专利摘要

专利摘要

本发明提供了一种高纯度藜芦胺(Veratramine)和介芬胺(Jervine)的制备方法。该方法将藜芦药材原料粉碎、乙醇回流提取、大孔吸附树脂富集、洗脱(解吸附)、浓缩得到藜芦总甾体生物碱、柱色谱纯化、重结晶、干燥制得单体成品。以本方法制成的藜芦胺和介芬胺纯度可达90％以上，本发明工艺简便、产率高，宜于工业化生产。

权利要求

1、一种高纯度藜芦胺和介芬胺的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)藜芦药材原料的提取：藜芦药材粉碎后，在常压提取装置中用60～90％乙醇回流提取三次，每次1～3小时，合并提取液过滤浓缩得浓缩液；

(2)大孔吸附树脂富集：

浓缩液加2～5倍体积的水稀释后，加入到大孔吸附树脂柱上，依次以30倍体积的去离子蒸馏水洗脱大极性杂质，再以20倍体积的0.05～0.5％的碱性水溶液进行洗脱，继以20倍体积的10～60％的乙醇溶液洗脱进行脱色，再以70～90％的酒精洗脱得到藜芦总甾体生物碱的洗脱液；

(3)色谱柱纯化：

洗脱液减压浓缩到无醇味，进行色谱柱层析，流动相洗脱，薄层层析检测，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液分别减压浓缩至干，重结晶，过滤，干燥，得到高纯度藜芦胺和介芬胺。

2、根据权利要求1的方法，其特征在于所述步骤(1)大孔吸附树脂柱为AB-8、D101、ZTC-1或Diaion HP20大孔树脂柱。

3、根据权利要求1的方法，其特征在于所述步骤(2)碱性水溶液为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙水溶液。

4、根据权利要求1的方法，其特征在于所述步骤(3)色谱柱填料为硅胶、氧化铝或反相硅胶。

5、根据权利要求1的方法，其特征在于所述步骤(3)的流动相为：硅胶色谱，石油醚∶乙酸乙酯2∶1～1∶2；氧化铝色谱，石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶氨水7∶5∶1∶0.1～3∶5∶1∶0.1；反相硅胶色谱，甲醇∶水50∶50～70∶30或乙醇∶水40∶60～70∶30。

6、根据权利要求1的方法，其特征在于所述步骤(3)采用色谱方法分离纯化藜芦胺或介芬胺，重结晶溶剂为60％～100％的乙醇或甲醇溶液；甲醇∶水、乙醇∶水混合体系重结晶。

7、根据权利要求1的方法，其特征在于步骤(3)得到的单体是高纯度的高纯度藜芦胺或介芬胺，含量均在90～100％。

说明书

技术领域：

本发明涉及药物化学。具体涉及一种以中药材藜芦为原料制备高纯度藜芦胺(Veratramine)和介芬胺(Jervine)的方法。

背景技术：

藜芦属(Veratrum Linn.)为百合科(Liliaceae)植物，世界上约有40种，据《中国植物志》记载中国有13个种和一个变种。中医用藜芦的根和根茎入药，用于中风痰壅，癫痫、喉痹不通及疥癣和恶疮。藜芦属植物化学成分包括甾体生物碱类化合物、茋类化合物、二肽类、黄酮类及其它类化合物。其中生物碱是其主要活性成分。现代研究表明，藜芦具有降血压、抗肿瘤等作用，其中藜芦甾体生物碱，尤其是藜芦胺和介芬胺为主要生理活性成分。目前，在藜芦甾体生物碱的制备方面，国内外尚未见高纯度藜芦胺和介芬胺的工业制备研究报道。而实验室研究报道，藜芦甾体生物碱的制备方法主要有醇提取后，酸水溶解、碱沉淀法，采用这种方法，藜芦甾体生物碱损失极大，收率低，生产成本高；另一种方法是采用醇类有机溶剂提取，浓缩后，以不同极性的有机溶剂，如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等萃取富集，但采用此方法，有机溶剂残留高、毒性大、操作步骤复杂，杂质含量高、不适宜工业生产操作等缺点。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计操作简单、适宜工业生产藜芦胺和介芬胺的制备方法。

本发明提供了一种高纯度藜芦胺(Veratramine)和介芬胺(Jervine)的制备方法。该方法包括下列步骤：

(1)藜芦药材原料的提取：

藜芦药材粉碎后，在常压提取装置中用60～90％乙醇回流提取三次，每次1～3小时，合并提取液过滤浓缩得浓缩液；

(2)大孔吸附树脂富集：

浓缩液加2～5倍体积的水稀释后，加入到大孔吸附树脂柱上，依次以30倍体积的去离子蒸馏水洗脱大极性杂质，再以20倍体积的0.05～0.5％的碱性水溶液进行洗脱，继以20倍体积的10～60％的乙醇溶液洗脱进行脱色，再以70～90％的酒精洗脱得到藜芦总甾体生物碱的洗脱液；

(3)色谱柱纯化：

洗脱液减压浓缩到无醇味，进行色谱柱层析，流动相洗脱，薄层层析检测，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液分别减压浓缩至干，重结晶，过滤，干燥，得到高纯度藜芦胺和介芬胺。

本发明方法所述大孔吸附树脂柱为AB-8、D101、ZTC-1或Diaion HP20大孔树脂柱。

所述碱性水溶液为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙水溶液。

色谱柱填料为硅胶、氧化铝或反相硅胶。

色谱流动相为：硅胶色谱，石油醚∶乙酸乙酯2∶1～1∶2；氧化铝色谱，石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶氨水7∶5∶1∶0.1～3∶5∶1∶0.1；反相硅胶色谱，甲醇∶水50∶50～70∶30或乙醇∶水40∶60～70∶30。

重结晶溶剂为60％～100％的乙醇或甲醇溶液。

本发明用乙醇水溶液进行提取，经大孔吸附树脂柱富集后，进行柱色谱纯化，代替传统的酸碱法和有机溶剂萃取法，具有自动化程度高、操作简便、产率高的优点，以克服现有技术上的不足之处，更适用于工业生产。

大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的一类有机高聚物吸附剂，具有良好的吸附性能，近十余年来逐渐被应用于中草药化学成分的分离和中药新药的开发研制。大孔吸附树脂是一类以吸附为特点，对有机物有浓缩分离作用的高分子聚合物，在水溶液中，大孔吸附树脂对有机物具有良好的吸附选择性，可以固相萃取的方法，在吸附藜芦甾体生物碱的同时将糖类等大极性成分去除。大孔吸附树脂的理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物的选择性较好，不受无机盐类及强离子低分子化合物的影响。通常，酸性化合物在碱性溶液中被解吸附，碱性化合物在酸性溶液中被解吸附。藜芦甾体生物碱为碱性化合物，而植物提取物中的色素成分多为酸性化合物，因此，本发明采用稀碱溶液对大孔吸附树脂柱洗脱，可最大限度的将色素杂质洗脱，而藜芦甾体生物碱不受影响，提高产品的纯度。藜芦甾体生物碱富集于在大孔吸附树脂柱的70～90％乙醇洗脱部位。继而采用色谱方法分离纯化藜芦总甾体生物碱，硅胶色谱：石油醚∶乙酸乙酯系统；氧化铝色谱：石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶氨水系统；反相硅胶色谱：甲醇∶水、乙醇∶水混合体系。分别收集富含藜芦胺和介芬胺的洗脱部位，经浓缩去除有机溶剂后，在甲醇∶水、乙醇∶水混合体系重结晶，过滤，可以得到高纯度的藜芦胺和介芬胺，含量达到90～100％。本发明采用大孔吸附树脂法富集总生物碱，可最大限度的减少藜芦生物碱的损失，进一步提高产品收率。

本发明方法制备得到的藜芦胺和介芬胺单体化合物纯度高于98％，通过光谱数据(¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、MS、UV)，单体化合物经鉴定结构为藜芦胺(Veratramine)和介芬胺(Jervine)。

具体实施方式：

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

实施例1：

高纯度藜芦胺(Veratramine)和介芬胺(Jervine)的制备藜芦药材5Kg粉碎后，在常压提取装置中用60％乙醇回流提取三次，每次1小时，提取液过滤减压浓缩至无醇味，浓缩液2倍体积的水稀释加水稀释后，加入AB-8大孔吸附树脂柱上，以150L的去离子蒸馏水洗脱，再以100L的0.05％的氢氧化钠水溶液进行洗脱，继以100L的10～60％的乙醇溶液洗脱进行脱色，再以70～90％的酒精洗脱藜芦生物碱类成分，洗脱液减压浓缩到无醇味小体积，与200g硅胶混匀后，进行硅胶色谱柱层析，以石油醚∶乙酸乙酯2∶1～1∶2流动相洗脱，薄层层析跟踪，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液减压浓缩至干后在60％乙醇溶液中进行重结晶，过滤，干燥，得到纯度为97％的藜芦胺21g和98％的介芬胺14.6g。两个化合物的鉴定数据见表。

实施例2：

藜芦药材5Kg粉碎后，在常压提取装置中用75％乙醇回流提取三次，每次2小时，提取液过滤减压浓缩至无醇味，浓缩液4倍体积的水稀释加水稀释后，加入D101大孔吸附树脂柱上，以150L的去离子蒸馏水洗脱，再以100L的0.1％的氢氧化钾水溶液进行洗脱，继以100L的10～60％的乙醇溶液洗脱进行脱色，再以70～90％的酒精洗脱藜芦生物碱类成分，洗脱液减压浓缩到无醇味，与250g氧化铝混匀后，进行氧化铝色谱柱层析，以石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶氨水7∶5∶1∶0.1～3∶5∶1∶0.1洗脱，薄层层析跟踪，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液减压浓缩至干后在75％乙醇溶液中进行重结晶，过滤，干燥得到纯度为92％藜芦胺23.5g和93％的介芬胺13.3g。

实施例3：

藜芦药材10Kg粉碎后，在常压提取装置中用90％乙醇回流提取三次，每次3小时，提取液过滤减压浓缩至无醇味，浓缩液5倍体积的水稀释加水稀释后，加入ZTC-1大孔吸附树脂柱上，以300L的去离子蒸馏水洗脱，再以200L的0.5％的氢氧化钙水溶液进行洗脱，继以200L的10～60％的乙醇溶液洗脱进行脱色，再以70～90％的酒精洗脱藜芦生物碱类成分，洗脱液减压浓缩到无醇味，与400g反相硅胶混匀后，进行反相硅胶色谱柱层析，以甲醇∶水50∶50～70∶30洗脱，薄层层析跟踪，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液减压浓缩至干后在甲醇溶液中进行重结晶，过滤，干燥得到纯度为96％的藜芦胺46.4g和98％的介芬胺21.9g。

实施例4：

藜芦药材7.5Kg粉碎后，在常压提取装置中用80％乙醇回流提取三次，每次2小时，提取液过滤减压浓缩至无醇味，浓缩液3倍体积的水稀释加水稀释后，加入Diaion HP20大孔吸附树脂柱上，以250L的去离子蒸馏水洗脱，再以170L的0.2％的氢氧化钠水溶液进行洗脱，继以170L的10～60％的乙醇溶液洗脱进行脱色，再以70～90％的酒精洗脱藜芦生物碱类成分，洗脱液减压浓缩到无醇味，与300g硅胶混匀后，进行硅胶色谱柱层析，以石油醚∶乙酸乙酯2∶1～1∶2洗脱，薄层层析跟踪，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液减压浓缩至干后在60％甲醇溶液中进行重结晶，过滤，干燥得到纯度为95％的藜芦胺32.1g和96％的介芬胺18.4g。

实施例5：

藜芦药材20Kg粉碎后，在常压提取装置中用85％乙醇回流提取三次，每次1小时，提取液过滤减压浓缩至无醇味，浓缩液4倍体积的水稀释加水稀释后，加入AB-8大孔吸附树脂柱上，以600L的去离子蒸馏水洗脱，再以400L的0.5％的氢氧化钾水溶液进行洗脱，继以400L的10～60％的乙醇溶液洗脱进行脱色，再以70～90％的酒精洗脱藜芦生物碱类成分，洗脱液减压浓缩到无醇味，与400g氧化铝混匀后，进行氧化铝色谱柱层析，以石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶氨水7∶5∶1∶0.1～3∶5∶1∶0.1洗脱，薄层层析跟踪，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液减压浓缩至干后在80％甲醇溶液中进行重结晶，过滤，干燥得到纯度90.5％藜芦胺59.4g和92％的介芬胺35.2g。

实施例6：

藜芦药材10Kg粉碎后，在常压提取装置中用70％乙醇回流提取三次，每次3小时，提取液过滤减压浓缩至无醇味，浓缩液5倍体积的水稀释加水稀释后，加入Diaion HP20大孔吸附树脂柱上，以300L的去离子蒸馏水洗脱，再以200L的0.1％的氢氧化钠水溶液进行洗脱，继以200L的10～60％的乙醇溶液洗脱进行脱色，再以70～90％的酒精洗脱藜芦生物碱类成分，洗脱液减压浓缩到无醇味，与200g反相硅胶混匀后，进行反相硅胶色谱柱层析，以乙醇∶水40∶60～70∶30洗脱，薄层层析跟踪，分别收集藜芦胺和介芬胺部位，收集液减压浓缩至干后在乙醇中进行重结晶，过滤，干燥得到纯度99％藜芦胺21.6g和98％的介芬胺13.1g。

两个化合物的结构鉴定数据如下：

藜芦胺

白色针状结晶，mp：214～216℃，Dragendorff试剂显橘红色；

ESI-MS：m/z 410[M+H]⁺，分子式为C₂₇H₃₉NO₂；

¹H-NMR和¹³C-NMR(CDCl₃，δ)见Table1。

Table 1化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR数据(δ/ppm，J/Hz)

介芬胺

白色针晶，mp：236～238℃，Dragendorff试剂显橘红色；

ESI-MS给出m/z426[M+H]⁺，分子式为C₂₇H₃₉NO₃；

¹H-NMR和¹³C-NMR(CD₃OD+CDCl₃，δ)见Table 2。

Table2化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR数据(δ/ppm，J/Hz)

高纯度藜芦胺和介芬胺的制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。