序是极性较强的组分先于极性弱的组分被洗脱出来，也就是说长裂苦苣菜生物碱提取物流出色谱柱的顺序受流动相极性的影响。同时，不同的流动相组成、梯度程序、流速、柱温等都会导致流动相的极性发生变化，进而导致馏分中有效成分的组成不同。
本发明采用C18色谱柱分离生物碱，可在高pH条件下分离得到峰形良好、不拖尾的色谱峰，不但具有极高的载样量，而且可以保持高界面动力学系数，获得较好的柱效。
根据本发明具体实施方式的长裂苦苣菜生物碱初级分离物，步骤(2)中，柱温为30℃，波长为260nm。
根据本发明具体实施方式的长裂苦苣菜生物碱初级分离物，长裂苦苣菜提取物由包括以下步骤的方法制备得到：
以75％乙醇为溶剂，将长裂苦苣菜制成液料比为30mL/g的提取溶液，进行超声提取，超声提取后，静置，取上清液即得。
根据本发明具体实施方式的长裂苦苣菜生物碱初级分离物，超声提取的功率为700W，温度为55℃，超声时间为30min。
根据本发明具体实施方式的长裂苦苣菜生物碱初级分离物的分离方法，所述分离方法包括以下步骤：
(1)制备长裂苦苣菜提取物；
(2)采用制备色谱法分离步骤(1)得到的长裂苦苣菜提取物，具体条件如下：
采用C18色谱柱，以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流速10mL/min，柱温27-33℃，波长为255-265nm，梯度洗脱程序为在0-5min的时间范围内，流动相A的体积由95％变为60％，流动相B的体积由5％变为40％；在5-15min的时间范围内，流动相A的体积由60％变为30％，流动相B的体积由40％变为70％；在15-30min的时间范围内，流动相A的体积由30％变为20％，流动相B的体积由70％变为80％；在30-35min的时间范围内，流动相A的体积保持为20％，流动相B的体积保持为80％；收集峰高范围在420-2000mAU的馏分即得。
根据本发明具体实施方式的长裂苦苣菜生物碱初级分离物的分离方法，步骤(2)中，柱温为30℃，波长为260nm。
根据本发明具体实施方式的长裂苦苣菜生物碱初级分离物的分离方法，长裂苦苣菜提取物由包括以下步骤的方法制备得到：
以75％乙醇为溶剂，将长裂苦苣菜制成液料比为30mL/g的提取溶液，进行超声提取，超声提取后，静置，取上清液，进行旋转蒸发后冷却干燥，即得。
根据本发明具体实施方式的长裂苦苣菜生物碱初级分离物的分离方法，超声提取的功率为700W，温度为55℃，超声时间为30min。
本发明的有益效果：
本发明确定了长裂苦苣菜生物碱的提取工艺，其对长裂苦苣菜生物碱的提取率可达到20.30％。通过制备色谱法分离得到多个初级馏分，确定长裂苦苣菜生物碱初级分离物具有较强的抗氧化性能，为开发和生产新型抗氧化食品或饲料添加剂提供了可靠的理论及技术支撑。
附图说明
图1显示H2O2对Caco-2细胞存活率的影响；
图2显示长裂苦苣菜生物碱提取物对H2O2损伤Caco-2细胞存活率的影响；
图3显示长裂苦苣菜生物碱提取物的总抗氧化能力；
图4显示长裂苦苣菜生物碱提取物对ABTS自由基的清除能力；
图5显示长裂苦苣菜生物碱提取物对DPPH自由基的清除能力；
图6显示长裂苦苣菜生物碱提取物对羟基自由基的清除能力；
图7显示长裂苦苣菜生物碱提取物对超氧阴离子的清除能力；
图8显示长裂苦苣菜生物碱提取物的总还原能力；
图9显示长裂苦苣菜生物碱提取物对斑马鱼肠道组织ROS的影响情况；
图10显示长裂苦苣菜生物碱提取物对斑马鱼肠道组织SOD的影响情况；
图11显示长裂苦苣菜生物碱提取物对斑马鱼肠道组织MDA的影响情况；
图12显示长裂苦苣菜生物碱提取物对斑马鱼肠道组织CAT的影响情况；
图13显示长裂苦苣菜提取物的制备型HPLC分离情况；
图14显示长裂苦苣菜生物碱提取物与馏分对H2O2损伤Caco-2细胞存活率的影响情况；
图15显示一级馏分的总抗氧化能力；
图16显示一级馏分对ABTS自由基的清除能力；
图17显示一级馏分对DPPH自由基的清除能力；
图18显示一级馏分对羟基自由基的清除能力；
图19显示一级馏分对超氧阴离子的清除能力；
图20显示一级馏分的总还原能力。
具体实施方式
实施例1制备长裂苦苣菜生物碱提取物
长裂苦苣菜清洗后于40℃烘箱烘至恒重，然后用微型植物粉碎机将长裂苦苣菜粉碎，过60目的分析筛。称取10g长裂苦苣菜全草粗粉置于500mL的超声杯中，加入75％乙醇，得到液料比为30mL/g的提取溶液，调节提取溶剂pH值为5，进行超声提取，超声温度为55℃，超声功率为700W，超声时间为30min。
超声提取后，5000rpm，离心10min，获得上清液，40℃旋转蒸发，冷冻干燥，获得长裂苦苣菜生物碱提取物，备用。
生物碱为含氮的有机化合物，且生物碱类化合物有似碱的性质。生物碱的母核结构具有多种，例如有吡咯类生物碱、吡咯类生物碱、吡咯类生物碱、莨菪烷类生物碱(茄科生物碱)、莨菪烷类生物碱(茄科生物碱)、莨菪烷类生物碱(茄科生物碱)、莨菪烷类生物碱(茄科生物碱)等。
取0.1mL的提取液置于1mL比色管中，用一定浓度的乙醇定容至刻度，以相对应的乙醇浓度为空白，并在410nm处测定提取液吸光值，根据标准曲线测长裂苦苣菜中生物碱的提取率，提取率＝(样品中生物碱的重量/药材重量)×100％。
本发明的生物碱提取率为20.30％。
实施例2验证长裂苦苣菜生物碱提取物的抗氧化能力
2.1 H2O2建立诱导Caco-2细胞氧化损伤模型的
通过考察H2O2在不同浓度(100，250，500，750，1000，2500，5000，7500，10000μmol/L)下对Caco-2细胞作用24h以后，观察其对细胞存活率的影响，确定H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤模型，结果如图1所示。
由图1可知，H2O2浓度在100-5000μmol/L时对细胞存活率没有显著性影响，7500μmol/L时细胞存活率下降约40％，而高浓度的H2O2导致Caco-2细胞存活率明显下降，细胞数量明显减少，经10000μmol/L H2O2处理的细胞存活率下降约60％，确定适宜的H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤模型的H2O2浓度为7500μmol/L。
2.2长裂苦苣菜生物碱提取物对H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型的修复作用
使用浓度：200μg/mL长裂苦苣菜生物碱提取物对H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型的修复作用，结果如图2所示。
结果显示，其细胞存活率为71％，而H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤后，其细胞存活率为56％，因此，长裂苦苣菜生物碱提取物对H2O2诱导Caco-2细胞氧化损伤模型具有修复作用。
2.3长裂苦苣菜生物碱提取物的抗氧化作用
(1)长裂苦苣菜生物碱提取物的总抗氧化能力
称取27.8mg FeSO4·7H2O，溶解并定容到1mL，此时浓度即为100mM。取适量100mMFeSO4溶液稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM。使用蒸馏水或样品配制溶液配制标准品。
a：96孔板的每个检测孔中加入180μL FRAP工作液(TPTZ稀释液150μL+TPTZ溶液15μL+检测缓冲液15μL)。
b：空白对照孔中加入5μL蒸馏水或PBS等适当溶液；标准曲线检测孔内加入5μL各种浓度的FeSO4标准溶液；样品检测孔内加入5μL各种样品或0.15-1.5mM的Trolox作为阳性对照。轻轻混匀。
c：37℃孵育3-5min后测定A593。测得FeSO4标准曲线为y＝0.3119x+0.0526，R
根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力(TAC)。如图3所示，与浓度为0.07mmol/g的control相比，浓度为200μg/mL长裂苦苣菜生物碱提取物的总抗氧化能力为0.89mmol/g，大约是control的12倍，但与浓度6.66mmol/g阳性对照Trolox相比，Trolox的总抗氧化能力大约是长裂苦苣菜生物碱提取物的7倍。
(2)长裂苦苣菜生物碱提取物对ABTS自由基的清除能力
7mmol/L ABTS(2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonie acid)diamm-onium salt，ABTS)与2.45mmol/L过硫酸钾以9:1比例混合室温下静置16h，使用前稀释八倍作为ABTS储备液。一系列浓度范围(1.6-1000μg/mL，无水乙醇溶解)样品中分别加入2.5mL ABTS储备液，混匀后避光反应20min并于波长734nm处测定吸光值。以1mL双蒸水加ABTS待用混合液作为空白对照，BHT(butylatedhydoxytoluene)作为阳性对照。
ABTS清除率(％)＝[(A1-A2)/A1]×100％，其中，A1表示空白对照的吸光度，A2表示待测样品ABTS吸光度。
由图4可知，当长裂苦苣菜生物碱提取物的浓度为25μg/mL时，其清除率为20％，然而当其浓度为200μg/mL时，其清除率大约为79.09％，大约是低浓度对ABTS自由基的清除率的4倍。
(3)长裂苦苣菜生物碱提取物对DPPH自由基的清除能力
一定浓度范围(1.6-1000μg/mL，无水乙醇溶解)的样品，各取样品0.3mL，分别加入2.7mL，0.2mmol/L的DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)(用无水乙醇溶解)，涡旋混匀，将配好的样品避光静置1h后在517nm处测其吸光度。以1mL无水乙醇代替提取物作为空白对照，同样浓度范围的BHT作为阳性对照。
DPPH清除率(％)＝[(A1-A2)/A1]×100％，其中，A1表示空白对照的吸光度，A2表示待测样品DPPH吸光度。
如图5所示，当长裂苦苣菜生物碱提取物浓度为25μg/mL时，其清除率为3.6％，然而当其浓度为200μg/mL时，其清除率大约为32.6％，大约是低浓度对DPPH自由基的清除率的9倍。
(4)长裂苦苣菜生物碱提取物对羟基自由基的清除能力
采用Fe
反应体系中分别加入10mmol/L的2-脱氧核糖400μL，氯化铁(10mmol/L)100μL，EDTA-2Na(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt)(1mmol/L)100μL，30％过氧化氢(10mmol/L)100μL，样品浓度(1.6-1000μg/mL)100μL，再加入抗坏血酸(1mmol/L)200μL引发反应，在37℃下反应1h，加入0.5％TBA的氢氧化钠(0.025mol/L)溶液1mL和30％TCA(trichloroacetic acid)水溶液1mL，混合物80℃水浴加热30min，冷却。在532nm处测定吸光值，以0.05mol/L PBS(phosphate buffered solution)(pH值7.4)在反应体系中代替样品作为空白对照测得吸光值，计算清除率，同浓度范围的BHT作为阳性对照。
羟基自由基清除率(％)＝[(A1-A2)/A1]×100％，其中，A1表示空白对照的吸光度，A2表示待测样品的吸光度。
如图6所示，当长裂苦苣菜生物碱提取物浓度为25μg/mL时，其清除率为10.3％，然而当其浓度为200μg/mL时，其清除率大约为63.9％，大约是低浓度对羟基自由基的清除率的6倍。
(5)长裂苦苣菜生物碱提取物对超氧阴离子的清除能力
超氧阴离子是体内最常见的自由基之一。焦性没食子酸在碱性环境中自发产生超氧阴离子。其自氧化的速率与超氧阴离子的浓度相关。待测物可清除超氧阴离子能力而减缓焦性没食子酸自氧化的速率。
200μg/mL待测样品1mL加入Tris-HCl缓冲液(pH值8.2，0.05mol/L)4.5mL在25℃下反应10min加入0.003mol/L邻苯三酚(10mmol/L盐酸溶解)600μL，充分反应后立即在波长325nm处测定吸光度，每隔30s测定一次吸光度，直至吸光值不在发生明显的变化，用10mmol/L盐酸代替样品作为空白对照，BHT作阳性对照。邻苯三酚的自氧化速率可以根据吸光度-时间曲线计算斜率。
如图7所示，与BHT相比，长裂苦苣菜生物碱提取物对超氧阴离子具有清除能力，其自氧化速率被减缓。
(6)长裂苦苣菜生物碱提取物的总还原能力
采用铁还原抗氧化能力法测定生物碱的总还原能力，在酸性环境下Fe
取待测样品20mg配制成400μg/mL样品溶液，分别取50，100，150，200，250，300，350，400，450，500μL样品溶液，加双蒸水至1mL，分别加0.2mol/L PBS(pH值6.6)和1％K3[Fe(CN)6]各2.5mL，在50℃下反应20min，再加入10％TCA2.5mL，3000r/min(r＝3cm)离心10min，取上清液2.5mL加入双蒸水2.5mL，加入0.1％氯化铁0.5mL混合，10min后在700nm处测定其吸光值A2，以不加样品的双蒸水同法操作作为空白对照测得其吸光值，增加的吸光值表示还原能力的增加。
如图8所示，当长裂苦苣菜生物碱提取物浓度为20μg/mL时，其增加的吸光值为0.006，然而当其浓度为200μg/mL时，其增加的吸光值为0.046，大约是低浓度的总还原能力的7倍。
(7)长裂苦苣菜生物碱提取物的体内抗氧化效果
用0.2％的噁唑酮(Oxazolone)注射斑马鱼诱导斑马鱼肠道损伤1天，用含有不同浓度长裂苦苣菜生物碱提取物的鱼饲料饲喂斑马鱼5天。
结果如图9-12所示，长裂苦苣菜生物碱提取物可以有效的降低斑马鱼肠道组织ROS、MDA含量，提高SOD和CAT活力。
综上，长裂苦苣菜生物碱提取物在体外和体内均具有良好的抗氧化作用。
实施例3分离长裂苦苣菜生物碱一级馏分
3.1长裂苦苣菜生物碱一级馏分
供试液的制备：将长裂苦苣菜生物碱提取物用超纯水溶解，配置成浓度为100mg/mL的供试液，过0.22μm的滤膜，备用。
分离长裂苦苣菜生物碱一级馏分的色谱条件：
利用HPLC制备色谱将长裂苦苣菜生物碱提取物在Durashell C18(L)(10μm， 30×250mm)柱上进行分馏，长裂苦苣菜生物碱一级馏分制备色谱条件：色谱柱：DurashellC18(L)(10μm， 30×250mm)，流动相为0.1％甲酸-水(A)-甲醇(B)系统，流速10mL/min，柱温30℃，波长为260nm。梯度洗脱程序为0-5min，5％-40％B，5-15min，40％-70％B，15-30min，70％-80％B，30-35min，80％-80％B,上样量为18mL。
根据长裂苦苣菜生物碱提取物在制备色谱中的色谱峰情况，将长裂苦苣菜生物碱提取物分成6个馏分SB1(S.brachyotus 1)，SB2，SB3，SB4，SB5和SB6，如图13所示，其中，SB1峰高范围2-570mAU，SB2峰高范围530-750mAU，吸光值范围，SB3峰峰高范围420-2000mAU，SB4峰高范围1200-2010mAU，SB5峰高范围360-2010mAU，SB6峰高范围70-740mAU。
3.2长裂苦苣菜生物碱一级馏分对H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型的修复作用
分别考察馏分SB1，SB2，SB3，SB4，SB5和SB6(浓度：200μg/mL)对H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型的修复作用。
结果如图14示，其细胞存活率分别为76％，74％，114％，106％，94％，75％，因此，SB3对H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型的修复作用效果显著。
3.3长裂苦苣菜生物碱一级馏分的抗氧化作用
(1)长裂苦苣菜生物碱一级馏分的总抗氧化能力
检测方法同实施例2。
由图15可知，control，Trolox，提取物，SB1-SB6的总抗氧化能力分别为0.07、6.66、0.89、0.09、0.21、1.98、0.92、0.89、0.28mmol/g，从这些数据中可知，SB3的总抗氧化能力相对较高，SB3的总抗氧化能力大约是control，Trolox，提取物，SB1，SB2，SB4-SB6的28、0.3、2、22、9、2、2、7倍，因此，长裂苦苣菜生物碱一级馏分中的SB3的抗氧化能力较强。
(2)长裂苦苣菜生物碱一级馏分对ABTS自由基的清除能力
检测方法同实施例2。
如图16所示，当SB1-SB6的浓度为1.6μg/mL时，其对ABTS自由基的清除率分别为1.61％、3.64％、15.99％、19.43％、7.69％、8.5％，而当其浓度为1000μg/mL时，其清除率分别为31.58％、65.79％、74.29％、74.09％、55.47％、46.96％，大约是低浓度对ABTS自由基的清除率的20、18、5、4、7、6倍，由于一级馏分药物浓度相同，SB1和SB2对ABTS自由基的清除率的变化相对较大，当SB3和SB4的浓度最高时，其对ABTS自由基的清除率相对较高，而当SB4的浓度为40μg/mL时，其清除率高于BHT，而其他的一级馏分对ABTS自由基的清除率均低于BHT。
(3)长裂苦苣菜生物碱一级馏分对DPPH自由基的清除能力
检测方法同实施例2。
如图17所示，当SB1-SB6的浓度为1.6μg/mL时，其对DPPH自由基的清除率分别为8.29％、11.82％、14.11％、14.81％、3.35％、1.23％，而当其浓度为1000μg/mL时，其清除率分别为48.85％、51.32％、73.55％、74.25％、58.55％、49.38％，大约是低浓度对DPPH自由基的清除率的5、4、5、5、17、40倍，由于药物浓度相同，SB5和SB6对DPPH自由基的清除率的变化相对较大，当SB3和SB4的浓度为最大时，其对DPPH自由基的清除率相对较高，而当SB2-SB4的浓度为1.6μg/mL时，其清除率高于BHT，而当一级馏分为其他浓度时，其清除率均低于BHT。
(4)长裂苦苣菜生物碱一级馏分对羟基自由基的清除能力
检测方法同实施例2。
如图18所示，当SB1-SB6的浓度为1.6μg/mL时，其对羟基自由基的清除率分别为6.85％、10.37％、27.77％、21.44％、20.39％、18.1％，而当其浓度为1000μg/mL时，其清除率分别为69.07％、70.83％、77.15％、76.45％、71.18％、70.12％，大约是低浓度对羟基自由基的清除率的10、7、3、4、3、4倍，由于药物浓度相同，SB1-SB6对羟基自由基的清除率的变化不太显著，当SB3和SB4的浓度为最大时，其对羟基自由基的清除率相对较高，SB3(当浓度为1.6、8、40、200μg/mL时)，SB4(当浓度为1.6、8μg/mL时)，SB5(当浓度为1.6μg/mL时)和SB6(当浓度为1.6μg/mL时)对羟基自由基的清除率明显高于BHT，而其他一级馏分的清除率则低于BHT。
(5)长裂苦苣菜生物碱一级馏分对超氧阴离子的清除能力
检测方法同实施例2。
如图19所示，与BHT相比，长裂苦苣菜生物碱一级馏分SB1-SB6对超氧阴离子具有清除能力，SB2，SB3和SB4的自氧化速率减缓显著。
(6)长裂苦苣菜生物碱一级馏分的总还原能力
如图20所示，当SB1-SB6的浓度为20μg/mL时，其增加的吸光值分别为0、0、0.014、0.001、0.022、0.019，而当其浓度为200μg/mL时，其增加的吸光值分别为0.013、0.014、0.131、0.075、0.090、0.078，大约是低浓度的总还原能力的51、54、10、100、4、4倍，由于药物浓度相同，SB1，SB2和SB4的总还原能力变化比较明显，SB3，SB5和SB6的总还原能力变化不太明显，但SB3的总还原能力明显高于其他馏分，其总还原能力却低于BHT。
综上，其检测结果与检测细胞存活率的结果一致，因此，长裂苦苣菜生物碱一级馏分中SB 3的抗氧化活性较强。
长裂苦苣菜生物碱初级分离物及其分离方法和应用专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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