专利摘要

专利摘要

本发明提供了用于提高细胞中的I型干扰素(IFN)的产生的方法和组合物。所述方法的方面包括以足以提高细胞产生所述I型干扰素(IFN)的方式提高所述细胞中的包含2ˊ-5ˊ磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。还提供了用于实施该方法的实施方案的组合物和药剂盒。

权利要求

1.一种用于提高细胞中I型干扰素(IFN)的产生的方法，所述方法包括：

以足以提高所述细胞产生所述I型干扰素(IFN)的方式提高所述细胞中的包含2'-5'磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括使所述细胞与所述环状二核苷酸接触。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含两个2'-5'磷酸二酯键。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含2'5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。

8.如权利要求1所述的方法，其中通过提高所述细胞中的cGAMP合酶(cGAS)的活性来提高所述环状二核苷酸的水平。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IFN是干扰素α或干扰素β。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。

12.一种环状二核苷酸，其包含2'-5'磷酸二酯键。

13.如权利要求12所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含两个2'-5'磷酸二酯键。

14.如权利要求13所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含2'-5'磷酸二酯键和3'-5'磷酸二酯键。

15.如前述权利要求中任一项所述的环状二核苷酸，其中所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸和腺苷核苷酸中的至少一种。

说明书

相关申请的交叉引用

在35U.S.C.§119(e)下，本申请要求于2013年5月3日提交的美国临时专利申请序列号61/819,499的提交日期的优先权；该申请的公开内容通过引用并入本文。

政府权利

本发明在由美国国立卫生研究院资助的基金号AI063302、AI075038、AI080749、AI082357和OD008677下经政府支持下完成。政府在本发明中享有一些权利。

引言

干扰素(也称为“IFN”)是具有多种生物学活性的蛋白质，其中一些是抗病毒、免疫调节和抗增殖。它们相对较小的物种特异的单链多肽，由哺乳动物应答暴露于多种诱导物例如病毒、多肽、促分裂原等而产生。干扰素保护动物组织和细胞免受病毒攻击，并且是重要的宿主防御机制。在大多数情况下，与其他组织和细胞类型相比，干扰素提供了对产生它们的组织和细胞类型的更好的保护，这说明来源于人的干扰素可比来自其他物种的干扰素更有效地治疗人疾病。干扰素可分为I型干扰素、II型干扰素和III型干扰素。哺乳动物I型干扰素包括IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω和IFN-ζ(也称为限制素，limtin)。

诱导干扰素产生的试剂可用作疫苗佐剂，以及用于启动效应T细胞应答和记忆T细胞应答的制剂。有效的佐剂增强针对抗原的特异性免疫应答，同时最小化毒副作用，降低疫苗接种的次数和剂量，并且扩展免疫应答。仍然存在对这样的有效佐剂的需要，所述佐剂可与来源于细胞内病原体和癌细胞的抗原共配制以活化有效的细胞免疫应答和体液免疫应答，从而治疗细胞内病原体以及降低肿瘤负荷。干扰素蛋白的免疫调节活性和调控干扰素产生的信号通路作为用于设计新佐剂的标靶吸引了兴趣。

干扰素具有治疗很多人癌症的潜力，因为这些分子具有在多重水平起作用的抗癌活性。首先，干扰素蛋白可直接抑制人肿瘤细胞的增殖。该抗增殖活性还与多种批准的化疗剂协调，例如，顺铂、5FU和紫杉醇。其次，干扰素蛋白的免疫调节活性可导致诱导抗肿瘤免疫应答。该应答包括活化NK细胞、刺激巨噬细胞活性和诱导MHCI型表面表达，导致诱导抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞活性。此外，在免疫系统中干扰素起交叉呈递抗原的作用。此外，一些研究还显示，IFN-β蛋白可具有抗血管生成性活性。血管发生、新血管形成是固体肿瘤生长的临界点。有证据显示，IFN-β可通过抑制原血管生成性因子例如bFGF和VEGF的表达来抑制血管发生。最后，干扰素蛋白可通过调节在组织重塑方面重要的酶例如胶原酶和弹性酶的表达来抑制肿瘤侵袭性。

干扰素还表现出具有基于两种不同机制的抗病毒活性。例如，I型干扰素蛋白(α和β)可直接抑制人乙肝病毒(“HBV”)和丙肝病毒(“HCV”)的复制，并且还可刺激攻击被这些病毒感染的细胞的免疫应答。

概述

本发明提供了用于提高细胞中的I型干扰素(IFN)的产生的方法和组合物。所述方法的方面包括以足以提高细胞产生所述I型干扰素(IFN)的方式提高所述细胞中的包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。还提供了用于实施该主题方法的组合物和药剂盒。

在一个方面中，本文提供了一种用于提高细胞中I型干扰素(IFN)的产生的方法，这通过以足以提高细胞产生所述I型干扰素(IFN)的方式提高所述细胞中的包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平来进行。

在某些实施方案中，所述方法包括使所述细胞与所述环状二核苷酸接触的步骤。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2′-5′磷酸二酯键。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有2′-5′磷酸二酯键和3′-5′磷酸二酯键。

在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个鸟苷。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。

在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：

其中X和Y分别是：

在一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：

在所述方法的某些实施方案中，通过提高所述细胞中的cGAMP合酶(cGAS)的活性来提高所述环状二核苷酸的水平。在一些实施方案中，通过增强编码cGAS的核酸的表达来提高所述cGAS的活性。在一些实施方案中，通过将编码cGAS的核酸引入所述细胞中来提高所述cGAS的活性。

在某些实施方案中，所述方法用于提高干扰素(IFN)α的产生。在另一些实施方案中，所述IFN是干扰素β。

在某些实施方案中，所述方法用于提高哺乳动物细胞中的I型干扰素(IFN)的产生。在一些具体实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是体外的。在另一些实施方案中，所述细胞是体内的。

在另一个方面中，本文提供了用于提高受试者中I型干扰素(IFN)的产生方法，所述方法包括将有效提高所述受试者中的所述I型干扰素的产生的量的包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸活性剂施用至受试者的步骤。

所述活性剂可包括但不限于本文描述的任何包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2′-5′磷酸二酯键。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有2′-5′磷酸二酯键和3′-5′磷酸二酯键。

在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个鸟苷。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一些具体实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：

其中X和Y分别是：

在主题方法的一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：

在某些实施方案中，所述包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸活性剂是提高cGAMP合酶(cGAS)的细胞活性的药剂。在一些具体实施方案中，所述药剂包含编码所述cGAS的核酸。

在某些实施方案中，所述方法用于提高受试者中干扰素(IFN)α的产生。在另一些实施方案中，所述方法用于提高受试者中干扰素β的产生。

在某些实施方案中，所述对象患有病毒性感染。在某些实施方案中，所述对象患有细菌性感染。在另一些实施方案中，所述对象患有肿瘤性疾病。在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。

在另一个方面中，本文提供了一种用于提高受试者中干扰素基因(STING)的刺激物介导的应答的方法，所述方法包括将有效提高所述受试者中STING介导的应答的量的STING活性剂施用至所述受试者。在某些实施方案中，所述STING介导的应答是对具有两个3′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸无应答性。

所述STING活性剂可包括但不限于本文描述的任何包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2′-5′磷酸二酯键。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有2′-5′磷酸二酯键和3′-5′磷酸二酯键。

在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个鸟苷。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一些具体实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：

其中X和Y分别是：

在主题方法的一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：

在某些实施方案中，所述STING活性剂包含提高cGAMP合酶(cGAS)的细胞活性的药剂。在一些具体实施方案中，所述药剂包含编码所述cGAS的核酸。

在某些实施方案中，所述STING活性剂包含提高STING的细胞活性的药剂。在一些具体实施方案中，所述药剂包含编码所述STING的核酸。

在某些实施方案中，所述对象患有病毒性感染。在某些实施方案中，所述对象患有细菌性感染。在另一些实施方案中，所述对象患有肿瘤性疾病。在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。

在另一个方面中，本文提供了一种环状二核苷酸，其包含2′-5′磷酸二酯键。这样的环状二核苷酸可用于例如实施主题方法，包括但不限于用于提高细胞或受试者中I型干扰素的产生的方法。

在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2′-5′磷酸二酯键。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有2′-5′磷酸二酯键和3′-5′磷酸二酯键。

在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个鸟苷。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。

在一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：

其中X和Y分别是：

在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：

在另一个方面中，本文提供了一种组合物，其包含包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸和药学上可接受的载体。

在某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有两个2′-5′磷酸二酯键。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸具有2′-5′磷酸二酯键和3′-5′磷酸二酯键。

在某些组合物的实施方案中，所述环状二核苷酸包含鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个鸟苷。在某些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含两个腺苷。在另一些实施方案中，所述环状二核苷酸包含腺苷核苷酸和鸟苷核苷酸。

在主题组合物的某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：

其中X和Y分别是：

在主题组合物的某些实施方案中，所述环状二核苷酸具有以下式：

附图简述

当结合附图来阅读时，本发明将从以下详细描述中得到最佳理解。强调的是，按照惯例，附图的多个特征不是按比例的。相反，为了清楚，任意扩展或缩小多个特征的尺寸。附图中包括以下图：

图1A至1F示出了人STING变体对映射至精氨酸232的环状二核苷酸的可变应答性。(A)用编码靶向STING的shRNA或对照shRNA的载体转导THP-1细胞。然后用环状二GMP(cdG)、dsDNA、环状二AMP(cdA)、多肌苷：胞嘧啶(pI:C)或仙台病毒刺激细胞，并通过定量逆转录酶PCR来评估人干扰素-βmRNA的诱导。(B)蛋白质印迹确认STING的敲除有效。(C)用指定量的多种小鼠(m)或人(h)STING表达质粒转染HEK293T细胞，然后在6小时后通过用合成的cdG(5μM)转染来刺激该细胞。GT表示来自Goldenticket(Gt)小鼠的Sting的空I199N等位基因。通过使用共转染的IFN荧光素酶报告子构建体来评估STING活化。(D)用编码所指定的STING等位基因的逆转录病毒载体转染Gt(空STING)巨噬细胞，然后在48小时后通过用cdG(5μM)或dsDNA70聚体的寡核苷酸(0.5μg/mL)刺激该细胞。通过qRT-PCR测量IFN诱导。ND，未检出。(E)STING与32P-环状二GMP的结合测定。将STING蛋白表达于HEK293T细胞中，并使细胞裂解物经历与³²P-cdG的UV交联，并通过SDS-PAGE解析。通过放射自显影来对结合进行定量。以抗STING多克隆抗体进行的对细胞裂解物的蛋白质印迹确认多种STING蛋白的相似表达。(F)mSTING对cGAMP的应答性受到R231突变的影响。如在C中那样测试所指定的突变体。

图2示出了hSTING变体的序列对齐。从THP-1细胞克隆hSTING，与参照STING等位基因(NCBINP_938023.1)对比。

图3示出，环状二GMP的应答性需要人STING的R232，但环状二GMP的结合不需要。(A)用所指定小鼠(m)STING或人(h)STING等位基因转染293T细胞，然后用环状二GMP(cdG)刺激该细胞。通过诱导共转染的IFN-荧光素酶报告子构建体来检测STING活性，并将该活性表示为相对于未经刺激的细胞的荧光素酶活性的诱导倍数。(B)在α32P-环状二GMP的存在下对经转染的293T细胞的裂解物进行UV交联，通过SDS-PAGE进行解析，然后通过放射自显影来分析。还对裂解物进行针对STING和作为平行表达对照的ACTIN的蛋白质印迹。

图4示出，对环状二核苷酸的最优应答性需要G230A和H232R二者，但对环状二核苷酸的结合不需要。(A,B)用所指定小鼠(m)STING或人(h)STING的等位基因转染293T细胞，然后用环状二GMP(cdG)刺激该细胞。通过诱导共转染的IFN-荧光素酶报告子构建体来检测STING活性。

图5示出，STING变体对cGAS有应答。(A)用所指定的STING等位基因以及用所指定的人cGAS和小鼠cGAS(wt和GS>AA突变体)转染HEK293T细胞。通过共转染的IFN荧光素酶报告子构建体来评估STING活化。(B)用所指定的STING等位基因以及用编码来自霍乱弧菌(V.cholerae)的cGAMP合酶(DncV)的哺乳动物表达载体转染HEK293T细胞。如A中一样评估STING活化。(C)将rWspR、rDncV和rcGAS的体外酶促生成的产物转染至经毛地黄皂苷通透的表达所指定的小鼠STING蛋白和人STING蛋白的HEK293T细胞中。包括作为对照的化学合成的环状二GMP(cdG)和cGAMP。如A和B中一样评估STING活化。

图6示出，cGAS产生包含2′-5′磷酸二酯键的非标准环状二核苷酸。(A)将纯化的重组WspR、DncV和cGAS与α³²P-GTP或α³²P-ATP和所指定的未经标记的核苷酸混合。将反应物与TLC电泳缓冲剂混合，并在PEI-纤维素TLC板上解析核酸物质。(B)用核酸酶P1和蛇毒磷酸二酯酶消化经α³²P-GTP标记的WspR、DncV和cGAS产物，并且在PEI-纤维素TLC板上解析核酸物质。(C)在600MHz和50℃下得到HPLC纯化的cGAS产物的¹H-³¹PHMBC。指定了磷酸二酯键的通过-结合的关键相关性。还示出了cGAS产物的NMR显示的结构。

图7A至7D提供了对cGAS产物的附加NMR分析。所有数据采集都在D2O中和50℃下进行。(A,B)900MHz场中的多重性编辑的1H-13CHSQC实验。与次甲基和甲基质子对应的正相信号以绿色示出，与亚甲基质子对应的负相信号以蓝色示出。(C)600MHz场中的¹H-¹HCOSY实验。(D)900MHz场中的¹H-¹HNOESY实验。

详述

本发明提供了用于提高细胞中的I型干扰素(IFN)的产生的方法和组合物。所述方法的方面包括以足以提高细胞产生所述I型干扰素(IFN)的方式提高所述细胞中的包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。还提供了用于实施该主题方法的实施方案的组合物和药剂盒。

在更详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因为这些当然是可变化的。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定的实施方案，并非旨在限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书的限制。

在提供值的范围的情况下，应理解，除非上下文清楚地另有说明，否则该范围上限与下限的每个中间值以及指定范围中的任何其他指定值或中间值，直至下限的十分之一单位，都涵盖与本发明内。较小的范围中可独立地包括这些较小范围的上限和下限，并且这些上限和下限将涵盖于本发明内，受到所陈述范围中的任何具体排除的限值。在所陈述的范围包括一个或两个该限值的情况下，本发明中包括排除所包括的限值之一或这二者的范围。

在本文中某些范围是以在数值前加术语“约”来呈示的。本文中使用术语“约”以提供对其后面的精确数字以及其后面的数字的附近或近似该数字的数字提供字面支持。在确定数字是否在具体列举的数字附近或近似该数字中，接近或近似的所列举的数字可为在示出其的上下文中提供具体列举的数字的基本等价物的数字。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语都具有与由本发明所属领域的技术人员所通常理解相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的任何方法和材料都可用于本发明的实施或测试中，但是现在描述代表性的示例性方法和材料。

本说明书中引用的所有出版物和专利都通过引用并入本文，就如将每个单独的出版物或专利特别地和单独地指定为通过引用并入一样，并且所有出版物和专利都通过引用并入本文以结合所引用的出版物来公开和描述方法和/或材料。对任何出版物的引用都是针对其在提交日期之前的公开内容，并且其不应解释为承认由于在先发明而使本发明不享有先于该出版物的权利。此外，提供的出版物的日期可能与实际的公开日期不同，这可需要进行单独地确认。

应注意，除非上下文另有清楚指明，否则本文以及所附权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物。还应注意，可撰写权利要求书来排除任何可选要素。同样地，该陈述旨在用作与权利要求要素的列举联合使用此类排他性术语如“单独”、“仅仅”等、或使用“否定”限制的在线基础。

在阅读本公开后，对本领域技术人员应显而易见的是，本文描述和示出的每一个单独的实施方案具有单独的组分和特征，该组分和特征可与任何其他一些实施方案的特征分离或组合，而不脱离本发明的范围和精神。任何列举的方法可按所列举的事件的顺序或以逻辑可行的任何其他顺序进行。

方法

如上文所概括，提供了提高细胞中I型干扰素(IFN)的产生(例如在体外或体内)的方法。提高I型干扰素的产生是指，与对照相比，主题方法提高了细胞中I型干扰素的产生。该提高的量级可变化，并且在一些例子中为，与合适的对照相比，2倍或更大，例如5倍或更大，包括10倍或更大。同样，在一些例子中，所述方法是与合适的对照相比，将细胞中I型干扰素的产生提高2倍或更大的量级，例如5倍或更大，包括10倍或更大。在实施所述方法之前检测不到干扰素的产生的一些实施方案中，该提高可导致可检测的量的干扰素产生。可通过使用任何合适的方法来测量干扰素产生，包括但不限于，水疱性口炎病毒(VSV)激发生物测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、基于复制子的生物测定或通过使用在I型干扰素信号通路的调控下克隆的报告基因(例如，荧光素酶)。参见例如MeagerJ.Immunol.Methods261:21-36(2002)；Vrolijk等C.J.Virol.Methods110:201-209(2003)；和Francois等AntimicrobAgentsChemother49(9):3770-3775(2005)。

所述方法可用于提高任何I型干扰素的产生，包含但不限于：IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω和IFN-ζ(也称为限制素，limtin)。在一些实施方案中，所述方法是用来提高IFN-α的产生。在一些实施方案中，所述方法是用来提高IFN-β。

所述方法的方面包括以足以提高细胞产生所述I型干扰素的方式提高所述细胞中的包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。提高包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸是指，与对照相比，主题方法提高了包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸的量。如在下面的实验部分中示出，包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸可提高I型干扰素产生的水平。该提高的量级可变化，并且在一些例子中为，与合适的对照相比，2倍或更大，例如5倍或更大，包括10倍或更大、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍或100倍。

可使用多种不同的方法来实现提高包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸的水平。在一些例子中，所述方法包括提供具有提高靶细胞中包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸水平的环状二核苷酸活性剂的靶细胞。环状二核苷酸活性剂可变化，并包括但不限于：小分子、核酸、蛋白质和肽试剂。

在一些实施方案中，与没有与所述环状二核苷酸活性剂接触的对照相比，所述环状二核苷酸活性剂提高细胞或受试者中的IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω和IFN-ζ(也称为限制素，limtin)。在一些这样的实施方案中，所述提高为1.5倍提高至50倍提高或更高，包括2倍提高至45倍提高、5倍提高至40倍提高、10倍提高至35倍提高、15倍提高至30倍提高、20倍提高至30倍提高等。

在一些例子中，所述环状二核苷酸活性剂是包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸或其功能类似物。包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸包括但不限于本文描述的那些包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸。

本文所用的“环状二核苷酸”是指包含两个核酸的化合物(即，第一核苷酸和第二核苷酸)，其中每个核苷酸的2′碳或3′碳通过磷酸二酯键与另一核苷酸的5′碳连接。因此，包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸是指这样的环状二核苷酸，其中至少第一核苷酸或第二核苷酸的2′碳与另一核苷酸的5′碳连接。下文中更详细地描述了包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸。

包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸的功能类似物是表现出相似的功能活性(例如，提高I型IFN的产生)的那些化合物，并且可具有与包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸相似的结构。在一些例子中，所述功能类似物是小分子试剂。所关注的天然存在的或合成的小分子化合物包括许多化学种类，例如有机分子，包括具有大于50道尔顿并且小于约2,500道尔顿的分子量的小有机化合物。候选试剂包含对与蛋白质的结构相互作用、特别是氢键合所必需的官能团，并且通常包含至少胺、羰基、羟基或羧基，优选这些官能性化学基团中的至少两种。候选试剂还可包含由上述官能团中的一种或多种取代的环碳结构或杂环结构和/或芳族结构或多芳族结构。还发现候选试剂包括肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合等生物学分子。可通过使用合适的筛选方案等其他方式来鉴定这样的分子。

在一些例子中，所述环状二核苷酸活性剂是提高环GMP-AMP合酶(cGAS)的细胞活性的试剂。如在下文的实验部分中所述，提高cGMP合酶(cGAS)水平可提高细胞中环状二核苷酸的产生和/或活性。同样地，可以以足以提高细胞中的I型干扰素的产生的方式使靶细胞与提高cGMP合酶产生和/或细胞活性的试剂接触。在一些实施方案中，所述环状二核苷酸活性剂是编码cGAS的核酸。编码多种cGAS酶的核酸包括但不限于在Sun等Science339(6121):786-91中描述的那些，以及在GENBANK中保藏并分配有以下保藏号的那些：NM_138441.2和NP_612450.2(人)；NM_173386.4和NP_775562.2(小家鼠，musmusculus)。

在某些实施方案中，所述编码cGAS的核酸具有以下序列：

agcctggggttccccttcgggtcgcagactcttgtgtgcccgccagtagtgcttggtttccaacagctgctgctggctcttcctcttgcggccttttcctgaaacggattcttctttcggggaacagaaagcgccagccatgcagccttggcacggaaaggccatgcagagagcttccgaggccggagccactgcccccaaggcttccgcacggaatgccaggggcgccccgatggatcccaccgagtctccggctgcccccgaggccgccctgcctaaggcgggaaagttcggccccgccaggaagtcgggatcccggcagaaaaagagcgccccggacacccaggagaggccgcccgtccgcgcaactggggcccgcgccaaaaaggcccctcagcgcgcccaggacacgcagccgtctgacgccaccagcgcccctggggcagaggggctggagcctcctgcggctcgggagccggctctttccagggctggttcttgccgccagaggggcgcgcgctgctccacgaagccaagacctccgcccgggccctgggacgtgcccagccccggcctgccggtctcggcccccattctcgtacggagggatgcggcgcctggggcctcgaagctccgggcggttttggagaagttgaagctcagccgcgatgatatctccacggcggcggggatggtgaaaggggttgtggaccacctgctgctcagactgaagtgcgactccgcgttcagaggcgtcgggctgctgaacaccgggagctactatgagcacgtgaagatttctgcacctaatgaatttgatgtcatgtttaaactggaagtccccagaattcaactagaagaatattccaacactcgtgcatattactttgtgaaatttaaaagaaatccgaaagaaaatcctctgagtcagtttttagaaggtgaaatattatcagcttctaagatgctgtcaaagtttaggaaaatcattaaggaagaaattaacgacattaaagatacagatgtcatcatgaagaggaaaagaggagggagccctgctgtaacacttcttattagtgaaaaaatatctgtggatataaccctggctttggaatcaaaaagtagctggcctgctagcacccaagaaggcctgcgcattcaaaactggctttcagcaaaagttaggaagcaactacgactaaagccattttaccttgtacccaagcatgcaaaggaaggaaatggtttccaagaagaaacatggcggctatccttctctcacatcgaaaaggaaattttgaacaatcatggaaaatctaaaacgtgctgtgaaaacaaagaagagaaatgttgcaggaaagattgtttaaaactaatgaaataccttttagaacagctgaaagaaaggtttaaagacaaaaaacatctggataaattctcttcttatcatgtgaaaactgccttctttcacctatgtacccagaaccctcaagacagtcagtgggaccgcaaagacctgggcctctgctttgataactgcgtgacatactttcttcagtgcctcaggacagaaaaacttgagaattattttattcctgaattcaatctattctctagcaacttaattgacaaaagaagtaaggaatttctgacaaagcaaattgaatatgaaagaaacaatgagtttccagtttttgatgaattttgagattgtatttttagaaagatctaagaactagagtcaccctaaatcctggagaatacaagaaaaatttgaaaaggggccagacgctgtggctcac(SEQIDNO：01)

在一些实施方案中，所述编码cGAS的核酸是与野生型cGAS核酸序列具有40％至99％、45％至99％、50％至99％、55％至99％、60％至99％、65％至99％、70％至99％、75％至99％、80％至99％、85％至99％、90％至99％或95％至99％序列同一性的核酸。在一些实施方案中，所述编码cGAS的核酸是与野生型cGAS核酸序列具有40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至99％序列同一性的核酸。在一些实施方案中，所述编码cGAS的核酸是与野生型cGAS核酸序列具有40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高或者99％或更高序列同一性的核酸。

在一些例子中，所述环状二核苷酸活性剂是包含编码cGAS的核酸的载体。可将载体直接提供至受试者细胞。换言之，使细胞与具有编码环状二核苷酸活性剂的核酸(例如，编码cGAS的核酸)的载体接触，以使所述细胞摄取所述载体。用于使细胞与作为质粒的核酸载体接触的方法，例如电穿孔、氯化钙转染和脂质体转染，是本领域公知的。对于病毒载体递送，使细胞与包含编码环状二核苷酸试剂的核酸的病毒颗粒接触。逆转录病毒，例如慢病毒，特别适于本发明的方法。常用的逆转录病毒载体是“有缺陷的”，即，不能产生用于生产性感染所需的病毒蛋白质。相反，该载体的复制需要生长于包装细胞系中。为了生成包含所关注的核酸的病毒颗粒，通过包装细胞系将包含该核酸的逆转录病毒核酸包装至病毒衣壳中。不同的包装细胞系提供了将并入衣壳中的不同外膜蛋白(亲嗜性、兼嗜性或异嗜性)，该外膜蛋白确定病毒颗粒对细胞的特异性(对鼠科动物和大鼠的亲嗜性；对大多数哺乳动物细胞类型(包括人、狗和小鼠)的兼嗜性；以及对除了鼠科细胞外的大多数哺乳动物细胞类型的异嗜性)。该合适的包装细胞系可用于确保细胞被包装的病毒颗粒所靶向。将包含编码重编程的因子的核酸的逆转录病毒载体引入包装细胞系中的方法以及收集由该包装细胞系生成的病毒颗粒的方法是本领域公知的。

用于将编码环状二核苷酸活性活性剂的核酸提供至受试者细胞的载体可包含用于驱动所关注的核酸表达(即，转录活化)的核酸的启动子。换言之，所关注的核酸将可操作地连接至启动子。这可包括遍在(ubiquitously)作用启动子，例如，CMV-β-肌动蛋白启动子，或可诱导启动子，例如在特定的细胞群体中活性的或响应药物例如四环素的存在活化的启动子。通过转录活化，预期转录将相对于靶细胞中的基线水平提高至10倍或更多、100倍或更多、1000倍或更多。此外，用于提供环状二核苷酸活性剂至受试者细胞的载体可包含编码靶细胞中的可选择标志物的核酸序列，以鉴定已经摄入了环状二核苷酸活性活性剂的细胞。

环状二核苷酸活性剂还可作为多肽提供至细胞。例如，在一些例子中，所述环状二核苷酸活性剂是cGAS多肽。多种cGAS酶的氨基酸序列包括但不限于在Sun等Science339(6121)：786-91中描述的那些，以及在GENBANK中保藏并分配有以下保藏号的那些：NM_138441.2和NP_612450.2(人)；NM_173386.4和NP_775562.2(小家鼠)。

在某些实施方案中，所述cGAS多肽具有以下序列：

MQPWHGKAMQRASEAGATAPKASARNARGAPMDPTESPAAPEAALPKAGKFGPARKSGSRQKKSAPDTQERPPVRATGARAKKAPQRAQDTQPSDATSAPGAEGLEPPAAREPALSRAGSCRQRGARCSTKPRPPPGPWDVPSPGLPVSAPILVRRDAAPGASKLRAVLEKLKLSRDDISTAAGMVKGVVDHLLLRLKCDSAFRGVGLLNTGSYYEHVKISAPNEFDVMFKLEVPRIQLEEYSNTRAYYFVKFKRNPKENPLSQFLEGEILSASKMLSKFRKIIKEEINDIKDTDVIMKRKRGGSPAVTLLISEKISVDITLALESKSSWPASTQEGLRIQNWLSAKVRKQLRLKPFYLVPKHAKEGNGFQEETWRLSFSHIEKEILNNHGKSKTCCENKEEKCCRKDCLKLMKYLLEQLKERFKDKKHLDKFSSYHVKTAFFHVCTQNPQDSQWDRKDLGLCFDNCVTYFLQCLRTEKLENYFIPEFNLFSSNLIDKRSKEFLTKQIEYERNNEFPVFDEF.(SEQIDNO：02)

在一些实施方案中，所述cGAS多肽是与野生型cGAS氨基酸序列具有40％至99％、45％至99％、50％至99％、55％至99％、60％至99％、65％至99％、70％至99％、75％至99％、80％至99％、85％至99％、90％至99％或95％至99％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述cGAS多肽是与野生型cGAS氨基酸序列具有40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至99％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述cGAS多肽是与野生型cGAS氨基酸序列具有40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高或者99％或更高序列同一性的多肽。

可任选使这样的多肽与提高产物的溶解度的多肽结构域融合。可通过限制性蛋白酶切割位点例如由TEV蛋白酶切割的TEV序列将该结构域与多肽连接。所述接头可包含一种或多种柔性序列，例如，1至10个甘氨酸残基。在一些实施方案中，融合蛋白的切割在维持该产物的溶解度的缓冲剂中进行，例如在存在0.5M至2M脲下，在存在提高溶解度的多肽和/或多核苷酸等下。所关注的结构域包括内体裂解结构域，例如流感HA域；以及协助产生的其他多肽，例如，IF2结构域、GST结构域、GRPE结构域等。可配制所述多肽以改进稳定性。例如，可使所述肽PEG化，其中聚乙烯基氧基提供了增强的在血流中的寿命。

此外或可选地，可将所述环状二核苷酸活性剂与促进由细胞摄取的多肽渗透结构域融合。一些渗透性结构域是本领域已知的，且可用于本发明的非整合性多肽，包括肽、模拟肽和非肽载剂。例如，渗透性肽可衍生自黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)的被称为渗透素(penetratin)的转录因子Antennapaedia的第三α螺旋，其包括氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQIDNO:03)。作为另一个例子，所述渗透性肽包含HIV-1tat基础区氨基酸序列(其可包含例如天然存在的tat蛋白的氨基酸49至57)。其他渗透性结构域包括聚精氨酸基序，例如，HIV-1rev蛋白的氨基酸34至56的区域、九-精氨酸、八-精氨酸等。(参见例如，Futaki等CurrProteinPeptSci.4(2):87-96(2003)；和Wender等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A97(24):13003-8(2000)；出版的美国专利申请20030220334；20030083256；20030032593；和20030022831，通过引用明确并入本文用于关于易位肽和拟肽的教导)。九-精氨酸(R9)序列已经表征了的更高效的PTD中的一种(Wender等2000；Uemura等2002)。可选择形成融合的位点以优化生物学活性、多肽的分泌特性或结合特性。将通过例行实验来确定最优位点。

在实施本文提供的方法的实施方案中，将有效量的活性剂，即，环状二核苷酸活性剂(例如上文所述的)，提供于一种或多种靶细胞中。本文所用的“有效量”或“有效的量”是指，当与细胞接触(例如通过在体外引入细胞、通过施用至受试者等)时，足以导致细胞中环状二核苷酸的水平升高的活性剂的量。“有效量”将根据细胞和/或生物和/或化合物和/或期望的结果的性质和/或疾病及其严重程度和待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。

在一些例子中，通过使细胞与活性剂接触来将有效量的活性剂提供于细胞中。细胞与活性剂的接触可使用任何方便的方案来进行。该方案可根据靶细胞的定位使活性剂在体外或体内与靶细胞接触。例如，在靶细胞是分离的细胞的情况下，例如体外细胞(即，在培养物中)或离体细胞(“离体”是指在体外修饰的细胞或器官，其中这样的细胞或器官通常回到活体)，可在允许靶细胞的活力的细胞培养条件下将活性剂直接引入细胞中。这样的技术包括不必要地限于：病毒性感染、转染、缀合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、病毒载体递送等。方法的选择一般取决于将接触的细胞类型和活性剂的性质，以及进行转化的环境(例如，体外、离体或体内)。这些方法的一般性描述可在Ausubel等，ShortProtocolsinMolecularBiology,第3版，Wiley&Sons,1995中找到。作为另一个例子，其中一种或多种靶细胞是多细胞生物体的部分，可以以使活性剂能够接触靶细胞的方式，例如，通过体内方案，将活性剂施用至生物体或受试者。“体内”的意思是，将靶构建体施用至动物活体。

在一些实施方案中，采用所述环状二核苷酸活性剂来调节体外或离体的有丝分裂细胞或有丝分裂后细胞中的环状二AMP活性，即，产生可重新引入个体的修饰细胞。在这些实施方案中，所关注的有丝分裂细胞和有丝分裂后包括任何真核细胞，例如，多能干细胞，例如，ES细胞、iPS细胞和胚胎种系细胞；体细胞，例如，造血细胞、成纤维细胞、神经元、肌肉细胞、骨细胞、血管内皮细胞、肠细胞等，及其谱系限制的祖细胞和前体细胞；以及肿瘤细胞或癌细胞，即，显示一种或多种与癌细胞性能相关的细胞，所述癌细胞性能例如，高增殖、接触抑制、侵入其他组织的能力等。在某些实施方案中，所述真核细胞是癌细胞。在某些实施方案中，所述真核细胞是造血细胞，例如，巨噬细胞、NK细胞等。细胞可来自任何哺乳动物物种，例如，鼠科动物、啮齿类动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、羊科动物、灵长类动物、人等。细胞可来自任何建立的细胞系，或者它们可为原代细胞，其中“原代细胞”、“原代细胞系”和“原代培养物”在本文中可互换使用，表示来源于受试者并且使其在体外生长有限的培养传代(即，分裂)数的细胞或细胞培养物。例如，原代培养物是可能已经传代0次、1次、2次、4次、5次、10次或15次但不够通过危机阶段的次数的培养物。通常来说，本发明的原代细胞系在体外维持少于10代。

如果细胞是原代细胞，则可通过任何方便的方法从个体收集它们。例如，血细胞例如白细胞，如巨噬细胞，可通过单成分采血(apheresis)、白细胞单成分采血、密度梯度分离等来收集，而来自组织例如皮肤、肌肉、骨髓、脾、肝、胰、肺、肠、胃等组织的细胞可通过组织活检来收集。可使用合适的溶液来分散或混悬所收集的细胞。这样的溶液一般为平衡的盐溶液，例如，标准盐水、PBS、Hank′s平衡盐溶液等，适当补充有胎牛血清或其他天然存在的因子，结合一般为5-25mM的低浓度的可接受缓冲剂。方便的缓冲剂包括HEPES、磷酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂等。可直接施用这些细胞，或者可将它们储存、冷冻长时间，融化并能够重新使用。在这样的情况下，可将细胞冷冻于10％DMSO、50％血清、40％缓冲介质中，或者本领域常用的另一些这样的溶液中，以将细胞保存于这样的冷冻温度下，并以本领域已知的用于融化冷冻的培养细胞的方式来融化。

所述环状二核苷酸活性剂可由真核细胞或由原核细胞产生，可通过解折叠例如热变性、DTT还原等来对其进一步处理，并且可使用本领域已知的方法进一步重折叠。

不改变一级序列的所关注的修饰包括多肽的化学衍生，例如，酰化、乙酰化、羧化、酰胺化等。还包括糖基化修饰，例如，通过在其合成和处理期间或在进一步处理的步骤中修饰多肽的糖基化模式来进行；例如，通过将多肽暴露于影响糖基化的酶来进行，所述酶例如，哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶。还包括的是具有磷酸化氨基酸残基例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或或磷酸苏氨酸的序列。

还包括于主题发明中的是，已经使用普通的分子生物学技术和合成化学进行修饰以改进它们对蛋白质降解的抗性或优化溶解度或使它们更适于作为治疗剂的环状二核苷酸活性剂多肽(例如，cGAS多肽)。这样的多肽类似物包括包含除了天然存在的L-氨基酸以外的多肽，例如，包含D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸的多肽。可将D-氨基酸替换成一些或所有氨基酸残基。

可使用任何合适的方法通过体外合成来制备所述环状二核苷酸活性剂。可得到多种市售的合成装置，例如，AppliedBiosystems,Inc.,Beckman市售的自动合成仪等。通过使用合成仪，可用非天然氨基酸替换天然存在的氨基酸。可根据方便、经济、需要的纯度等来确定具体序列和制备方式。

如果期望，可在合成期间或在表达期间将多种基团引入肽中，使其与其他分子或与表面连接。因此，可使用半胱氨酸来制备硫醚，使用组氨酸来与金属离子复合物连接，使用羧基来形成酰胺或酯，使用氨基来形成酰胺，等。

还可根据常规的重组合成方法来分离和纯化所述环状二核苷酸活性剂。可制备表达宿主的裂解物，并使用HPLC、排除色谱、凝胶电泳、亲和色谱或其他纯化技术来纯化裂解物。大多数情况下，相对于与产物的制备及其纯化的方法有关的污染物(其中，百分率可基于总蛋白质)，所使用的组合物将包含按重量计20％或更多的期望产物，例如按重量计75％或更多的期望产物，包含按重量计95％或更多的期望产物，并且出于治疗目的，可为按重量计99.5％或更多。

为了调节环状二核苷酸的活性和/或产生，可将所述环状二核苷酸活性剂--如果它们是编码环状二核苷酸活性剂多肽(例如，cGAS)的小分子(例如，包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸)多肽或核酸——提供于细胞，保持充分的时间段，例如，30分钟至24小时，例如，1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时，或30分钟至24小时之间的任何其他时间，该过程可以以每天至每4天的频率来重复，例如，每1.5天、每2天、每3天，或者约每天至约每四天之间的任何其他频率。可将该试剂提供至受试者细胞一次或多次，例如，一次、两次、三次或多于三次，并且在每次接触事件后使细胞与该试剂孵育一定量的时间，例如，16小时至24小时，在该时间后用新鲜培养基更换培养基，并进一步培养细胞。

在某些实施方案中，以足以提高细胞产生I型干扰素的方式将两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种或十种或更多种不同的环状二核苷酸活性剂提供至细胞。在一些例子中，所述活性剂包含两个或更多种不同的包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸。在某些实施方案中，所述活性剂包括包含2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸和编码cGAS或cGAS多肽的核酸。在将两种或更多种不同的环状二核苷酸活性剂(即，环状二核苷酸活性剂混合物)提供至细胞的例子中，可同时提供所述环状二核苷酸活性剂，例如，作为同时递送的两种环状二核苷酸，或者作为同时递送的环状二核苷酸和包含编码cGAS的核酸的载体。可选地，可连续提供它们，例如，首先提供第一环状二核苷酸活性剂，接着提供所述环状二核苷酸活性剂等，或反之亦然。

将有效量的环状二核苷酸活性剂提供至细胞，以导致环状二核苷酸水平的变化。有效量的环状二核苷酸活性剂是相对于阴性对照(例如与空载体或不相关多肽接触的细胞)观察到导致环状二核苷酸产生的量提高至2倍或更多的量。也就是说，有效量或有效剂量的环状二核苷酸活性剂将导致观察到的环状二核苷酸的量提高至2倍、提高至3倍、提高至4倍或更多，在一些例子中，观察到的活性的量提高至5倍、提高至6倍或更多，有时提高至7倍或提高至8倍或更多，例如，提高至10倍、50倍或100倍或更多，在一些例子中，观察到的活性的量提高至200倍、500倍、700倍或1000倍或更多。可通过合适的方法测量活性的量。例如，可在使细胞与环状二核苷酸活性剂接触后，例如，在与环状二核苷酸活性剂接触后2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时处，评估该细胞产生的干扰素的量。

可在任何培养基以及在任何促使细胞存活的条件下进行细胞与环状二核苷酸活性剂的接触。例如，可将细胞混悬于任何合适的方便的营养介质中，例如，补充有胎牛血清或热失活的山羊血清(约5％-10％)、L谷氨酰胺、硫醇(特别是2-巯基乙醇)，以及抗生素例如青霉素和链霉素的Iscove′s改良的DMEM或RPMI1640。培养物可包含该细胞为应答性的生长因子。如本文所定义，生长因子是能够通过对跨膜受体的特定作用来促使处于培养物中或处于完整组织中的细胞存活、生长和/或分化的分子。生长因子包括多肽和非多肽因子。

按照以上描述的方法，可将细胞离体修饰成在环状二核苷酸水平上有提高。在一些实施方案中，可以期望选择经修饰细胞，例如，以制造经修饰细胞的富集群体。可使用对细胞的任何方便的修饰将细胞标记成经环状二核苷酸活性剂修饰的。例如，可将可选择标志物插入到细胞的基因组，以使可通过从其余群体分离基因标记的细胞来富集包含该基因修饰的细胞群体。可通过适于所使用的可选择标志物的任何方便的分离技术来进行分离。例如，如果已经插入荧光标志物，则可通过荧光活化的细胞分选来分离细胞，而如果已经插入细胞表面标志物，则可通过亲和分离技术来从异质群体中分离细胞，所述亲和分离技术例如，磁分离、亲和色谱、用附接至固体基质的亲和试剂进行“淘选”或其他方便的技术。通过精确分离的技术包括荧光活化的细胞分选仪，其可具有不同的复杂程度，例如多重颜色通道、低角度和钝的光散射检测通道、阻抗通道等。可通过使用与死细胞相关的染料(例如，碘化丙啶)来针对死细胞选择细胞。可使用不过度损害基因修饰的细胞的活力的任何技术。

以该方式实现了针对包含环状二核苷酸活性剂的细胞高度富集的细胞组合物。“高度富集”意思是基因修饰的细胞将为所述细胞组合物的70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多，例如，所述细胞组合物的约95％或更多，或者98％或更多。换言之，所述组合物可为基本纯的包含环状二核苷酸活性剂的细胞组合物。

可立即使用由本文描述方法产生的包含环状二核苷酸活性剂的细胞。可选地，可将细胞冷冻于液氮温度下，并储存长时间，融合并能够重新使用。在这样的情况下，可将细胞冷冻于10％DMSO、50％血清、40％缓冲介质中，或者本领域常用的另一些这样的溶液中，以将细胞保存于这样的冷冻温度下，并以本领域已知的用于融化培养的细胞的方式来融化。

可在多种培养条件下体外培养包含环状二核苷酸活性剂的细胞。可在培养中扩增细胞，即，使细胞在促使其增殖的条件下生长。培养基可为液体或半固体，例如包括琼脂、甲基纤维素等。可将细胞群体混悬于合适营养素介质中，例如，通常补充有胎牛血清(约5％至10％)、L谷氨酰胺、硫醇(特别是2-巯基乙醇)，以及抗生素例如青霉素和链霉素的Iscove′s改良的DMEM或RPMI1640。培养物可包含调控性T细胞应答性的生长因子。如本文所定义，生长因子是能够通过对跨膜受体的特定作用来促使处于培养物中或处于完整组织中的细胞存活、生长和/或分化的分子。生长因子包括多肽和非多肽因子。

将用环状二核苷酸活性剂修饰的细胞移植至受试者，以治疗疾病或作为抗病毒治疗剂、抗病原体治疗剂或抗癌治疗剂或用于生物学研究。所述受试者可为新生儿、少儿或成年人。特别关注的是哺乳动物受试者。可用本方法治疗的哺乳动物物种包括犬科动物和猫科动物；马科动物；牛科动物；羊科动物；等，以及灵长类动物，特别是人。动物模型，特别是小哺乳动物，例如，鼠科动物、兔形目等可用于实验研究。

可将细胞单独或与合适的基底或基质(例如，以支持它们在它们所移植到的组织中的生长和/或组织)一起提供至受试者。在一些例子中，将施用至少1×10³细胞，例如，5×10³细胞、1×10⁴细胞、5×10⁴细胞、1×10⁵细胞、1×10⁶细胞或更多。可通过以下路线将所述细胞引入受试者：肠胃外、皮下、静脉内、颅内、脊柱内、眼内，或引入至脊液中。可通过注射、导管等来引入所述细胞。用于局部递送(即，递送至损伤位点)的方法的例子包括例如，通过Ommaya储库，例如，用于鞘内递送(参见例如，美国专利号5,222,982和5385582，通过引用并入本文)；通过推注(例如通过注射器)例如至关节中；通过用对流的持续灌注(例如通过套管)(参见例如，美国申请号20070254842，通过引用并入本文)；或通过埋植已经将细胞可逆地附于其上的设备(参见例如，美国申请号20080081064和20090196903，通过引用并入本文)。

在本发明的另一些方面中，使用所述环状二核苷酸活性剂以提高I型干扰素的体内产生。在这些体内实施方案中，直接将所述环状二核苷酸活性剂施用至个体。在一些实施方案中，施用至受试者的环状二核苷酸活性剂包含具有2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸。

可通过用于施用肽、小分子和核酸的任何合适方法将环状二核苷酸活性剂施用至受试者。可将所述环状二核苷酸活性剂并入多种制剂中。更具体地，可通过与合适的药学上可接受的载剂或稀释剂组合来将本发明的环状二核苷酸活性剂配制成药物组合物。以下描述了可用于实施主题方法的药物组合物。

在这样的例子中，可将有效量的环状二核苷酸活性剂施用至受试者。所述环状二核苷酸活性剂的“有效量”或“治疗有效量”意指降低疾病的严重程度、持续时间和/或病况所需的量。在一些实施方案中，如本文所提供的，包含环状二核苷酸活性剂的药物组合物的有效量介于0.025mg/kg和1000mg/kg人受试者体重之间。在某些实施方案中，施用至人受试者的所述药物组合物的量为1000mg/kg体重或更小、950mg/kg体重或更小、900mg/kg体重或更小、850mg/kg体重或更小、800mg/kg体重或更小、750mg/kg体重或更小、700mg/kg体重或更小、650mg/kg体重或更小、600mg/kg体重或更小、550mg/kg体重或更小、500mg/kg体重或更小、450mg/kg体重或更小、400mg/kg体重或更小、350mg/kg体重或更小、300mg/kg体重或更小、250mg/kg体重或更小、200mg/kg体重或更小、150mg/kg体重或更小、100mg/kg体重或更小、95mg/kg体重或更小、90mg/kg体重或更小、85mg/kg体重或更小、80mg/kg体重或更小、75mg/kg体重或更小、70mg/kg体重或更小，或者65mg/kg体重或更小。

在另一个方面中，本文提供了一种用于提高受试者中干扰素基因(STING)介导的应答(例如，STING介导的免疫应答)的刺激物的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将有效提高所述受试者中STING介导的应答的量的STING活性剂施用至所述受试者的步骤。“STING”介导的应答是指由STING介导的任何应答，包含但不限于对细菌病原体、病毒病原体和真核病原体的免疫应答。参见例如，Ishikawa等人Immunity29:538-550(2008)；Ishikawa等Nature461:788-792(2009)；和Sharma等Immunity35:194-207(2011)。STING还在因自体DNA的不适当识别起始的某些自体免疫疾病(参见例如，Gall等Immunity36:120-131(2012))中以及在应答DNA疫苗的适应性免疫诱导(参见例如，Ishikawa等Nature461:788-792(2009))中发挥功能。提高受试者中STING介导的应答是指与对照受试者(例如，未施用STING活性剂的受试者)相比，受试者中STING介导的应答的提高。在某些实施方案中，所述方法用于提高受试者中干扰素基因(STING)介导的应答的刺激物，其中STING介导的应答对具有两个3′-5′磷酸二酯键(即，典型的环状二核苷酸)是非应答性的。

如在以下的实验部分中描述的，具有2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸已经示出活化STING信号转导。此外，已经示出这样的具有2′-5′磷酸二酯键的环状二核苷酸刺激对具有两个磷酸二酯键的环状二核苷酸非应答性的STING等位基因。同样地，在一些实施方案中，所述STING活性剂是本文描述的环状二核苷酸活性剂(例如，环状二核苷酸、编码cGAS的核酸)。

在另一些实施方案中，所述STING活性剂是编码STING的核酸或STING多肽。编码多种STING的核酸包括但不限于在以下文献中描述的那些：Nitta等Hepatology57(1)：46-58(2013)和Jin等J.Immunol.190(6)：2835-2843(2013)，以及在GENBANK保藏的分配有以下保藏号的那些：NM_198282.2和NP_938023.1(人)；NM_028261.1和NP_082537.1(小家鼠)；和NM_057386.4和NP_476734.1(黑腹果蝇)。

在某些实施方案中，所述编码STING的核酸具有以下序列：

gttcatttttcactcctccctcctaggtcacacttttcagaaaaagaatctgcatcctggaaaccagaagaaaaatatgagacggggaatcatcgtgtgatgtgtgtgctgcctttggctgagtgtgtggagtcctgctcaggtgttaggtacagtgtgtttgatcgtggtggcttgaggggaacccgctgttcagagctgtgactgcggctgcactcagagaagctgcccttggctgctcgtagcgccgggccttctctcctcgtcatcatccagagcagccagtgtccgggaggcagaagatgccccactccagcctgcatccatccatcccgtgtcccaggggtcacggggcccagaaggcagccttggttctgctgagtgcctgcctggtgaccctttgggggctaggagagccaccagagcacactctccggtacctggtgctccacctagcctccctgcagctgggactgctgttaaacggggtctgcagcctggctgaggagctgcgccacatccactccaggtaccggggcagctactggaggactgtgcgggcctgcctgggctgccccctccgccgtggggccctgttgctgctgtccatctatttctactactccctcccaaatgcggtcggcccgcccttcacttggatgcttgccctcctgggcctctcgcaggcactgaacatcctcctgggcctcaagggcctggccccagctgagatctctgcagtgtgtgaaaaagggaatttcaacgtggcccatgggctggcatggtcatattacatcggatatctgcggctgatcctgccagagctccaggcccggattcgaacttacaatcagcattacaacaacctgctacggggtgcagtgagccagcggctgtatattctcctcccattggactgtggggtgcctgataacctgagtatggctgaccccaacattcgcttcctggataaactgccccagcagaccggtgaccatgctggcatcaaggatcgggtttacagcaacagcatctatgagcttctggagaacgggcagcgggcgggcacctgtgtcctggagtacgccacccccttgcagactttgtttgccatgtcacaatacagtcaagctggctttagccgggaggataggcttgagcaggccaaactcttctgccggacacttgaggacatcctggcagatgcccctgagtctcagaacaactgccgcctcattgcctaccaggaacctgcagatgacagcagcttctcgctgtcccaggaggttctccggcacctgcggcaggaggaaaaggaagaggttactgtgggcagcttgaagacctcagcggtgcccagtacctccacgatgtcccaagagcctgagctcctcatcagtggaatggaaaagcccctccctctccgcacggatttctcttgagacccagggtcaccaggccagagcctccagtggtctccaagcctctggactgggggctctcttcagtggctgaatgtccagcagagctatttccttccacagggggccttgcagggaagggtccaggacttgacatcttaagatgcgtcttgtccccttgggccagtcatttcccctctctgagcctcggtgtcttcaacctgtgaaatgggatcataatcactgccttacctccctcacggttgttgtgaggactgagtgtgtggaagtttttcataaactttggatgctagtgtacttagggggtgtgccaggtgtctttcatggggccttccagacccactccccacccttctccccttcctttgcccggggacgccgaactctctcaatggtatcaacaggctccttcgccctctggctcctggtcatgttccattattggggagccccagcagaagaatggagaggaggaggaggctgagtttggggtattgaatcccccggctcccaccctgcagcatcaaggttgctatggactctcctgccgggcaactcttgcgtaatcatgactatctctaggattctggcaccacttccttccctggccccttaagcctagctgtgtatcggcacccccaccccactagagtactccctctcacttgcggtttccttatactccacccctttctcaacggtccttttttaaagcacatctcagattacccaaaaaaaaaaaaaaaaaa.(SEQIDNO：04)

在一些实施方案中，所述编码STING的核酸是与野生型STING核酸序列具有40％至99％、45％至99％、50％至99％、55％至99％、60％至99％、65％至99％、70％至99％、75％至99％、80％至99％、85％至99％、90％至99％或95％至99％序列同一性的核酸。在一些实施方案中，所述编码STING的核酸是与野生型STING核酸序列具有40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至99％序列同一性的核酸。在一些实施方案中，所述编码STING的核酸是与野生型STING核酸序列具有40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高或者99％或更高序列同一性的核酸。

STING的氨基酸序列包括但不限于在以下文献中描述的那些：Nitta等Hepatology57(1)：46-58(2013)和Jin等J.Immunol.190(6)：2835-2843(2013)，以及在GENBANK保藏的分配有以下保藏号的那些：NM_198282.2和NP_938023.1(人)；NM_028261.1和NP_082537.1(小家鼠)；和NM_057386.4和NP_476734.1(黑腹果蝇)。

在某些实施方案中，所述STING多肽具有以下序列：

MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELRHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTGDHAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCRTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS.(SEQIDNO：05)

在另一些实施方案中，所述STING多肽具有以下序列：

MPHSSLHPSIPCPRGHGAQKAALVLLSACLVTLWGLGEPPEHTLRYLVLHLASLQLGLLLNGVCSLAEELHHIHSRYRGSYWRTVRACLGCPLRRGALLLLSIYFYYSLPNAVGPPFTWMLALLGLSQALNILLGLKGLAPAEISAVCEKGNFNVAHGLAWSYYIGYLRLILPELQARIRTYNQHYNNLLRGAVSQRLYILLPLDCGVPDNLSMADPNIRFLDKLPQQTADRAGIKDRVYSNSIYELLENGQRAGTCVLEYATPLQTLFAMSQYSQAGFSREDRLEQAKLFCQTLEDILADAPESQNNCRLIAYQEPADDSSFSLSQEVLRHLRQEEKEEVTVGSLKTSAVPSTSTMSQEPELLISGMEKPLPLRTDFS.(SEQIDNO：06)

在一些实施方案中，所述STING多肽是与野生型STING氨基酸序列具有40％至99％、45％至99％、50％至99％、55％至99％、60％至99％、65％至99％、70％至99％、75％至99％、80％至99％、85％至99％、90％至99％或95％至99％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述cGAS多肽是与野生型STING氨基酸序列具有40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至99％序列同一性的多肽。在一些实施方案中，所述STING多肽是与野生型STING氨基酸序列具有40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高或者99％或更高序列同一性的多肽。

以上方法可用于多种不同的应用中。现在，在以下的效用部分概述了某些应用。

效用

本文提供的方法和组合物可用于多种应用，其中，这样的应用包括提高受试者中I型干扰素(例如，干扰素-β)是期望的。此外，本文提供的方法和组合物可用于多种应用，其中，这样的应用包括提高受试者中STING介导的应答是期望的。所关注的具体应用包括通过给受试者提供治疗有效量的环状二核苷酸活性剂对受试者治疗受益于I型干扰素提高的疾病病况的那些。在一些例子中，可期望的是，提高健康个体中的I型干扰素或STING介导的应答，例如，用于预防疾病或病症。同样地，在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物可用于产生对疫苗的“佐剂”影响，以预防感染或其他疾病，其中所述活性剂刺激免疫记忆，以保护免于受到未来的疾病或感染。

在一些实施方案中，适于用本文描述的方法治疗的受试者包括患有免疫性或炎性疾病或病症的个体，所述免疫性或炎性疾病或病症包括但不限于，癌症、自体免疫疾病或病症、过敏反应、慢性传染病和免疫缺陷疾病或疾病。

在一些实施方案中，适于用本发明的方法治疗的受试者包括患有细胞增殖性疾病的个体，例如肿瘤性疾病(例如，癌症)。细胞增殖性疾病的特征是不期望的细胞增殖，包含但不限于，肿瘤性病症病况，例如，癌症。

细胞增殖性疾病的例子包括但不限于，内皮细胞的异常刺激(例如，动脉粥样硬化)、固体肿瘤和肿瘤转移、良性肿瘤，例如血管瘤、听神经瘤、纤维神经瘤、沙眼(trachomas)和生脓性肉芽瘤、血管功能障碍、伤口愈合异常、炎性和免疫病症、白塞病、痛风或痛风性关节炎、伴随性血管发生异常，例如，类风湿性关节炎、银屑病、糖尿病视网膜病变、其他眼部血管生成性疾病，例如早产儿视网膜病(晶状体纤维化)、黄斑变性、角膜移植物排斥、神经血管青光眼和OsterWebber综合征、银屑病、再狭窄、真菌性、寄生性和病毒性感染，例如巨细胞病毒感染。将根据本发明的方法治疗的受试者包括患有任何以上提及的疾病的任何个体。

在另一些实施方案中，适于用主题方法治疗的受试者包括已经被临床诊断为受病毒感染的个体。在一些实施方案中，所述病毒是肝炎病毒(例如，HAV、HBV、HCV、δ等)，特别地，HCV适于用本发明的方法处理。受HCV感染的个体被鉴定为他们的血液中具有HCVRNA，和/或他们的血清中具有抗HCV抗体。这样的个体包括初治个体(例如，以前没有针对HCV治疗的个体，特别是以前没有接收IFN-α基或基于利巴韦林的治疗的个体)，以及以前针对HCV治疗失效的个体。

在一些实施方案中，适于用本文提供的方法治疗的受试者包括患有神经退行性疾病或病症的个体，包括但不限于，帕金森病、阿尔兹海默病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化(ALS)。

在另一些实施方案中，适于用本发明的方法治疗的受试者包括患有多发性硬化症的个体。多发性硬化症是指自体免疫神经退行性疾病，其标志是中枢神经系统内的炎症伴有淋巴细胞攻击少突胶质细胞产生的髓磷脂、空斑形成和脱髓鞘伴有脑和脊索中的轴突髓磷脂鞘的破坏，随着时间的推移导致神经失能。通常来说，在开始时，本来健康的人出现神经症状学的急性或亚急性发作(攻击)，表现为单侧视力损失、眩晕、共济失调、运动不协调、步履困难、具有以下特征的感知受损：感觉异常、感觉迟钝、感觉缺失、小便失调直至失禁、复视、构音障碍或不同程度的肌无力直至麻痹。所述症状可为无痛的，保持数天或数周，并且然后部分或完全恢复。在一段时间后，将发生第二攻击。在第一攻击后的这段期间，患者被定义为罹患可能的MS。可能的MS患者可在数年内为未确诊的。当第二攻击发生时，临床确证的MS(CDMS)诊断形成(Posercriteria1983；C.M.Poser等，Ann.Neurol.1983；13,227)。

术语“受试者”和“患者”意为可能需要本文描述的药物方法、组合物和治疗的任何哺乳动物或非哺乳动物物种的一个或多个成员。因此，受试者和患者包括但不限于，灵长类(包含人)、犬科、猫科、有蹄类(例如，马科、牛科、猪科(例如，猪))、鸟类和其他受试者。人和具有商业价值的非人动物(例如，家畜和驯养动物)是特别关注的。

“哺乳动物”意为任何哺乳动物物种的一个或多个成员，并且以示例的方式包括，犬科动物；猫科动物；马

I型干扰素的环状二核苷酸诱导专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。