专利摘要

专利摘要

本发明公开了如式I结构所示的强心苷类化合物，R1独立的选自C1‑C2烷基、C1‑C2醛基、C1‑C2羧基，R2独立的选自R3独立的选自羟基、氢，R4选自氢、OAc。本发明的另一个目的是提供所述的强心苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为白血病、胃癌、肺癌、乳腺癌。

权利要求

1.如式I结构所示的强心苷类化合物：

其中，R1＝CHO，R3＝OH，R4＝H，即毒毛旋花子苷元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖-(1→4)-6-去氧-β-D-阿洛吡喃糖苷；

R1＝CH3，R3＝H，R4＝OAc，即5β-氢-14β-羟基-16β-乙酰氧基-强心甾-20(22)-烯-3-O-6-去氧-2，3-二甲氧基半乳吡喃糖苷；

R1＝COOH，R3＝OH，R4＝H，即5β-羟基-强心甾-20(22)-烯-19-羧基-3-O-6-去氧-2，3-二甲氧基葡萄吡喃糖苷。

2.权利要求1所述的强心苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为白血病、胃癌、肺癌、乳腺癌。

4.一种组合物，其特征在于以权利要求1所述的强心苷类化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以辅料制成。

5.权利要求4所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及具有抗肿瘤活性的强心苷类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

强心苷类药物是一类对心肌有显著兴奋作用的苷类化合物，是目前治疗心力衰竭和心房颤动的常用药物。然而从20世纪60年代末开始，有文献报道强心苷药物，如地高辛、洋地黄毒苷和毒毛花苷能够预防和治疗恶性肿瘤。随后的研究发现，强心苷能够选择性抑制人类肿瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡，但对正常细胞无明显影响。因此，强心苷很有可能成为一类新型的肿瘤治疗药物。

鹊肾树(Streblus asper Lour.)为桑科鹊肾树属植物，属于乔木或灌木，树皮深灰色，粗糙；小枝被短硬毛，幼时皮孔明显，叶革质，椭圆状倒卵形或椭圆形，花期2-4月，果期5-6月。鹊肾树产广东、海南、广西、云南南部(思茅至西双版纳，河口、金平)，常生于海拔200-950米林内或村寨附近，斯里兰卡、印度、尼泊尔、不丹、越南、泰国、马来西亚、印度尼西亚、菲律宾也有分布。鹊肾树常见于印度传统医药中，我国傣药也有提及，具有多种药用疗效：根部可用于治疗肠炎、鼻炎、癫痫、肥胖和解毒，根皮可用于治疗高热、痢疾、牙疼，叶子可防蚊虫叮咬等等。目前发现鹊肾树的化学成分包括黄酮、挥发油、脂肪酸、木脂素及强心苷，其中根部具有丰富的强心苷。因而，本发明对鹊肾树根的化学成分进行深入研究，分离得到具有抗肿瘤活性的新化合物。

发明内容

本发明的目的是要提供三种从鹊肾树根中分离得到的具有抗肿瘤活性的新化合物。

本发明的技术方案是通过以下技术方案实现的：

如式I结构所示的强心苷类化合物：

其中，R1独立的选自C1-C2烷基、C1-C2醛基、C1-C2羧基，R2独立的选自 R3独立的选自羟基、氢，R4选自氢、OAc。

R1＝CHO，R2＝ R3＝OH，R4＝H，即毒毛旋花子苷元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖-(1→4)-6-去氧-β-D-阿洛吡喃糖苷；

R1＝CH3，R2＝ R3＝H，R4＝OAc，即5β-氢-14β-羟基-16β-乙酰基-强心甾-20(22)-烯-3-O-6-去氧-2，3-二甲氧基-β-D-半乳吡喃糖苷；

R1＝COOH，R2＝ R3＝OH，R4＝H，即5β-羟基-强心甾-20(22)-烯-19-羧基-3-O-6-去氧-2，3-二甲氧基-β-D-葡萄吡喃糖苷。

发明人研究表明本发明所述的强心苷类化合物对多种肿瘤细胞，包括人急性白血病细胞HL-60、人胃癌细胞AZ521、非小细胞肿癌细胞A549、人乳腺癌细胞SK-BR-3等均具有一定的抗肿瘤活性。因此，本发明的另一个目的是提供所述的强心苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的肿瘤为白血病、胃癌、肺癌、乳腺癌。

一种组合物，以本发明所述的强心苷类化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以辅料制成。

所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

同现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明以鹊肾树根为原料，依次采用正己烷脱脂、甲醇提取、乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取、硅胶柱色谱、大孔吸附柱色谱、硅胶柱色谱、反相柱色谱及高效液相色谱，简便、快速的提取分离出新化合物。新化合物具有抗肿瘤活性，可用于指导鹊肾树根的应用，也为研究与开发新的抗肿瘤药物提供了候选化合物。

具体实施方式

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

化合物的分离纯化

取干燥的鹊肾树根2.1kg，粉碎后正己烷回流提取(鹊肾树根与正己烷的质量体积比为1∶10g/mL)共3次，每次3小时，过滤，得药渣，再用甲醇回流提取(鹊肾树根与甲醇质量的体积比1∶10g/mL)共3次，每次3小时，合并提取液，减压回收溶剂，得到140.7g鹊肾树根浸膏。浸膏加水混悬，置于分液漏斗中，用与水混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，再用与水混悬液等体积的正丁醇萃取3次，回收溶剂后，分别得到乙酸乙酯萃取物22.7g、正丁醇萃取物32.0g、水提取物55.1g。

将正丁醇萃取物上DIAION HP-20大孔吸附树脂，用甲醇-水0∶100、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20、100∶0(V/V)梯度洗脱，收集每个梯度洗脱液；合并甲醇-水60∶40、80∶20(V/V)洗脱液组分，浓缩，上硅胶柱色谱，用三氯甲烷-甲醇90∶10、87∶13(V/V)梯度洗脱，收集每个梯度洗脱液；将三氯甲烷-甲醇90∶10(V/V)洗脱液组分浓缩，上ODS柱色谱，用甲醇-水50∶50、100∶0(V/V)梯度洗脱；将甲醇-水50∶50(V/V)洗脱液组分浓缩，上硅胶柱色谱，用三氯甲烷-甲醇15∶1、0∶1(V/V)梯度洗脱，将三氯甲烷∶甲醇15∶1(V/V)洗脱液组分浓缩，用高效制备液相纯化，采用十八烷基键合硅胶色谱柱，以甲醇-水50∶50(V/V)为流动相，检测波长220nm，Capcell pak AQ column(250×10mm，5μm)，流速2.0mL/min，收集31.5-34.5分钟洗脱液组分并浓缩，将组分上硅胶柱色谱，用三氯甲烷-甲醇8∶1(V/V)洗脱得到化合物1(9.8mg)。

将乙酸乙酯萃取物上硅胶柱色谱，用正己烷-乙酸乙酯100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80、10∶90、0∶100和乙酸乙酯-甲醇100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80、10∶90、0∶100(V/V)梯度洗脱，收集每个梯度洗脱液；将乙酸乙酯-甲醇90∶10(V/V)洗脱液组分通过薄层色谱法检测合并成5个组分；将第2个组分浓缩，上硅胶柱色谱，用三氯甲烷-丙酮100∶0、10∶90(V/V)梯度洗脱，收集每个梯度洗脱液；将三氯甲烷-丙酮10∶90(V/V)洗脱液组分浓缩，用高效制备液相纯化，采用十八烷基键合硅胶色谱柱，以甲醇-水50∶50(V/V)为流动相，示差检测器，Pegasil ODS SP100(250×10mm，5μm)，流速2.5mL/min，得到化合物2(3.6mg)。将第4个组分浓缩，上硅胶柱色谱，用正己烷-丙酮60∶40、50∶50、45∶55、40∶60、35∶65、20∶80、0∶100(V/V)梯度洗脱，收集每个梯度洗脱液；将正已烷-丙酮50∶50(V/V)洗脱液组分浓缩，上ODS柱色谱，用甲醇-水30∶70、60∶40、50∶50(V/V)梯度洗脱，收集每个梯度洗脱液；将甲醇-水30∶70(V/V)洗脱液组分浓缩，上硅胶柱色谱，用正己烷-丙酮90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70(V/V)梯度洗脱，收集每个梯度洗脱液；将正己烷-丙酮60∶40(V/V)洗脱液组分浓缩，用高效制备液相纯化，采用十八烷基键合硅胶色谱柱，以甲醇-水60∶40(V/V)为流动相，示差检测器，PegasilODS SP100(250×10mm，5μm)流速2.0mL/min，得到化合物3(5.1mg)。

化合物的结构鉴定

(1)化合物1为白色无定形粉末，紫外254nm照射下无暗斑，365nm照射下无荧光，Molish反应阳性，1％香草醛-浓硫酸加热后显绿色，Kedde试剂显砖红色，提示该化合物是强心苷类化合物。

高分辨质谱：m/z 719.3233[M+Na]+(calcd 719.3255)，推测分子式：C35H52O14，分子量：696，10个不饱和度。

1H-NMR数据中显示有α，β-五元不饱和内酯环特征峰：δH 6.15(1H，s，H-22)，5.30(1H，d，J＝18.0Hz，H-21a)，5.04(1H，d，J＝18.0Hz，H-21b)。此外，显示有醛基[δH 10.41(1H，s，H-19)]和甲基[δH 1.01(3H，s，H-18)]，以及次甲基[δH 2.79(1H，m，H-17)，4.44(1H，m，H-3)]，经过与已知化合物strophanthidin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-O-β-D-diginopyranosyl-(1→4)-O-β-D-oleandropyranosyl-(1→4)-O-β-D-digitoxopyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranoside的苷元比对，发现两化合物苷元部分基本一致，推测该化合物的苷元是毒毛旋花子苷元(参考文献：S.Kubo，M.Kuroda，Y.Matsuo，D.Masatani，H.Sakagami，Y.Mimakia，Chemical & PharmaceuticalBulletin，2012，60，1275-1282.)。另外，δH 5.39(1H，d，J＝7.8Hz，H-1′)，5.52(1H，s，H-1″)，1.41(3H，d，J＝5.4Hz，H-6′)，1.48(3H，d，J＝6.0Hz，H-6″)和δC99.5(C-1′)，104.9(C-1″)推测该化合物苷元连有两个甲基糖。通过1H-1H COSY，HSQC和HMBC分析推测糖分别是6-去氧-β-D-阿洛糖和α-L-鼠李糖(参考文献：[1]X.S.Li，M.J.Hu，J.Liu，Fitoterapia，2014，9，71-77.[2]Z.H.Lei，Z.X.Jin，Y.Li，Phytochemistry，1998，49，1801-1803.)。HMBC中H-1′/C-3，H-1″/C-4′显示相关信号，表示6-去氧-β-D-阿洛糖连在C-3，α-L-鼠李糖连在C-4′。综上所述，化合物1被鉴定为毒毛旋花子苷元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖-(1→4)-6-去氧-β-D-阿洛吡喃糖苷，英文名：strophanthidin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-6-deoxy-β-D-allopyranoside。

化合物1的结构

(2)化合物2为白色无定形粉末，紫外254nm照射下无暗斑，365nm照射下无荧光，Molish反应阳性，1％香草醛-浓硫酸加热后显绿色，Kedde试剂显砖红色，提示该化合物是强心苷类化合物。

高分辨质谱：m/z 629.3308[M+Na]+(calcd 629.3302)，推测分子式：C33H50O10，分子量：606，9个不饱和度。

1H-NMR中显示α，β-五元不饱和内酯环特征峰：δH 5.96(1H，s，H-22)，4.97(1H，dd，J＝18.4，1.6Hz，H-21a)，4.85(1H，dd，J＝18.4，1.6Hz，H-21b)。由δH 0.92(3H，s，H-19)，0.93(3H，s，H-18)推测有两个甲基，由δH 5.47(1H，td，J＝9.2，2.4Hz，H-16)，1.97(3H，s，OCOCH3-16)和δC 170.6(OCOCH3-16)，21.1(OCOCH3-16)推测有一个乙酰基。此外，δH 3.20(1H，d，J＝16.4Hz，H-17)和4.06(1H，br s，H-3)，综合以上氢谱数据推测化合物1母核是夹竹桃苷元(参考文献：[1]G.M.Cabrera，M.E.Deluca，Phytochemistry，1993，32，1253-1259.[2]Y.Rifai，M.A.Arai，T.Koyano，T.Kowithayakorn，M.Ishibashi，J Nat Med，2011，65，629-632.)由δH 4.27(1H，d，J＝7.6Hz)和δC 101.1推测化合物2连有一个β构型的糖，通过与strebloside比对，化合物2的糖部分与strebloside的基本一致，通过2D-NMR数据进一步确定糖是6-去氧-2，3-二甲基-β-D-半乳糖(参考文献：M.Fiebig，C.Y.Duh，J.M.Pezzuto，A.D.Kinghorn，N.R.Farnsworth，Journal of Natural Products，1985，48，981-985.)。通过H-1′和C-3之间的HMBC相关信号，确定了糖连在C-3。综上所述，化合物2被鉴定为5β-氢-14β-羟基-16β-乙酰基-强心甾-20(22)-烯-3-O-6-去氧-2，3-二甲氧基-β-D-半乳吡喃糖苷，英文名：5βH-16β-acetylkamaloside。

化合物2的结构

(3)化合物3为浅黄色无定形粉末，紫外254nm照射下无暗斑，365nm照射下无荧光，Molish反应阳性，1％香草醛-浓硫酸加热后显绿色，Kedde试剂显砖红色，提示该化合物是强心苷类化合物。

高分辨质谱：m/z 617.2944[M+Na]+(calcd 617.2938)，推测分子式：C31H46O11，分子量：594，9个不饱和度。

1H-NMR中显示苷元与mansonin的苷元类似，不同的是化合物3将C-10的取代基由醛基(δC 209.3)置换成羧基(δC 176.5)，经过与文献的比对，化合物3的苷元推测是strophanthidinic acid(参考文献：H.S.Chang，M.Y.Chiang，H.Y.Hsu，Phytochemistry，2013，87，86-95.)。此外，δH4.37(1H，d，J＝7.6Hz，H-1′)和δC100.0(C-1′)推测化合物3连有一个β构型的糖。通过对比文献，化合物3的糖与mansonin基本一致，利用2D-NMR数据进一步确定糖是6-去氧-2，3-二甲基-β-D-葡萄糖(参考文献：M.Fiebig，C.Y.Duh，J.M.Pezzuto，A.D.Kinghorn，N.R.Farnsworth，Journal of Natural Products，1985，48，981-985.)。HMBC中H-1′和C-3存在相关，推测糖连在C-3。综上所述，化合物3被鉴定为5β-羟基-强心甾-20(22)-烯-19-羧基-3-O-6-去氧-2，3-二甲氧基-β-D-葡萄吡喃糖苷，英文名：mansonin-19-carboxylic acid。

化合物3的结构

表1 化合物1-3的1H和13C核磁数据归属(δ单位：ppm，J单位：Hz)

a1H(600MHz)，13C(150MHz)NMR，氘代吡啶

b1H(400MHz)，13C(100MHz)NMR，氘代氯仿

实施例2 化合物的抗肿瘤活性测定

人急性白血病细胞HL60，肿瘤细胞为人胃癌细胞AZ521，非小细胞肺癌细胞A549，人乳腺癌细胞SKBR3从中国科学院细胞库购买。

顺铂溶液的配制：先称取3.00mg顺铂溶于200μL DMSO，得到浓度为50.0mM的顺铂溶液。取10.0μL浓度为50.0mM的顺铂溶液，加入990.0μL DMEM培养基得到浓度为500.0μM的顺铂溶液；取100.0μL浓度为500.0μM的顺铂溶液，加入900.0μL DMEM培养基得到浓度为50.0μM的顺铂溶液；取960.0μL浓度为50.0μM的顺铂溶液，加入240.0μL DMEM培养基得到浓度为40.0μM的顺铂溶液；取750.0μL浓度为40.0μM的顺铂溶液，加入250.0μL DMEM培养基得到浓度为30.0μM的顺铂溶液；取600.0μL浓度为30.0μM的顺铂溶液，加入300.0μL DMEM培养基得到浓度为20.0μM的顺铂溶液；取400.0μL浓度为20.0μM的顺铂溶液，加入400.0μL DMEM培养基得到浓度为10.0μM的顺铂溶液；取400.0μL浓度为10.0μM的顺铂溶液，加入400.0μLDMEM培养基得到浓度为5.0μM的顺铂溶液；取400.0μL浓度为5.0μM的顺铂溶液，加入400.0μL DMEM培养基得到浓度为2.5μM的顺铂溶液；取400.0μL浓度为2.5μM的顺铂溶液，加入400.0μL DMEM培养基得到浓度为1.25μM的顺铂溶液；取400.0μL浓度为1.25μM的顺铂溶液，加入400.0μL DMEM培养基得到浓度为0.625μM的顺铂溶液。

受试化合物样液的配制：

1)先称取2.79mg化合物1溶于200μL DMSO，得到浓度为20.0mM的受试化合物1溶液；取10.0μL浓度为20.0mM的受试化合物1溶液，加入990.0μL DMEM培养基得到浓度为200.0μM的受试化合物1溶液；取10.0μL浓度为200.0μM的受试化合物1溶液，加入990.0μLDMEM培养基得到浓度为2.0μM受试化合物1溶液；取100.0μL浓度为200.0μM的受试化合物1溶液，加入900.0μL DMEM培养基得到浓度为200.0nM的受试化合物1溶液；取500.0μL浓度为200.0nM的受试化合物1溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为100.0nM的受试化合物1溶液；取500.0μL浓度为100.0nM的受试化合物1溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为50.0nM的受试化合物1溶液；取500.0μL浓度为50.0nM的受试化合物1溶液，加入500.0μLDMEM培养基得到浓度为25.0nM的受试化合物1溶液；取500.0μL浓度为25.0nM的受试化合物1溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为12.5nM的受试化合物1溶液；取500.0μL浓度为12.5.0nM的受试化合物1溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为6.25nM的受试化合物1溶液；取500.0μL浓度为6.25nM的受试化合物1溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为3.125nM的受试化合物1溶液；取500.0μL浓度为3.125nM的受试化合物1溶液，加入500.0μLDMEM培养基得到浓度为1.5625nM受试化合物1溶液；取500.0μL浓度为1.5625nM的受试化合物1溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为0.7825nM的受试化合物1溶液。

2)先称取2.42mg化合物2溶于200μL DMSO，得到浓度为20.0mM的受试化合物2溶液；取10.0μL浓度为20.0mM的受试化合物2溶液，加入990.0μL DMEM培养基得到浓度为200.0μM的受试化合物2溶液；取10.0μL浓度为200.0μM的受试化合物2溶液，加入990.0μLDMEM培养基得到浓度为2.0μM的受试化合物2溶液；取500.0μL浓度为2.0μM的受试化合物2溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为2.0μM的受试化合物2溶液；取500.0μL浓度为1.0μM的受试化合物2溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为0.5μM的受试化合物2溶液；取500.0μL浓度为0.5μM的受试化合物2溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为0.25μM的受试化合物2溶液；取500.0μL浓度为0.25μM的受试化合物2溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为0.125μM的受试化合物2溶液；取500.0μL浓度为0.125μM的受试化合物2溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为0.0625μM的受试化合物2溶液；取500.0μL浓度为0.0625μM的受试化合物2溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为0.3125μM的溶2；取500.0μL浓度为0.03125μM的受试化合物2溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为0.015125μM的受试化合物2溶液；取500.0μL浓度为0.015125μM的受试化合物2溶液，加入500.0μL DMEM培养基得到浓度为0.0075625μM的受试化合物2溶液。

3)先称取2.97mg化合物3溶于50μL DMSO，得到浓度为100.0mM的受试化合物3溶液；取10.0μL浓度为1.0mM的受试化合物3溶液，加入990.0μL DMEM培养基得到浓度为1.0mM的受试化合物3溶液；取200.0μL浓度为100.0μM的受试化合物3溶液，加入1800.0μL DMEM培养基得到浓度为100.0μM的受试化合物3溶液；取1120.0μL浓度为100.0μM的受试化合物3溶液，加入280.0μL DMEM培养基得到浓度为80.0μM的受试化合物3溶液；取900.0μL浓度为80.0μM的受试化合物3溶液，加入300.0μL DMEM培养基得到浓度为60.0μM的受试化合物3溶液；取600.0μL浓度为60.0μM的受试化合物3溶液，加入300.0μL DMEM培养基得到浓度为40.0μM的受试化合物3溶液；取400.0μL浓度为40.0μM的受试化合物3溶液，加入400.0μLDMEM培养基得到浓度为20.0μM的受试化合物3溶液；取400.0μL浓度为20.0μM的受试化合物3溶液，加入400.0μL DMEM培养基得到浓度为10.0μM的受试化合物3溶液；取400.0μL浓度为10.0μM的受试化合物3溶液，加入400.0μL DMEM培养基得到浓度为5.0μM的受试化合物3溶液；取400.0μL浓度为5.0μM的受试化合物3溶液，加入400.0μL DMEM培养基得到浓度为2.5μM的受试化合物3溶液；取400.0μL浓度为2.5μM的受试化合物3溶液，加入400.0μL DMEM培养基得到浓度为1.25μM的受试化合物3溶液。

取对数生长期的人急性白血病细胞HL60，以8×103个/孔的密度接种到96孔板中，每孔加入100μL IMDM培养基，试验组接着将受试化合物溶液以不同浓度梯度加入到各孔中，每孔加入100μL受试化合物溶液，顺铂溶液以浓度梯度(50μM、40μM、30μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM)加入到各孔中，每孔加入100μL顺铂溶液，每组设置三个平行孔。另设3孔加入100μL IMDM培养基作为对照组。孵育48h，取出96孔板，避光条件下加入20μL的CCK-8(碧云天生物技术公司)，继续避光孵育3h，使用酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度值，记录结果，计算细胞的抑制率。

取对数生长期的人胃癌细胞AZ521或非小细胞肺癌细胞A549或人乳腺癌细胞SKBR3细胞，0.5％胰酶消化后收集细胞，以5×103个/孔的密度接种到96孔板中，每孔加入100μL含10％胎牛血清的DMEM培养基，孵育24h待细胞贴壁后，用移液枪吸弃上清液。试验组：将受试化合物溶液以不同浓度梯度加入到各孔中，每孔加入100μL受试化合物溶液，每组设置三个平行孔。顺铂溶液以浓度梯度(50μM、40μM、30μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM)加入到各孔中，每孔加入100μL顺铂溶液，每组设置三个平行孔。另设3孔加入100μL DMEM培养基作为对照组。继续孵育48h，取出96孔板，避光条件下加入10μL 5mg/mL的MTT溶液，继续避光孵育3h，使用酶标仪在570nm波长下测定各孔的吸光度值，记录结果，计算细胞的抑制率：

细胞抑制率(％)＝[(对照组吸光度值-实验组吸光值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)]×100％

其中化合物对细胞半抑制浓度IC50由剂量效应曲线得到。

表2 化合物对HL60、AZ521、A549与SKBR3细胞的抑制作用

ND：未测定

结果显示，化合物1对胃癌细胞、乳腺癌细胞具有细胞毒性；化合物2、3对人急性白血病细胞、胃癌细胞、肺腺癌细胞、乳腺癌细胞具有细胞毒性。表明本发明3个强心苷类化合物能够抑制肿瘤细胞的生长，有可能发展成为具有抗肿瘤作用的药物，丰富了鹊肾树根的研究。

从鹊肾树根部分离的具有抗肿瘤活性的强心苷类化合物及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。