专利摘要

专利摘要

一种基于四氟苯二甲腈构建稳定三元环肽的方法，涉及多元环肽。提供可提高环肽在细胞内强还原环境中的稳定性，得到耐还原环境、结构可调控、构型约束的三元环肽的一种基于四氟苯二甲腈构建稳定三元环肽的方法。具体步骤如下：将多肽溶于溶剂中得溶液A，将过量化合物1溶解于有机溶剂中得溶液B，将溶液A和B加入硫醇还原剂，再用无机碱或有机碱将溶液调节至碱性后反应，使用色谱分离并冻干，得到三元环肽产物。所得到的三元环肽能够在强还原环境中稳定存在。通过青霉胺替换半胱氨酸后的多肽与小分子反应能得到产物较为单一、产率高、结构可精确调控的三元环肽。

说明书

技术领域

本发明涉及多元环肽，尤其是涉及一种基于四氟苯二甲腈构建稳定三元环肽的方法。

背景技术

自然界中广泛存在着一类通过二硫键配对形成的构型复杂多样、结构比较稳定、能特异性结合蛋白的多元环肽，如芋螺毒素、knottins等(Muttenthaler,M.；B.Akondi,K.；F.Alewood,P.Current Pharmaceutical Design 2011,17,4226)。这类多元环肽被认为在发展酶的抑制剂或受体拮抗剂中具有广阔的应用前景。然而，基于二硫键的多元环肽在强还原环境中易被还原，使得其在生物还原性环境中的应用受到了限制。目前，主要通过内酰胺化、烯烃复分解、click反应等实现闭环(Zou,Y.；Spokoyny,A.M.；Zhang,C.；Simon,M.D.；Yu,H.；Lin,Y.S.；Pentelute,B.L.Org Biomol Chem 2014,12,566)。例如，公告号为US20140113871的美国发明专利，公开了一种基于全氟芳香化合物与半胱氨酸(Cys)的巯基间芳香族亲核取代反应构建一元环肽或实现装订的方法(Pentelute,B.L.；Spokoyny,A.M.；Zou,Y.；Zhang,C.；Massachusetts Institute of Technology(Cambridge,MA)US,2015)，但是该方法一般局限于形成一元或二元环肽，难以在富含巯基的多肽中有效使用。

另外，对于富含巯基的多肽，目前常采用对称分布的有机小分子骨架构建三元环肽，但仍然存在着产物复杂，产率低等问题。例如，Peter Timmerman等(Timmerman,P.；Beld,J.；Puijk,W.C.；Meloen,R.H.Chembiochem 2005,6,821)发现了苄基溴系列化合物与多肽巯基的快速定量反应。其中，均匀分布的1,3,5-三(溴甲基)苯能够与含3个巯基的多肽形成单一的二元环肽。但是，均匀分布的1,3,4,5-四(溴甲基)苯则与含4个巯基的多肽形成构型复杂的多种异构体。

发明内容

本发明的目的在于为了克服基于二硫键的三元环肽合成中不易调控、产物复杂等问题，提供可提高环肽在细胞内强还原环境中的稳定性，得到耐还原环境、结构可调控、构型约束的三元环肽的一种基于四氟苯二甲腈构建稳定三元环肽的方法。

本发明的具体步骤如下：

将多肽溶于溶剂中得溶液A，将过量化合物1溶解于有机溶剂中得溶液B，将溶液A和B加入硫醇还原剂，再用无机碱或有机碱将溶液调节至碱性后反应，使用色谱分离并冻干，得到三元环肽产物。

所述多肽可采用含4个半胱氨酸的多肽，或含2个半胱氨酸和2个青霉胺的多肽；所述溶剂可选自水、乙腈、甲醇等中的一种；所述化合物1为2,3,5,6-四氟对苯二腈，结构式如下：

所述有机溶剂可选自乙腈、N,N’-二甲基甲酰胺、甲醇等中的一种；所述硫醇还原剂可选自三(2-羧乙基)膦盐或二硫苏糖醇等中的一种；所述无机碱可选自磷酸盐、碳酸盐等中的一种；所述有机碱可选自三羟甲基氨基甲烷、三乙胺等中的一种；所述反应的条件可在20～60℃下反应4～8h。

本发明提供一种基于2,3,5,6-四氟对苯二甲腈分子中四个氟与多肽中巯基的反应构建碳硫键三元环肽，并且通过青霉胺替换半胱氨酸限制产物结构的方法，从而得到耐还原环境、结构可调控、构型约束的三元环肽。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种新的构建三元环肽的小分子骨架，所得到的三元环肽能够在强还原环境中稳定存在。通过青霉胺替换半胱氨酸后的多肽与小分子反应能得到产物较为单一、产率高、结构可精确调控的三元环肽。

附图说明

图1是本发明的反应原理图之一。

图2是本发明的反应原理图之二。

图3是本发明实施例1的色谱图。

图4是本发明实施例2的色谱图。

在图1和2中，1为2,3,5,6-四氟对苯二腈，2为含4个半胱氨酸的多肽(含修饰后多肽)，4为含2个半胱氨酸和2个青霉胺的多肽(含修饰后多肽)，图中的箭头表示反应产物的不同连接方式。

在图1中，含4个半胱氨酸的多肽2中的C代表半胱氨酸，横线部分表示其他氨基酸序列，半胱氨酸之间可以直接相连，也可被其他氨基酸隔开，多肽的其他部分可以被修饰，只需保持含有4个半胱氨酸的特征不变。

在图2中，含2个半胱氨酸和2个青霉胺的多肽4中的C代表半胱氨酸，Pen代表青霉胺，横线部分表示其他氨基酸序列，半胱氨酸或青霉胺之间可以直接相连，也可被其他氨基酸隔开，多肽的其他部分可以被修饰，只需保持含有2个半胱氨酸和2个青霉胺的特征不变。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例的具体步骤如下：

将多肽溶于溶剂中得溶液A，将过量化合物1溶解于有机溶剂中得溶液B，将溶液A和B加入硫醇还原剂，再用无机碱或有机碱将溶液调节至碱性后反应，使用色谱分离并冻干，得到三元环肽产物。所述多肽可采用含4个半胱氨酸的多肽，或含2个半胱氨酸和2个青霉胺的多肽；所述溶剂可选自水、乙腈、甲醇等中的一种；所述化合物1为2,3,5,6-四氟对苯二腈，结构式如下：

所述有机溶剂可选自乙腈、N,N’-二甲基甲酰胺、甲醇等中的一种；所述硫醇还原剂可选自三(2-羧乙基)膦盐或二硫苏糖醇等中的一种；所述无机碱可选自磷酸盐、碳酸盐等中的一种；所述有机碱可选自三羟甲基氨基甲烷、三乙胺等中的一种；所述反应的条件可在20～60℃下反应4～8h。

本发明将2,3,5,6-四氟对苯二腈(化合物1)中的四个氟处于较大的共轭体系中，具有相对较强的反应活性。多肽中的半胱氨酸能够在碱性条件下于水相(或含乙腈、甲醇等有机相)中与化合物1中的氟发生亲核取代反应。含有四个半胱氨酸的多肽(化合物2)与过量的化合物1在碱性体系(如磷酸缓冲溶液)中反应可以得到四取代产物，即通过碳硫键与有机小分子相连的三元环肽。这一反应可以得到6种三元环肽。另外，一种非天然氨基酸青霉胺(化合物3)中的巯基与化合物1的取代反应速率慢(比半胱氨酸慢40倍)，用其替代多肽中的半胱氨酸，可以钝化多肽中的两个巯基的活性。替换2个半胱氨酸为青霉胺的多肽(化合物4)与化合物1的反应分为四步进行(如图2)：①②化合物2中两个半胱氨酸的巯基依次与化合物1中对位的两个氟发生亲核取代反应，剩余的两个位点则经③和④与青霉胺的巯基反应。这一反应顺序使得最终的四取代产物仅有2种，并且产率可以达到85％。通过改变两种含巯基氨基酸的排布可以得到不同连接方式的三元环肽，实现了产率高、精确可调、抗强还原环境的三元环肽的制备，从而克服目前基于小分子构建多元环肽产物结构复杂，不易调控的缺陷。

化合物1的结构：

化合物3的结构：

以下给出具体实施例：

实施例1

将WGCKCGGKGGCGKGGGCGW(两端分别酰胺化和氨基化)溶于水中，在室温下，50μM多肽与200μM化合物1在100mM pH＝7.4磷酸缓冲水溶液中反应4h后，得到6种四取代产物，总产率70％，其色谱图如图3。利用高效液相色谱纯化分离冻干后得到相应的三元环肽，所得产物经质谱表征m/z:960.0(M²⁺),640.3(M³⁺)。

实施例2

将WGCGGKGGPenGKGGGCGKGGGPenGW(两端分别酰胺化和氨基化)溶于水中，在室温下，50μM多肽与200μM化合物1在100mM pH＝7.4磷酸缓冲水溶液中反应8h后，得到2种四取代产物，其色谱图如图4(8h后主要得到两种四取代产物，产率85％)。利用高效液相色谱纯化分离冻干后得到相应的两种三元环肽。所得产物经质谱表征均为m/z:1102.8(M²⁺)。

一种基于四氟苯二甲腈构建稳定三元环肽的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。