专利摘要

专利摘要

本发明提供了具有如SEQ ID NO：19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288所示的氨基酸序列的肽，以及具有上述氨基酸序列并且其中替换、删除或添加了1个、2个或多个(例如最多5个)氨基酸的肽，这些肽具有细胞毒T细胞诱导能力。本发明还提供了用于治疗或预防与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10的过表达相关的疾病(例如癌症)的药物，其含有一种或多种这样的肽作为活性成分。本发明的肽还可以用作疫苗。

说明书

技术领域

本专利申请要求获得2007年2月21日提交的美国临时专利申请60/902,949的权利，本文以提述方式并入其全部内容用于所有目的。

本发明涉及生物科学领域，更具体地，涉及癌症治疗领域。特别地，本发明涉及新型免疫原性肽，其可极其有效地用作癌症疫苗，本发明还涉及包含这些肽的用于治疗和预防肿瘤的药物。

背景技术

已经证明，CD8⁺细胞毒T淋巴细胞(CTL)可以识别来源于呈递在MHC-I类分子上的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens，TAA)的表位肽，并随后裂解肿瘤细胞。自从第一例TAA-MAGE家族被发现以来，使用免疫学方法已经发现了许多其它的TAA(Boon T.(1993)Int J Cancer 54：177-80.；BoonT.et al.，(1996)J Exp Med 183：725-9.；van der Bruggen P et al.，(1991)Science254：1643-7.；Brichard V et al.，(1993)J Exp Med 178：489-95.；Kawakami Y etal.，(1994)J Exp Med 180：347-52.)。现在，它们中的一些作为免疫治疗的靶标已经用于临床开发。迄今发现的TAA包括MAGE(van der Bruggen P et al.，(1991)Science 254：1643-7.)、gp100(Kawakami Y et al.，(1994)J Exp Med 180：347-52.)、SART(Shichijo S et al.，(1998)J Exp Med 187：277-88.)和NY-ESO-1(Chen Y.T.et al.，(1997)Proc.Natl.Acd.Sci.USA，94：1914-8.)。另一方面，某些已经证实在肿瘤细胞中在一定程度上特异过表达的基因产物也显示可以被识别作为用于诱导细胞免疫响应的靶标。这些基因产物包括p53(UmanoY et al.，(2001)Br J Cancer，84：1052-7.)，HER2/neu(Tanaka H et al.，(2001)Br JCancer，84：94-9.)，CEA(Nukaya I et al.，(1999)Int.J.Cancer 80，92-7.)等。

尽管在有关TAA的基础和临床研究中已经取得了显著的进展(Rosenberg SA et al.，(1998)Nature Med，4：321-7.；Mukherji B.et al.，(1995)Proc Natl Acad Sci USA，92：8078-82.：Hu X et al.，(1996)Cancer Res，56：2479-83.)，但是目前可用的适于癌症治疗的候选TAA数目非常有限。在癌细胞中大量表达并且其表达仅限于癌细胞的TAA应当是免疫治疗靶标的有希望的候选物。

HLA-A24和HLA-A0201都是日本人和白种人中的常见HLA等位基因(Date Y et al.，(1996)Tissue Antigens 47：93-101.；Kondo A et al.，(1995)JImmunol 155：4307-12.；Kubo RT et al.，(1994)J Immunol 152：3913-24.；Imanishi et al.，Proceeding of the eleventh International HistocompatibilityWorkshop and Conference Oxford University Press，Oxford，1065(1992)；Williams F et al.，(1997)Tissue Antigen 49：129-33.)。因此，由这些HLA等位基因呈递的癌抗原肽在治疗日本人和白种人患者的癌症方面可能特别有用。而且，已知低亲和性CTL的体外诱导通常是通过暴露于高浓度的肽，从而在抗原呈递细胞(APC)上产生高水平的可以有效激活这些CTL的特异肽/MHC复合体(Alexander-Miller et al.，(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93：4102-7.)。

最近，HLA-1类结合肽序列可以用算法进行预测(Jounal ofImmunological Methods，(1995)，Vol.185，pp 181-190，J.Immunol.，(1994)，Vol.152，pp 163-175，protein science，(2000)，Vol.9，pp.1838-1846)。然而，很难说预测的表位肽能够被切割成合适的大小，并在靶细胞表面上与HLA分子一起表达，以及被CTL识别。而且，所述的算法，例如BIMAS(http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform)(Parker KC，et al.，(1994)J Immunol.；152(1)：163-75.；Kuzushima K，et al.，(2001)Blood.；98(6)：1872-81.))，虽然能够提示HLA分子结合肽，但是所提示的肽并不非常严格(Bachinsky MM，et.al.，Cancer Immun.2005Mar 22；5：6.)。因此，TAA筛选仍然存在大量挑战和困难。

最近在cDNA微阵列技术中取得的进展已经使人们能够构建出与正常细胞相比较的恶性细胞的基因表达谱(Okabe，H.et al.，(2001)Cancer Res.，61，2129-37.；Lin YM.et al.，(2002)Oncogene，21；4120-8.；Hasegawa S.et al.，(2002)Cancer Res 62：7012-7.)。借助这种方法能够更全面地理解癌细胞的复杂本质和癌发生的机制，并使得鉴定在肿瘤中表达失调的基因更加容易(Bienz M.et al.，(2000)Cell 103，311-20.)。在已经鉴定的在癌症中被上调的转录本中，最近发现了CDH3(GenBank Accession No.NM 001793；SEQ IDNos.1，2)，EPHA4(GenBank Accession No.L36645；SEQ ID Nos.3，4)，ECT2(GenBank Accession No.AY376439；SEQ ID Nos.5，6)，HIG2(GenBankAccession No.NM_013332；SEQ ID Nos.7，8)INHBB(GenBank Accession No.NM_002193；SEQ ID Nos.9，10)，KIF20A(GenBank  Accession No.NM_005733；SEQ ID Nos.11，12)，KNTC2(GenBank Accession No.AF017790；SEQ ID Nos.13，14)，TTK(GenBank Accession N o.NM_003318；SEQ IDNos.15，16)和URLC10(GenBank Accession No.NM_017527；SEQ ID Nos.17，18)。这里通过提述方式并入上述引文的全部内容。这些基因在所分析案例(见下文)的各种癌组织的肿瘤细胞中被特异上调，本发明人对它们特别感兴趣。因此，衍生自CDH3，EPHA4，ECT2，HIG2，INHBB，KIF20A，KNTC2，TTK和URLC10的免疫原性肽可用于选择性杀死表达这些抗原的肿瘤细胞。本发明解决了这个需求，以及别的需求。

因为细胞毒药物例如M-VAC通常导致严重的不良反应，很明显，基于已得到充分表征的作用机制，细心选择新型的靶分子对于开发副作用风险最小的有效抗癌药物是非常有用的。为了这个目标，前人已经对不同癌症和正常人类组织进行了表达谱分析。这些研究发现了多种在癌症中特异过表达的基因(Lin YM，et al.，Oncogene.2002Jun 13；21：4120-8.；Kitahara O，etal.，Cancer Res.2001May 1；61：3544-9.；Suzuki C，et al.，Cancer Res.2003Nov1；63：7038-41.；Ashida S，Cancer Res.2004Sep 1；64：5963-72.；Ochi K，et al.，IntJ Oncol.2004Mar；24(3)：647-55.；KanetaY，et al.，Int J Oncol.2003Sep；23：681-91.；Obama K，Hepatology.2005Jun；41：1339-48.；Kato T，et al.，Cancer Res.2005Jul 1；65：5638-46.；Kitahara O，et al.，Neoplasia.2002Jul-Aug；4：295-303.；Saito-Hisaminato A et al.，DNA Res 2002，9：35-45.)。这些已鉴定出在各种癌症中过表达的基因的实例包括但不限于CDH3，EPHA4，ECT2，HIG2，INHBB，KIF20A，KNTC2，TTK和URLC10。CDH3在以前已经被鉴定为在膀胱癌、宫颈癌、胆管细胞癌、结直肠癌、子宫内膜异位、胃癌、弥散型胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、软组织肿瘤和睾丸肿瘤中过表达。EPHA4已经在膀胱癌、宫颈癌、胆管细胞癌、子宫内膜异位、弥散型胃癌、卵巢癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌、前列腺癌和软组织肿瘤中被鉴定。ECT2已经在膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、慢性骨髓性白血病(CML)、结直肠癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、前列腺癌、肾癌和小细胞肺癌(SCLC)中被鉴定。HIG2已经在肾癌和SCLC中被鉴定。INHBB已经在胆管细胞癌、食道癌、NSCLC、肾癌、SCLC和软组织肿瘤中被鉴定。KIF20A已经在膀胱癌、乳腺癌、胆管细胞癌、食道癌、NSCLC、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和SCLC中被鉴定。KNTC2已经在膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、食道癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC和软组织肿瘤中被鉴定。TTK已经在膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、食道癌、肝癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、SCLC和软组织肿瘤中被鉴定。URCL10已经在膀胱癌、宫颈癌、胆管细胞癌、食道癌、胃癌、NSCLC、骨肉瘤、胰腺癌和SCLC中被鉴定。

发明概要

本发明部分地基于可用于免疫治疗的靶标的发现。因为TAA往往不具有免疫原性，所以合适靶标的发现是极其重要的。如上文提到的，已经确认CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和URLC10出在各种癌症中被上调。更具体地说，这些基因是用全基因组范围的cDNA微阵列进行基因表达谱分析而鉴定的。如上文讨论的，已显示CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、NHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和URLC10的表达在从胰腺癌细胞到肾癌的各种肿瘤细胞中被特异上调。如表1中所示，CDH3的表达在34例膀胱癌中的26例，19例宫颈癌中的17例，所有的19例胆管细胞癌、34例结直肠癌中的30例，21例子宫内膜异位中的20例，20例胃癌中的13例，8例弥散型胃癌中的7例，37例NSCLC中的36例，全部16例胰腺癌，全部21例软组织肿瘤和全部10例睾丸肿瘤中确实被提高。

表1进一步证明：

EPHA4的表达在34例膀胱癌中的14例，14例宫颈癌中的8例，25例胆管细胞癌中的10例、15例子宫内膜异位中的5例，8例弥散型胃癌中的5例，全部5例卵巢癌，全部14例胰腺癌，51例前列腺癌中的20例，和23例软组织肿瘤中的14例中确实被提高。

ECT2的表达在19例膀胱癌中的17例，12例乳腺癌中的5例，全部14例宫颈癌，全部13例胆管细胞癌，全部5例CML，8例结直肠癌中的7例，16例食道癌中的12例，16例NSCLC中的6例，10例淋巴瘤中的8例，1例胰腺癌中的1例，13例前列腺癌中的10例，6例肾癌中的3例，和13例SCLC癌肿的12例中确实被提高。

HIG2的表达在20例肾癌中的19例，和9例软组织肿瘤中的7例中确实被提高。

INHBB的表达在21例胆管细胞癌中的10例，全部12例食道癌，13例NSCLC中的10例，24例肾癌中的22例，14例SCLC癌症中的8例，和49例软组织肿瘤中的45例中确实被提高。

KIF20A的表达在全部31例膀胱癌，61例乳腺癌中的38例，11例胆管细胞癌中的10例，19例食道癌中的7例，22例NSCLC中的21例，全部6例卵巢癌，36例前列腺癌中的17例，11例肾癌中的6例，和全部15例SCLC中确实被提高。

KNTC2的表达在32例膀胱癌中的30例，56例乳腺癌中的47例，全部10例宫颈癌，22例胆管细胞癌中的16例，37例CML中的17例，10例结直肠癌中的3例，46例食道癌中的11例，19例NSCLC中的15例，8例淋巴瘤中的7例，24例骨肉瘤中的20例，5例卵巢癌中的3例，全部2例胰腺癌，37例前列腺癌中的15例，19例肾癌中的14例，全部15例SCLC，和59例软组织肿瘤中的40例中确实被提高。

TTK的表达在全部27例膀胱癌，30例乳腺癌中的25例，16例宫颈癌中的15例，全部10例胆管细胞癌，7例CML中的5例，10例结直肠癌中的6例，44例食道癌中的24例，15例肝癌中的8例，全部12例NSCLC，全部6例淋巴瘤，16例骨肉瘤中的13例，17例前列腺癌中的12例，全部15例SCLC，和33例软组织肿瘤中的16例中确实被提高。

URLC10的表达在全部29例膀胱癌，16例宫颈癌中的15例，全部7例胆管细胞癌，19例食道癌中的7例，全部3例胃癌，27例NSCLC中的24例，19例骨肉瘤中的15例，5例胰腺癌中的4例，43例软组织肿瘤中的33例中确实被提高。

本发明至少部分地基于这些基因(CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和URLC10)的基因产物的特异表位肽的鉴定，其具有诱导特异针对相应分子的细胞毒T淋巴细胞(CTL)的能力。如下文中将详细介绍的，用衍生自CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、NHBB、KIF20A、KNTC2、TTK或URLC10的、可结合HLA-A*2402或HLA-A*0201的候选肽刺激健康供体的外周血单个核细胞(PBMC)。然后建立具有特异针对用每种候选肽冲击(pulse)的HLA-A24或HLA-A2阳性靶细胞的细胞毒性的CTL克隆和/或细胞系。这些结果证明，这些肽是HLA-A24或HLA-A2限制性表位肽，能够诱导针对表达CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK或URLC10的细胞的强力而特异的免疫响应。

因此，本发明提供了用于治疗或预防与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK或URLC10过表达相关的疾病，例如癌症，的方法。这些方法涉及向需要的受试者施用本发明CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10多肽的步骤。施用这些肽的结果可导致抗肿瘤免疫的诱导。因此，本发明提供了用于在受试者体内诱导抗肿瘤免疫的方法，这些方法涉及向受试者施用CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10多肽的步骤，本发明还提供了用于治疗或预防与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10过表达相关的疾病例如癌症的药物组合物，该药物组合物包含CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和URLC10多肽。这些癌症的实例包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

本发明进一步提供了用于预防上述疾病的手术后复发的方法。

关于上述具体的目标和目的，本领域的技术人员可以理解，本发明的一个或多个方面可以满足特定的目的，而一个或多个其它的方面则可以满足某些其它的目的。各个目标可能不能全面等同地适用于本发明的每一个方面。因此，对于本发明任一个方面而言，本文中的目的可以分别地看待。

结合附图和实施例阅读下面的详细说明书，本发明的目的和特征将变得更加清晰明了。然而，应当理解，无论是本发明的前述概要还是下文的详细说明书都是优选的实施方案，并不对本发明或者本发明的其它可选择实施方案构成限制。特别地，尽管本文是参考大量的具体实施方案对本发明进行介绍，但是应当意识到，这些描述只是本发明的举例说明，不应认为对本发明具有限制。在不背离如附加权利要求中描述的本发明的精神和范围的前提下，本领域的技术人员可以进行各种修改和适用。类似地，根据上述概要和下文介绍的某些实施方案，本发明的其它目的、特征、利益和优势是容易想到的，对本领域的技术人员而言也是显而易见的。这些目的、特征、利益和优势在所附的实施例、数据、图表以及其合理的推论(无论是就其本身还是联系本文引用的参考文献)的基础上是容易想到的。

发明详细说明

除非特别指出，否则本文使用的词语″一″、″一个″和″该″的意思是指″至少一个″。

除非特别定义，否则本文使用的全部科技术语具有与本发明所述领域普通技术人员所共同理解的相同的意思。

本发明部分地基于可用于免疫治疗的靶标的发现。新TAA特别是可诱导强力而特异的抗肿瘤免疫响应的TAA的鉴定，为进一步开发肽疫苗策略在各种类型癌症中的临床应用提供了依据(Boon T et al.，(1996)J Exp Med183：725-9.；van der Bruggen P et al.，(1991)Science 254：1643-7.；Brichard Vet al.，(1993)J Exp Med 178：489-95.；Kawakami Y et al.，(1994)J Exp Med 180：347-52.；Shichijo S et al.，(1998)J Exp Med 187：277-88.；Chen YT et al.，(1997)Proc.Natl.Acd.Sci.USA，94：1914-8.；Harris CC，(1996)J Natl Cancer Inst88：1442-55.；Butterfield LH et al.，(1999)Cancer Res 59：3134-42.；Vissers JL etal.，(1999)Cancer Res 59：5554-9.；van der Burg SH et al.，(1996)J.Immunol156：3308-14.；Tanaka F et al.，(1997)Cancer Res 57：4465-8.；Fujie T et al.，(1999)Int J Cancer 80：169-72.；Kikuchi M et al.，(1999)Int J Cancer 81：459-66.；Oiso M et al.，(1999)Int J Cancer 81：387-94.)。由于TAA往往没有免疫原性，所以发现合适的靶标是极其重要的课题。

如上文指出的，

CDH3(GenBank登录号NM_001793；SEQ ID Nos.1，2)，

EPHA4(GenBank登录号L36645；SEQ ID Nos.3，4)，

ECT2(GenBank登录号AY376439；SEQ ID Nos.5，6)，

HIG2(GenBank登录号NM_013332；SEQ ID Nos.7，8)

INHBB(GenBank登录号NM_002193；SEQ ID Nos.9，10)，

KIF20A(GenBank登录号NM_005733；SEQ ID Nos.11，12)，

KNTC2(GenBank登录号AF017790；SEQ ID Nos.13，14)，

TTK(GenBank登录号NM_003318；SEQ ID Nos.15，16)和

URLC10(GenBank登录号NM_017527；SEQ ID Nos.17，18)在先前已经通过

cDNA微阵列技术被鉴定为在各种癌症中过表达。

在本发明中，衍生自CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK或URLC10的肽被证明是HLA-A24和HLA-A2限制性的TAA表位，其中HLA-A24和HLA-A2是在日本人和白种人群中普遍发现的HLA等位基因。具体地，利用它们对HLA-A24或HLA-A2的结合亲和性，鉴定出了衍生自CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK或URLC10的、可结合HLA-A24或HLA-A2的肽候选物。通过在体外用负载有这些肽的树突细胞(DC)对T细胞进行刺激之后，使用如下的肽成功地建立了CTL。

CDH3-A24-9-513(SEQ ID NO：19)，

CDH3-A24-9-406(SEQ ID NO：22)，

CDH3-A24-10-807(SEQ ID NO：30)，

CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO：34)，

CDH3-A24-10-655(SEQ ID NO：344)，

CDH3-A24-10-470(SEQ ID NO：358)，

EphA4-A24-9-453(SEQ ID NO：41)，

EphA4-A24-9-5(SEQ ID NO：44)，

EphA4-A24-9-869(SEQ ID NO：46)，

EphA4-A24-9-420(SEQ ID NO：48)，

EphA4-A24-10-24(SEQ ID NO：78)，

EphA4-A02-9-501(SEQ ID NO：376)，

EphA4-A02-9-165(SEQ ID NO：379)，

ECT2-A24-9-515(SEQ ID NO：80)，

ECT2-A24-10-40(SEQ ID NO：100)，

ECT2-A24-10-101(SEQ ID NO：101)，

HIG2-A24-9-19(SEQ ID NO：110)，

HIG2-A24-9-22(SEQ ID NO：111)，

HIG2-A24-9-8(SEQ ID NO：387)，

HIG2-A24-10-7(SEQ ID NO：112)，

HIG2-A24-10-18(SEQ ID NO：394)，

HIG2-A02-9-8(SEQ ID NO：114)，

HIG2-A02-9-15(SEQ ID NO：116)，

HIG2-A02-9-4(SEQ ID NO：117)，

HIG2-A02-10-8(SEQ ID NO：121)，

INHBB-A24-9-180(SEQ ID NO：395)，

INHBB-A24-10-180(SEQ ID NO：133)，

INHBB-A24-10-305(SEQ ID NO：135)，

INHBB-A24-10-7(SEQ ID NO：137)，

INHBB-A24-10-212(SEQ ID NO：426)，

KIF20A-A24-9-305(SEQ ID NO：174)，

KIF20A-A24-9-383(SEQ ID NO：178)，

KIF20A-A24-10-304(SEQ ID NO：186)，

KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO：194)，

KNTC2-A24-9-309(SEQ ID NO：196)，

KNTC2-A24-9-124(SEQ ID NO：202)，

KNTC2-A24-9-154(SEQ ID NO：210)，

KNTC2-A24-9-150(SEQ ID NO：213)，

KNTC2-A24-10-452(SEQ ID NO：214)，

KNTC2-A24-10-227(SEQ ID NO：217)，

KNTC2-A24-10-273(SEQ ID NO：223)，

TTK-A02-9-462(SEQ ID NO：227)，

TTK-A02-9-547(SEQ ID NO：228)，

TTK-A02-9-719(SEQ ID NO：233)，

TTK-A02-10-462(SEQ ID NO：254)，

URLC-A02-9-206(SEQ ID NO：271)，

URLC-A02-9-212(SEQ ID NO：272)和

URLC-A02-10-211(SEQ ID NO：288)

这些肽是每种HLA-A24或HLA-A2限制性TTA的表位肽。因为这些抗原在大多数癌症中过表达并且与肿瘤细胞增殖相关，因此它们可以用作针对癌症的免疫治疗靶标。癌症实例包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

因此，本发明进一步提供了治疗或预防受试者体内与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10过表达相关的疾病例如癌症的方法，这些方法包括向受试者施用小于大约40个氨基酸的免疫原性肽的步骤，其经常小于大约20个氨基酸，通常小于大约15个氨基酸，并且具有如下的氨基酸序列：SEQ ID NO：19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288。

或者，免疫原性肽可以具有如下提出的氨基酸序列，SEQ ID NO：19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288，且其中有1个、2个或数个(例如最多5个)氨基酸被替换、删除或添加，只要所得的变体肽保留免疫原活性即可(也就是可诱导特异针对表达CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10的细胞例如癌细胞的CTL的能力)。

被替换、删除或添加的残基的数目一般为5个氨基酸或者更少，优选地4个氨基酸或更少，更优选地3个氨基酸或者更少，再更加优选地1个或2个氨基酸。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。而且，本发明提供了用于防止上述这些疾病的手术后复发的方法。

已知变体肽(即通过向原始氨基酸序列替换、删除或添加1个、2个或多个氨基酸残基修饰使氨基酸序列而得的肽)可以保持原来的生物活性(Mark DF et al.，(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6.；Zoller MJ andSmith M，(1982)Nucleic Acids Res 10：6487-500.；Dalbadie-McFarland G et al.，(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13.)。在本发明的语境中，优选地，氨基酸修饰的结果是保留原始氨基酸侧链的性质(该过程被称作保守氨基酸替换)。氨基酸侧链性质的实例包括疏水氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，亲水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，和具有如下共有功能基团或特征的侧链：脂肪族侧链(G、A、V、L、I、P)；含有羟基的侧链(S、T、Y)；含有硫原子的侧链(C、M)；含有羧酸和氨基的侧链(D、N、E、Q)；含有碱基的侧链(R、K、H)；和含有芳香基的侧链(H、F、Y、W)。注意，插入字母表示的是氨基酸的单字母编码。

在优选实施方案中，免疫原性肽是九肽(9聚体)或十肽(10聚体)。

本发明进一步提供在受试者体内诱导针对与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10的过表达相关的疾病(例如癌症)的抗肿瘤免疫的方法，这样的方法包括向需要的受试者施用本发明免疫原性肽，即具有SEQ ID NO：19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288的氨基酸序列的肽或其变体(即包含1个、2个或数个(例如最多5个)氨基酸的替换、删除或添加)的步骤。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

在本发明的语境中，受试者优选是哺乳动物。哺乳动物的实例包括，但不限于，例如人、非人灵长动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。

在本发明中，肽可以通过体内或离体(ex vivo)程序施用给受试者。而且，本发明还提供了九肽或十肽用于制造用于治疗或预防与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10的过表达相关的疾病(例如癌症)的免疫原性组合物的应用，所述九肽或十肽从具有如下氨基酸序列的肽中选出：SEQ ID NO：19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288(以及其变体)。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

下列肽的同源性分析证明，它们与来源于任何已知人类基因产物的肽均没有显著的同源性。

CDH3-A24-9-513(SEQ ID NO：19)，

CDH3-A24-9-406(SEQ ID NO：22)，

CDH3-A24-10-807(SEQ ID NO：30)，

CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO：34)，

CDH3-A24-10-655(SEQ ID NO：344)，

CDH3-A24-10-470(SEQ ID NO：358)，

EphA4-A24-9-453(SEQ ID NO：41)，

EphA4-A24-9-5(SEQ ID NO：44)，

EphA4-A24-9-869(SEQ ID NO：46)，

EphA4-A24-9-420(SEQ ID NO：48)，

EphA4-A24-10-24(SEQ ID NO：78)，

EphA4-A02-9-501(SEQ ID NO：376)，

EphA4-A02-9-165(SEQ ID NO：379)，

ECT2-A24-9-515(SEQ ID NO：80)，

ECT2-A24-10-40(SEQ ID NO：100)，

ECT2-A24-10-101(SEQ ID NO：101)，

HIG2-A24-9-19(SEQ ID NO：110)，

HIG2-A24-9-22(SEQ ID NO：111)，

HIG2-A24-9-8(SEQ ID NO：387)，

HIG2-A24-10-7(SEQ ID NO：112)，

HIG2-A24-10-18(SEQ ID NO：394)，

HIG2-A02-9-8(SEQ ID NO：114)，

HIG2-A02-9-15(SEQ ID NO：116)，

HIG2-A02-9-4(SEQ ID NO：117)，

HIG2-A02-10-8(SEQ ID NO：121)，

INHBB-A24-9-180(SEQ ID NO：395)，

INHBB-A24-10-180(SEQ ID NO：133)，

INHBB-A24-10-305(SEQ ID NO：135)，

INHBB-A24-10-7(SEQ ID NO：137)，

INHBB-A24-10-212(SEQ ID NO：426)，

KIF20A-A24-9-305(SEQ ID NO：174)，

KIF20A-A24-9-383(SEQ ID NO：178)，

KIF20A-A24-10-304(SEQ ID NO：186)，

KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO：194)，

KNTC2-A24-9-309(SEQ ID NO：196)，

KNTC2-A24-9-124(SEQ ID NO：202)，

KNTC2-A24-9-154(SEQ ID NO：210)，

KNTC2-A24-9-150(SEQ ID NO：213)，

KNTC2-A24-10-452(SEQ ID NO：214)，

KNTC2-A24-10-227(SEQ ID NO：217)，

KNTC2-A24-10-273(SEQ ID NO：223)，

TTK-A02-9-462(SEQ ID NO：227)，

TTK-A02-9-547(SEQ ID NO：228)，

TTK-A02-9-719(SEQ ID NO：233)，

TTK-A02-10-462(SEQ ID NO：254)，

URLC-A02-9-206(SEQ ID NO：271)，

URLC-A02-9-212(SEQ ID NO：272)和

URLC-A02-10-211(SEQ ID NO：288)

因此，针对这些分子的免疫治疗导致未知或不良免疫响应的可能性显著降低。

关于HLA抗原，这里提供的数据显示，A-24型或A-2型抗原(它们据称在日本人中高表达)有利于获得有效的结果。更加优选使用A-2402和A-0201等亚型。典型地，在临床上，预先对需要治疗的患者的HLA抗原类型进行检查，这样就有可能选择具有针对患者抗原的高水平的结合亲和性，或者具有通过抗原呈递诱导细胞毒T细胞(CTL)的能力的合适的肽。而且，为了获得具有高的结合亲和性和CTL诱导能力的肽，可以在天然存在的CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和URLC10的部分肽的氨基酸序列的基础上进行1个、2个或数个(例如最多5个)氨基酸的替换、删除或添加。这里，术语“数个”是指5个或者更少，更优选地3个或者更少。而且，除了自然被展示的肽之外，由于通过与HLA抗原结合而展示的肽的序列的规则性已经知晓(Kubo RT，et al.，(1994)J.Immunol.，152，3913-24.；Rammensee HG，et al.，(1995)Immunogenetics.41：178-228.；Kondo A，et al.，(1995)J.Immunol.155：4307-12.)，所以可以根据这些规则性对本发明的免疫原性肽进行修饰。例如，可以优选地使用N端第二个氨基酸被苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸替换的、具有高HLA-24结合亲和性的肽。类似地，也可以有利地使用C端氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸替换的肽。另一方面，可以有利地使用N端第二个氨基酸被亮氨酸或甲硫氨酸替换，或者C端氨基酸被缬氨酸或亮氨酸替换的、具有高HLA-A2结合亲和性的肽。替换不仅可以在末端氨基酸上进行，也可以在肽的潜在TCR识别位点处进行。许多研究已经证明，肽内氨基酸替换可以等同于或者优于原来的肽，例如CAP1，p53_(264-272)，Her-2/neu_(369-377)or gp 100_(209-217)(Zaremba et al.Cancer Res.57，4570-4577，1997，T.K.Hoffmann et al.J Immunol.(2002)Feb 1；168(3)：1338-47.，S.O.Dionne et al.Cancer Immunol immunother.(2003)52：199-206和S.O.Dionneet al.Cancer Immunology，Immunotherapy(2004)53，307-314)。而且，可以向肽的N端和/或C端添加1到2个氨基酸。

然而，当肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同时，可能会诱发副作用，例如自身免疫紊乱或者针对特定物质的过敏综合症。因此，优选地要避免免疫原序列与已知蛋白的氨基酸序列匹配的情况。这种情况可以通过用可获得的数据库进行同源性检索加以避免。如果同源性检索确认，其中有1个、2个或数个不同氨基酸被替换的肽在自然界不存在，那么为了例如增加与HLA抗原的结合亲和性和/或增加CTL诱导性进行的上述氨基酸序列的修饰的危险就能够避免。

尽管与上述HLA抗原具有高结合亲和性的肽被预期可高度有效地作为癌症疫苗，但是必须对根据以高结合亲和性的存在为指标选出的候选肽进行检验，考察其CTL诱导能力的实际存在。CTL诱导能力可以通过下述方式常规地加以确认：诱导携带有人MHC抗原的抗原呈递细胞(例如B淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞)，或者更具体地，衍生自人外周血单核白细胞的树突细胞，在用目标肽刺激之后，与CD8阳性细胞进行混合，并测量针对靶细胞的细胞毒活性。作为反应系统，可以使用可表达人HLA抗原的转基因动物(例如在下列文献中介绍的，BenMohamed L，et al.，(2000)Hum.Immunol.；61(8)：764-79相关文献、书籍、链接)。例如，可以用⁵¹Cr等放射性同位素标记靶细胞，并且可以根据靶细胞释放的放射性计算细胞毒活性。或者，可以通过测量在携带有固定化肽的抗原呈递细胞的存在下由CTL产生并释放的IFN-gamma，并用抗-IFN-gamma单克隆抗体使培养基上的抑制区可视化来加以检验。

作为检查上述肽CTL诱导能力的结果，发现与HLA抗原具有高结合亲和性的肽不一定具有高诱导能力。然而，从具有由下列肽表示的氨基酸序列的肽构成的群组中选择的九肽或十肽则显示出特别高的CTL诱导能力。

CDH3-A24-9-513(SEQ ID NO：19)，

CDH3-A24-9-406(SEQ ID NO：22)，

CDH3-A24-10-807(SEQ ID NO：30)，

CDH3-A24-10-332(SEQ ID NO：34)，

CDH3-A24-10-655(SEQ ID NO：344)，

CDH3-A24-10-470(SEQ ID NO：358)，

EphA4-A24-9-453(SEQ ID NO：41)，

EphA4-A24-9-5(SEQ ID NO：44)，

EphA4-A24-9-869(SEQ ID NO：46)，

EphA4-A24-9-420(SEQ ID NO：48)，

EphA4-A24-10-24(SEQ ID NO：78)，

EphA4-A02-9-501(SEQ ID NO：376)，

EphA4-A02-9-165(SEQ ID NO：379)，

ECT2-A24-9-515(SEQ ID NO：80)，

ECT2-A24-10-40(SEQ ID NO：100)，

ECT2-A24-10-101(SEQ ID NO：101)，

HIG2-A24-9-19(SEQ ID NO：110)，

HIG2-A24-9-22(SEQ ID NO：111)，

HIG2-A24-9-8(SEQ ID NO：387)，

HIG2-A24-10-7(SEQ ID NO：112)，

HIG2-A24-10-18(SEQ ID NO：394)，

HIG2-A02-9-8(SEQ ID NO：114)，

HIG2-A02-9-15(SEQ ID NO：116)，

HIG2-A02-9-4(SEQ ID NO：117)，

HIG2-A02-10-8(SEQ ID NO：121)，

INHBB-A24-9-180(SEQ ID NO：395)，

INHBB-A24-10-180(SEQ ID NO：133)，

INHBB-A24-10-305(SEQ ID NO：135)，

INHBB-A24-10-7(SEQ ID NO：137)，

INHBB-A24-10-212(SEQ ID NO：426)，

KIF20A-A24-9-305(SEQ ID NO：174)，

KIF20A-A24-9-383(SEQ ID NO：178)，

KIF20A-A24-10-304(SEQ ID NO：186)，

KIF20A-A24-10-66(SEQ ID NO：194)，

KNTC2-A24-9-309(SEQ ID NO：196)，

KNTC2-A24-9-124(SEQ ID NO：202)，

KNTC2-A24-9-154(SEQ ID NO：210)，

KNTC2-A24-9-150(SEQ ID NO：213)，

KNTC2-A24-10-452(SEQ ID NO：214)，

KNTC2-A24-10-227(SEQ ID NO：217)，

KNTC2-A24-10-273(SEQ ID NO：223)，

TTK-A02-9-462(SEQ ID NO：227)，

TTK-A02-9-547(SEQ ID NO：228)，

TTK-A02-9-719(SEQ ID NO：233)，

TTK-A02-10-462(SEQ ID NO：254)，

URLC-A02-9-206(SEQ ID NO：271)，

URLC-A02-9-212(SEQ ID NO：272)和

URLC-A02-10-211(SEQ ID NO：288)

如上文指出的，本发明提供了具有细胞毒T细胞诱导能力的肽，即，具有SEQ ID NO：19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288的氨基酸序列的肽或其变体(即有1个、2个或数个氨基酸被替换、删除或添加的那些)。

优选地，由在下列序列中表示的9个或10个氨基酸所构成的氨基酸序列或它们的变体不与任何其它内源蛋白质相关的氨基酸序列相匹配：SEQID NO：19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、376、379、80、100、101、110、111、387、112、394、114、116、117、121、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217、223、227、228、233、254、271、272或288。

特别地，从N端起第二个氨基酸处变为亮氨酸或甲硫氨酸的氨基酸替换，C端氨基酸变为缬氨酸或亮氨酸的氨基酸替换，和N端和/或C端处1到2个氨基酸的氨基酸添加，是优选变体的实例。

本领域的技术人员会认识到，除了氨基酸替换和添加之外，肽的免疫学活性片段也可以在本发明的方法中使用。用于确定活性片段的方法是本领域众所周知的。用经过修饰的肽刺激获得的CTL克隆能够识别原来的肽，并对表达原来的肽的细胞造成损伤。

本发明的肽可以用众所周知的技术制备。例如，肽可以合成制备，使用重组DNA技术或者化学合成。本发明的肽可以单独合成，或者作为包含2个或更个肽的较长多肽合成。本发明的肽优选地是分离的，即，基本上没有其它的天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段。

本发明的肽可以含有修饰，例如糖基化、侧链氧化或磷酸化；只要该修饰不破坏本文所述的肽的生物活性即结合HLA抗原并诱导CTL的能力即可。其它的修饰包括掺入D氨基酸或其它氨基酸模拟物，它们可以例如用来增加肽的血清半衰期。

而且，本发明可以包含筛选有1个、2个或数个氨基酸被替换的肽的方法，其中所述肽包含选自下组的氨基酸序列，SEQ ID NO：SEQ ID NO：19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、111、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217或223，所述方法包括如下步骤：

(a)确认对含有1个、2个或数个氨基酸的替换物的整个序列没有显著的序列同源性；

(b)测量候选替换物肽的CTL诱导能力；和

(c)选择CTL诱导能力等于或者高于原始肽的肽。

例如，在优选实施方案中，本发明提供了一种方法用于鉴定能够诱导针对表达至少一种肿瘤相关抗原的细胞的CTL的肽，其中该肿瘤相关抗原是选自下组的抗原：CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和URLC10，所述方法包括如下步骤：

(i)提供或产生至少一个候选序列，其包含通过向原始氨基酸序列替换、删除或添加1个、2个或数个氨基酸残基而被修饰的氨基酸序列，其中该原始氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO：19、22、30、34、344、358、41、44、46、48、78、80、100、101、110、111、387、112、394、395、133、135、137、426、174、178、186、194、196、202、210、213、214、217或223；

(ii)选择与衍生自除所述肿瘤相关抗原之外的任何已知人基因产物的肽均无实质显著同源性的候选序列；

(iii)使由从步骤(ii)中选出的候选序列组成的肽与抗原呈递细胞接触；

(iv)使步骤(c)中的抗原呈递细胞与T细胞接触，以评估肽刺激T细胞的能力；和

(v)鉴定CTL诱导能力等于或高于由原始氨基酸序列组成的肽的肽。

优选地，氨基酸被替换为保守该氨基酸侧链性质的不同氨基酸(该过程称作保守氨基酸替换)。氨基酸侧链性质的实例有疏水氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，亲水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，和具有如下共有功能基团或特征的侧链：脂肪族侧链(G、A、V、L、I、P)；含有羟基的侧链(S、T、Y)；含有硫原子的侧链(C、M)；含有羧酸和氨基的侧链(D、N、E、Q)；含有碱基的侧链(R、K、H)；和含有芳香基的侧链(H、F、Y、W)。注意，插入字母表示的是氨基酸的单字母编码。在本发明中，实质显著的同源性是，例如，与所比较的已知人基因产物有超过90％，优选地95％，更优选地99％或100％的同一性。

本发明的肽可以制备为包括本发明的2个或数个肽的组合，用作与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10的过表达相关的疾病(例如癌症)的疫苗，这种疫苗可体内诱导CTL。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。这些肽可以构成合剂(cocktail)，或者可以通过标准技术彼此偶联。例如，这些肽可以表达成单个多肽序列。组合中的肽可以是相同的也可以是不同的。

通过施用本发明的肽，肽被高密度地呈递在抗原呈递细胞的HLA抗原上，其进一步诱导可特异地与在所展示肽和HLA抗原之间形成的复合体进行反应的CTL。或者，可以用本发明的肽刺激在细胞表面上具有本发明固定化肽的抗原呈递细胞。将这些细胞再次施用给相应受试者可诱导CTL，结果，可以提高针对靶细胞的攻击性。

更具体地，本发明提供了用于治疗和/或预防与CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10过表达相关疾病(例如癌症)的增殖、转移等的药物，其包括一种或多种本发明的肽或者编码这些肽的多核苷酸。本发明的肽或多核苷酸特别有用于治疗CDH3，EPHA4，ECT2，HIG2，INHBB，KIF20A，KNTC2，TTK和/或URLC 10相关疾病，例如癌症。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

本发明的肽可以作为用传统制剂方法配制的药物组合物直接施用给受试者。在这种情况下，除了本发明的肽之外，还可以视情况包含通常用于药物的载体、赋形剂等，但没有特殊的限制。本发明的免疫原性组合物可以用于治疗和预防与CDH3，EPHA4，ECT2，HIG2，INHBB，KIF20A，KNTC2，TTK和/或URLC10的过表达相关的疾病，例如癌症。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。

包含一种或多种本发明的肽作为活性成分的用于治疗和/或预防与CDH3，EPHA4，ECT2，HIG2，INHBB，KIF20A，KNTC2，TTK和/或URLC 10的过表达相关的疾病(例如癌症)的免疫原性组合物，还可以进一步包含佐剂，以便有效地建立细胞免疫。或者，它们可以和其它活性成分例如抗癌剂一起施用。

预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。合适的制剂包括颗粒(granules)。合适的佐剂在文献中有介绍(Johnson AG.(1994)Clin.Microbiol.Rev.，7：277-89.)。

佐剂实例包括，但不限于，磷酸铝、氢氧化铝和明矾。而且，可以方便地使用脂质体制剂、药物结合于数mcm直径球珠的颗粒制剂、和脂质与肽结合的制剂。施用的方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等，并可以包括系统施用或针对靶肿瘤附近的局部施用。

本发明肽的剂量可以根据所治疗的疾病、患者的年龄、体重、施用方法等进行合适的调节。尽管剂量一般为0.001mg-1000mg，优选地0.01mg-100mg，更优选地0.1mg-10mg，优选地从数天到数月施用一次，本领域的技术人员可以容易地选择合适的剂量和施用方法，这些参数的选择和优化完全在本领域的常规技术范围之内。

本发明进一步提供了称作外来体(exosomes)的细胞外囊泡，其在表面上呈递由本发明肽和HLA抗原之间形成的复合体。外来体可以通过使用，例如，在已公开的国际申请日文翻译特表平11-510507号和特表2000-512161中详细介绍的方法来制备，更优选地，用从治疗和/或预防所针对的受试者获得的抗原呈递细胞来制备。与本发明的肽相似，本发明的外来体可以作为癌症疫苗进行预防注射。

所用HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的类型相匹配。例如，在日本人群中，HLA-A24或HLA-A2，特别是HLA-A2402或HLA-A0201，经常是合适的。

在一些实施方案中，本发明的药剂包括可初始化(prime)细胞毒T淋巴细胞的成分。脂质已被确认为是能够在体内针对病毒抗原初始化CTL的作用剂。例如，可以将棕榈酸残基附接到赖氨酸残基的ε-和α-氨基，然后连接到本发明的免疫原性肽上。然后可以将脂质化的肽或是直接在胶束或颗粒中施用，或者掺入到脂质体中施用，或者在佐剂中乳化后施用。作为CTL应答的脂质初始化的另一个实例，大肠杆菌脂蛋白，例如三棕榈酰-S-甘油酰半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)，在共价附接到合适的肽后，可以用来初始化CTL(见例如Deres et al.，Nature 342：561，1989)。

本发明的免疫原性组合物还可以包括编码本文公开的一种或多种免疫原性肽的核酸。见例如WolffJA et al.，(1990)Science 247：1465-8；美国专利Nos.5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；和WO98/04720。基于DNA的输送技术的实例包括“裸DNA”，辅助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介导)输送，阳离子脂质体复合体，和颗粒介导的(基因枪)或压力介导的输送(见例如美国专利No.5,922,687)。

本发明的肽还可以用病毒或细菌载体表达。合适的表达载体的实例包括减毒的病毒宿主，例如痘苗(vaccinia)或禽痘(fowlpox)。这种方法涉及使用例如痘苗病毒作为载体来表达编码该肽的核苷酸序列。一旦引入到宿主内，重组的痘苗病毒表达免疫原性肽，借此引发免疫应答。在免疫方案中有用的痘苗载体和方法在下列文献中有介绍，例如美国专利4,722,848。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体在Stover et al.，Nature 351：456-60，1991中有介绍。很多其他的可用于治疗性给药或免疫的载体，例如腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、脱毒的炭疽毒素载体等，是本领域中已知的。见例如Shata et al.，Mol MedToday 6：66-71，2000；Shedlock et al.J Leukoc Biol 68：793-806，2000；Hipp etal.，In Vivo 14：571-85，2000。

本发明还提供了使用一种或多种本发明的肽诱导抗原呈递细胞的方法。抗原呈递细胞的诱导可以通过下述方式实现：从外周血单核细胞诱导树突细胞，然后在体外、离体或体内使本发明的一种或多种肽接触(刺激)它们。当向受试者施用本发明的肽时，在受试者体内诱导出固定有本发明肽的抗原呈递细胞。或者，可以在将本发明的肽固定到抗原呈递细胞之后，将细胞作为疫苗施用给受试者。例如，离体施用可以包括如下步骤：

a：从受试者收集抗原呈递细胞，和

b：使步骤a的抗原呈递细胞与本发明的肽接触。

或者，根据本发明，提供了本发明的肽在制造可诱导抗原呈递细胞的药物组合物中的应用。进一步，本发明还提供了用于诱导抗原呈递细胞的本发明的肽。通过步骤b获得的抗原呈递细胞可以作为疫苗施用给受试者。

本发明还提供了用于诱导具有高水平的细胞毒T细胞诱导能力的抗原呈递细胞的方法，其中该方法包括在体外向抗原呈递细胞转化基因的步骤，该基因包括编码本发明一种或多种肽的多核苷酸。所引入的基因可以是DNA或RNA的形式。关于引入的方法，没有特殊的限制，可以恰当地使用本领域通常进行的各种方法，例如脂质体转染、电穿孔和磷酸钙方法。更具体地，转染可以按照下列文献中的描述来实施：Reeves ME，et al.，(1996)Cancer Res.，56：5672-7.；Butterfield LH，et al.，(1998)J.Immunol.，161：5607-13.；Boczkowski D，et al.，(1996)J.Exp.Med.，184：465-72.；已公开国际申请的日文翻译No.2000-509281。通过将基因转化到抗原呈递细胞，基因在细胞内经历转录、翻译等，然后所得的蛋白质被MHC-I或-II类加工，并通过呈递途径呈递部分肽。

本发明进一步提供了使用本发明的一种或多种肽来诱导CTL的方法。当向受试者施用本发明的肽时，在受试者体内诱导出CTL，藉此提高免疫系统靶定肿瘤组织中表达CDH3，EPHA4，ECT2，HIG2，INHBB，KIF20A，KNTC2，TTK和/或URLC10的细胞(例如癌细胞)的强度。

预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结直肠癌、子宫内膜异位、食道癌、胃癌、弥散型胃癌、肝、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤和睾丸肿瘤。或者，本发明的肽可以用于离体治疗方法的语境中，其中在体外使本发明的一种或多种肽接触(刺激)从受试者来源的抗原呈递细胞和CD8阳性细胞或外周血单核白细胞，诱导CTL之后，将细胞返回到受试者体内。例如，该方法可以包括如下步骤：

a：从受试者收集抗原呈递细胞，

b：使步骤a的抗原呈递细胞与本发明的肽接触，

c：将步骤b的抗原呈递细胞与CD⁸⁺T细胞混合并共培养，从而诱导细胞毒T细胞；和

d：从步骤c的共培养物中收集CD⁸⁺T细胞。

或者，根据本发明，提供了本发明的肽在制造可诱导CTL的药物组合物中的应用。进一步，本发明还提供了用于诱导CTL的本发明的肽。通过步骤d获得的具有细胞毒活性的CD8⁺T细胞可以作为疫苗施用给受试者。

本发明进一步提供了用本发明的肽诱导的分离的细胞毒T细胞。通过用呈递有一种或多种本发明的肽的抗原呈递细胞进行刺激而诱导出的细胞毒T细胞优选地来源于作为治疗和/或预防对象的受试者，这些细胞毒T细胞能够单独地施用，或与其它药物，包括本发明的一种或多种肽或具有抗肿瘤活性的外来体，组合施用。所得的细胞毒T细胞特异针对呈递有本发明肽，或者优选地，呈递有与用于诱导的肽相同的肽，的靶细胞发挥作用。靶细胞可以是内源表达CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10的细胞，或者是被CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、NHBB、KIF20A、KNTC2、TTK和/或URLC10基因转染的细胞。由于受本发明的肽的刺激而在细胞表面上呈递这些肽的细胞也可以成为攻击的靶标。

本发明还提供了可呈递由HLA抗原和本发明一种或多种肽之间形成的复合物的抗原呈递细胞。该抗原呈递细胞通过与本发明的肽或编码这些肽的核苷酸接触而获得，其优选地来源于治疗和/或预防所针对的受试者，并能够作为疫苗单独地施用或与其它药物包括本发明的肽、外来体或细胞毒T细胞组合施用。

本发明还提供了包含编码能够形成T细胞受体(TCR)的亚单位的多肽的核酸的组合物，并提供了其使用方法。TCR亚单位具有形成TCR的能力，所述TCR为T细胞提供针对呈递CDH3、EPHA4、ECT2、HIG2、INHBB、KIF20A、KNTC2、TTK或URLC10的肿瘤细胞的特异性。通过使用本领域已知的方法，可以鉴定被一种或多种本发明的肽诱导的CTL的TCR亚单位的α-和β-链核酸(WO2007/032255和Morg

用于表达肿瘤相关抗原的癌症的肽疫苗专利购买费用说明

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1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

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