专利摘要

专利摘要

本发明公开了一类四环二萜类化合物，包含化学分子式为C20H32的委内瑞拉烯A和化学分子式为C20H30O的委内瑞拉烯B；该化合物通过委内瑞拉烯A与B的生物合成基因簇的自体沉默基因簇激活和异源表达该基因簇的方式，实现了委内瑞拉烯A和B生物合成基因簇中的基因在链霉菌及大肠杆菌中的表达，整个操作过程简单，工艺成熟，成本低廉，环境友好。本发明获得的产物委内瑞拉烯A和委内瑞拉烯B有望应用到食品、香料、医药化工等领域。

权利要求

1.一种四环二萜类化合物，其特征在于：所述化合物为含5-5-6-7四环二萜骨架的化合物，其化学分子式为C20H32，结构式如式(1)所示，命名为：委内瑞拉烯A(venezuelaene A)；

2.一种四环二萜类化合物，其特征在于：所述化合物为含5-5-6-7四环二萜骨架的化合物，其化学分子式为C20H30O，结构式如式(2)所示，命名为：委内瑞拉烯B(venezuelaene B)；

3.权利要求1或2所述四环二萜类化合物的制备方法，其特征在于：通过自体沉默基因激活的方法表达委内瑞拉链霉菌Streptomyces venezuelae ATCC 15439中委内瑞拉烯的生物合成基因簇中的基因来获得委内瑞拉烯A或委内瑞拉烯B。

4.权利要求1或2所述四环二萜类化合物的制备方法，其特征在于：通过大肠杆菌中异源表达的方法表达委内瑞拉链霉菌Streptomyces venezuelae ATCC 15439中委内瑞拉烯的生物合成基因簇中的基因来获得委内瑞拉烯A或委内瑞拉烯B。

5.一种权利要求3或4所述的委内瑞拉烯的生物合成基因簇，其特征在于：所述基因簇含有4个基因，分别为编码二萜合酶VenA的基因venA或其功能等同体，编码细胞色素P450酶VenB和VenC的2个基因venB和venC或其功能等同体，编码香叶基香叶基焦磷酸合酶VenD的基因venD或其功能等同体；其中，所述venA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，venB的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，venC的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，venD的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

6.权利要求1所述四环二萜类化合物的制备方法，步骤是：

(1)以S.venezuelae ATCC 15439的基因组为模板，分别以引物VenA-F/VenA-R，VenD-F/VenD-R和pDR4VenC-F/pDR4VenC-R对二萜合酶的基因venA，香叶基香叶基焦磷酸合酶基因venD和细胞色素P450酶基因venC进行PCR扩增，得到基因venA，venD和venC的PCR产物；然后以大肠杆菌表达载体pET28b或其功能等同体为载体构建venA和venD的共表达载体pET28b-venAD；其中，所述引物核苷酸序列分别是：

VenA-F：CCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCAGCAACGCCTCCGCCCG

VenA-R：GTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGTCAAACCAGCGGTCGGGTGGG

VenD-F：CCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGACCCAGGCGACACTGTC

VenD-R：GTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGTCATCCGTCGCGGTGGCTCA

pDR4VenC-F：CGTGCAGGACTGGGGGAGTTACTAGTATGACCTGGGCCGCTGCGGG

pDR4VenC-R:ATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCTCATGACGCCACCGCCCGGG

(2)将共表达载体pET28b-venAD转化到高产二甲基丙烯基焦磷酸和异戊烯焦磷酸的大肠杆菌工程菌Eco-P即Escherichia coli BL21-DE3/pACYC-mavEmavS&pTrc-low化学感受态中，得到能产生委内瑞拉烯A(venezuelaene A)的大肠杆菌工程菌Eco-P/pET28b-venAD；

(3)将大肠杆菌工程菌Eco-P/pET28b-venAD种子液按照体积量1～2:100的比例转接到含卡那霉素、氯霉素和氨苄霉素的TB培养基中于37±2℃，220±20rpm培养，当OD600到达1.0-1.5时，加入终浓度为0.1-1.0mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于18±2℃，220±20rpm的条件下诱导蛋白表达并生物合成委内瑞拉烯A。

7.权利要求2所述四环二萜类化合物的制备方法，步骤是：

(1)以S.venezuelae ATCC 15439基因组为模板，分别以引物VenA-F/VenA-R，VenD-F/VenD-R和pDR4VenC-F/pDR4VenC-R对二萜合酶的基因venA，香叶基香叶基焦磷酸合酶基因venD和细胞色素P450酶基因venC进行PCR扩增，得到基因venA，venD和venC的PCR产物；然后以链霉菌整合型载体pDR4-kasOp*或其功能等同体为载体，将venC整合到SpeI和KpnI双酶切线性化的pDR4-kasOp*得到表达载体pDR4-kasOp*-venC；其中，所述引物核苷酸序列分别是：

VenA-F：CCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCAGCAACGCCTCCGCCCG

VenA-R：GTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGTCAAACCAGCGGTCGGGTGGG

VenD-F：CCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGACCCAGGCGACACTGTC

VenD-R：GTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGTCATCCGTCGCGGTGGCTCA

pDR4VenC-F：CGTGCAGGACTGGGGGAGTTACTAGTATGACCTGGGCCGCTGCGGG

pDR4VenC-R:ATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCTCATGACGCCACCGCCCGGG

(2)将表达载体pDR4-kasOp*-venC转化到商品化的大肠杆菌Et12567/pUZ8002中，得到大肠杆菌工程菌Et12567/pUZ8002&pDR4-kasOp*-venC；将S.venezuelaene ATCC 15439野生型的孢子悬液与大肠杆菌工程菌Et12567/pUZ8002&pDR4-kasOp*-venC混合，分别均匀涂布于含MgCl2和CaCl2的MS平板上，于30±2℃培养16±1h后，每个MS平板用溶有潮霉素和萘啶酮酸的无菌水覆盖，待干后，重新放置于30±2℃条件下培养，待3-5天菌落长出后，挑取单菌落到含萘啶酮酸和潮霉素的MS培养基上，3±1天产孢后，接种到2×YT培养液中，28±1℃，220±10rpm培养2天后提取基因组，经PCR验证基因型正确的即为重组菌株S.venezuelae ATCC 15439/pDR4-kasOp*-venC；

(3)按照体积量1～2:10的比例将重组菌株S.venezuelae ATCC 15439/pDR4-kasOp*-venC种子液转接到SCM培养基中，30±2℃，220±20rpm培养12h后，以终浓度5mg/L饲喂委内瑞拉烯A，继续培养7～8天，实现委内瑞拉烯A到委内瑞拉烯B的生物转化，得到经GC检测转化率达95％的委内瑞拉烯B。

8.根据权利要求6或7所述四环二萜类化合物的制备方法，其特征在于：将含委内瑞拉烯A或委内瑞拉烯B的发酵液加入等体积的乙酸乙酯萃取，再蒸干得到的浸膏，浸膏用正己烷萃取去除极性大的组分，萃取液再蒸干并溶于乙腈用于反相C18色谱柱半制备获得纯化的委内瑞拉烯A或委内瑞拉烯B；其中，色谱柱为Waters XBridgeTMC-18 column，规格10×250mm、5μm，洗脱程序为：100％甲醇洗脱30min，流速为1.5～2.5mL/min。

9.权利要求1所述四环二萜类化合物委内瑞拉烯A(venezuelaene A)在制备香料中的应用。

10.权利要求2所述四环二萜类化合物委内瑞拉烯B(venezuelaene B)在制备香料中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于天然产物化学，生物化学与分子生物学及基因工程领域，具体的讲，涉及一类四环二萜类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

迄今为止，超过80,000种萜类化合物从人，动物，植物以及微生物中被发现。萜类化合物由多个异戊二烯结构单元组成，代表最大的一类天然产物^[1,2]。一般而言，萜类化合物的母核结构(萜烯)的生物合成由萜类合酶催化有限碳链长度的聚异戊烯基焦磷酸(C5n，n＝2，3，4等)的环化得到含多环及诸多手性中心的复杂碳氢骨架^[3,4]。如，单萜由香叶基焦磷酸(C10)环化得到，倍半萜由法尼基焦磷酸环化(C15)得到，二萜由香叶基香叶基焦磷酸(C20)环化得到等。进一步，经过细胞色素P450酶，FAD依赖的氧化酶，甲基、酰基及糖基转移酶等后修饰酶的催化作用，形成结构骨架及理化性质更为复杂多样的化合物^[2]。萜类化合物生理活性丰富多样，如抗肿瘤、抗疟疾、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫抑制等，在医疗保健、食品、化妆品、农药、兽药、化工等领域具有广泛的应用价值和前景，与人们的生活生产密不可分^[5,6]。典型的萜类化合物代表如，“诺奖分子”抗疟疾药物青蒿素^[7]；具有强抗肿瘤活性的临床候选药物的紫杉醇^[8]；人类及哺乳动物不可或缺，广泛参与到体内生长发育及代谢调节的类固醇激素^[9]；广泛存在传统中药中的活性甾体皂苷类化合物^[10]。并且，植物来源的天然色素、香味剂多为萜类化合物，因此其在食品，香精香料工业具有广泛应用^[11]。例如，常用的天然色素β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素等；食品增味剂薄荷醇、甜菊糖苷等；香精香料定香剂降龙涎醚等。

然而，由于资源及技术限制，尤其是植物(萜类化合物的主要来源)存在生长周期长、萜类化合物产量低、获取成本高昂的缺点，人们直接从自然界中获取新颖骨架的萜类化合物来服务生产生活越来越困难。同时，传统的化学合成的方式获取新的萜类化合物存在反应步骤多、催化选择性差、条件不够温和以及污染环境等缺点，更关键的是其获得全新结构骨架的能力有限。近些年来，随着基因组测序技术及生物信息学的快速发展，人们发现微生物也具备可观的萜类化合物生产潜力。因此，通过针对单个微生物的全基因组分析，采用生物化学、分子生物学与天然产物化学相结合的策略，成为了挖掘新颖的萜类化合物以供基础和应用科学研究的重要手段^[12]。

委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae ATCC 15439)作为天然产物生物合成研究领域的模式菌株，其高质量全基因组数据已发布(GenBank：CP013129)，且其次级代谢产物丰富、遗传操作体系完备。然而，检索发现目前国内外尚无任何关于通过自体的沉默基因激活的方法表达委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae ATCC 15439)中委内瑞拉烯的生物合成基因簇(GenBank：MN508361)中的基因来生产萜类化合物尤其是委内瑞拉烯A或委内瑞拉烯B，或者通过大肠杆菌中异源表达的方法表达委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae ATCC 15439)中委内瑞拉烯的生物合成基因簇中的基因来生产萜类化合物尤其是委内瑞拉烯A或委内瑞拉烯B，及其分离纯化的报道。

参考文献

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发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一类四环二萜类化合物及其制备方法与应用。

本发明所述的一类四环二萜类化合物，包含了委内瑞拉烯A(venezuelaene A)和委内瑞拉烯B(venezuelaene B)，具体是：

一种四环二萜类化合物，其特征在于：所述化合物为含5-5-6-7四环二萜骨架的化合物，其化学分子式为C₂₀H₃₂，结构式如式(1)所示，命名为：委内瑞拉烯A(venezuelaeneA)；

一种四环二萜类化合物，其特征在于：所述化合物为含5-5-6-7四环二萜骨架的化合物，其化学分子式为C₂₀H₃₀O，结构式如式(2)所示，命名为：委内瑞拉烯B(venezuelaeneB)；

上述四环二萜类化合物的制备方法，其特征在于：通过自体沉默基因激活的方法表达委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae ATCC 15439)中委内瑞拉烯的生物合成基因簇中的基因来获得委内瑞拉烯A或委内瑞拉烯B。

上述四环二萜类化合物的制备方法，其特征在于：通过大肠杆菌中异源表达的方法表达委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae ATCC 15439)中委内瑞拉烯的生物合成基因簇中的基因来获得委内瑞拉烯A或委内瑞拉烯B。

上述方法中所述的委内瑞拉烯的生物合成基因簇，其特征在于：该基因簇含有4个基因，分别为编码二萜合酶VenA的基因venA或其功能等同体，编码细胞色素P450酶VenB和VenC的2个基因venB和venC或其功能等同体，编码香叶基香叶基焦磷酸合酶VenD的基因venD或其功能等同体；其中，所述venA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，venB的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，venC的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，venD的核苷酸序列如SEQID NO：4所示；或者所述基因核苷酸序列是分别与编码蛋白VenA，VenB，VenC和VenD的氨基酸序列一致性高于80％所对应的DNA编码序列。

具体的，本发明所述四环二萜类化合物委内瑞拉烯A的制备方法，步骤是：

(1)以S.venezuelae ATCC 15439的基因组(GenBank：CP013129)为模板，分别以引物VenA-F/VenA-R，VenD-F/VenD-R和pDR4VenC-F/pDR4VenC-R对二萜合酶的基因venA，香叶基香叶基焦磷酸合酶基因venD和细胞色素P450酶基因venC进行PCR扩增，得到基因venA，venD和venC的PCR产物；然后以大肠杆菌表达载体pET28b或其功能等同体为载体构建venA和venD的共表达载体pET28b-venAD；其中，所述引物核苷酸序列分别是：

VenA-F：CCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCAGCAACGCCTCCGCCCG

VenA-R：GTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGTCAAACCAGCGGTCGGGTGGG

VenD-F：CCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGACCCAGGCGACACTGTC

VenD-R：GTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGTCATCCGTCGCGGTGGCTCA

pDR4VenC-F：CGTGCAGGACTGGGGGAGTTACTAGTATGACCTGGGCCGCTGCGGGpDR4VenC-R:ATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCTCATGACGCCACCGCCCGGG

(2)将共表达载体pET28b-venAD转化到高产二甲基丙烯基焦磷酸和异戊烯焦磷酸的大肠杆菌工程菌Eco-P(Escherichia coli BL21(DE3)/pACYC-mavEmavS&pTrc-low)化学感受态中，得到能产生委内瑞拉烯A(venezuelaene A)的大肠杆菌工程菌Eco-P/pET28b-venAD；

(3)将大肠杆菌工程菌Eco-P/pET28b-venAD种子液按照体积量1～2:100的比例转接到含卡那霉素、氯霉素和氨苄霉素的TB培养基中于37±2℃，220±20rpm培养，当OD₆₀₀到达1.0-1.5时，加入终浓度为0.1-1.0mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于18±2℃，220±20rpm的条件下诱导蛋白表达并生物合成委内瑞拉烯A。

具体的，本发明所述四环二萜类化合物委内瑞拉烯B的制备方法，步骤是：

(1)以S.venezuelae ATCC 15439基因组(GenBank：CP013129)为模板，分别以引物VenA-F/VenA-R，VenD-F/VenD-R和pDR4VenC-F/pDR4VenC-R对二萜合酶的基因venA，香叶基香叶基焦磷酸合酶基因venD和细胞色素P450酶基因venC进行PCR扩增，得到基因venA，venD和venC的PCR产物；然后以链霉菌整合型载体pDR4-kasOp*或其功能等同体为载体，将venC整合到SpeI和KpnI双酶切线性化的pDR4-kasOp*得到表达载体pDR4-kasOp*-venC；其中，所述引物核苷酸序列分别是：

VenA-F：CCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCAGCAACGCCTCCGCCCG

VenA-R：GTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGTCAAACCAGCGGTCGGGTGGG

VenD-F：CCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGACCCAGGCGACACTGTC

VenD-R：GTCCACCAGTCATGCTAGCCATATGTCATCCGTCGCGGTGGCTCA

pDR4VenC-F：CGTGCAGGACTGGGGGAGTTACTAGTATGACCTGGGCCGCTGCGGG

pDR4VenC-R:ATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCTCATGACGCCACCGCCCGGG

(2)将表达载体pDR4-kasOp*-venC转化到商品化的大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，得到大肠杆菌工程菌Et12567/pUZ8002&pDR4-kasOp*-venC；将S.venezuelaene ATCC15439野生型的孢子悬液与大肠杆菌工程菌Et12567/pUZ8002&pDR4-kasOp*-venC混合，分别均匀涂布于含MgCl₂和CaCl₂的MS平板上，于30±2℃培养16±1h后，每个MS平板用溶有潮霉素和萘啶酮酸的无菌水覆盖，待干后，重新放置于30±2℃条件下培养，待3-5天菌落长出后，挑取单菌落到含萘啶酮酸和潮霉素的MS培养基上，3±1天产孢后，接种到2×YT培养液中，28±1℃，220±20rpm培养2天后提取基因组，经PCR验证基因型正确的即为重组菌株S.venezuelae ATCC 15439/pDR4-kasOp*-venC；

(3)按照体积量1～2:10的比例将重组菌株S.venezuelae ATCC 15439/pDR4-kasOp*-venC种子液转接到SCM培养基中，30±2℃，220±20rpm培养12h后，以终浓度5mg/L饲喂委内瑞拉烯A，继续培养7～8天，实现委内瑞拉烯A到委内瑞拉烯B的生物转化，得到经GC检测转化率达95％的委内瑞拉烯B。

上述四环二萜类化合物的制备方法中：可以将含委内瑞拉烯A或委内瑞拉烯B的发酵液加入等体积的乙酸乙酯萃取，再蒸干得到的浸膏，浸膏用正己烷萃取去除极性大的组分，萃取液再蒸干并溶于乙腈用于反相C18色谱柱半制备获得纯化的委内瑞拉烯A或委内瑞拉烯B；其中，色谱柱为Waters XBridge^TM C-18column，规格10×250mm、5μm，洗脱程序为：100％甲醇洗脱30min，流速为1.5～2.5mL/min。

本发明所述四环二萜类化合物委内瑞拉烯A(venezuelaene A)在制备香料中的应用。

本发明所述四环二萜类化合物委内瑞拉烯B(venezuelaene B)在制备香料中的应用。

本发明提供了一类四环二萜类化合物及其制备方法与应用。研发过程中发明人通过基因组挖掘的策略从委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae ATCC 15439)中发现了新颖的委内瑞拉烯A与B的生物合成基因簇。通过沉默基因激活和异源表达的方式，实现了委内瑞拉烯A和B生物合成基因簇中的基因在链霉菌及大肠杆菌中的表达。最终，分离纯化获得了两个具有全新骨架的5-5-6-7四环二萜类化合物，即带有香味的委内瑞拉烯A和委内瑞拉烯B。其中的创新点体现在利用基因工程的方法，构建产生新化合物委内瑞拉烯A的自给自足工程菌。随后，利用生物转化的方法，应用表达P450基因venC的工程菌S.venezuelae ATCC 15439/pDR4-kasOp*-venC一步完成委内瑞拉烯A到新化合物委内瑞拉烯B的转化。整个操作过程简单，工艺成熟，成本低廉，整个过程不含有害杂质，无毒，对环境非常友好。获得的产物委内瑞拉烯A和委内瑞拉烯B有望应用到食品、香料、医药化工等领域。

附图说明

图1为本发明实施例提供的委内瑞拉烯A的三维结构椭球图。

图2为本发明实施例提供的委内瑞拉烯A(venezuelaene A)和委内瑞拉烯B(venezuelaene B)的化学结构图。

图3为本发明实施例提供的委内瑞拉烯A的紫外可见光谱图。

图4为本发明实施例提供的委内瑞拉烯A的气相质谱图。

图5为本发明实施例提供的委内瑞拉烯A的¹H-¹H COSY,HMBC和NOESY的关键相关信号。

图6为本发明实施例提供的委内瑞拉烯A在CD₃Cl中的¹HNMR图。

图7为本发明实施例提供的委内瑞拉烯A在CD₃Cl中的¹³CNMR图。

图8为本发明实施例提供的委内瑞拉烯A在CD₃Cl中的¹³C-DEPT 135°图。

图9为本发明实施例提供的委内瑞拉烯A在CD₃Cl中的HSQC图。

图10为本发明实施例提供的委内瑞拉烯A在CD₃Cl中的¹H-¹H COSY图。

图11为本发明实施例提供的委内瑞拉烯A在CD₃Cl中的HMBC图。

图12为本发明实施例提供的委内瑞拉烯A在CD₃Cl中的NOSEY图。

图13为本发明实施例提供的GC检测委内瑞拉烯A(1)到委内瑞拉烯B的生物转化图(2)。

其中：(i)为S.venezuelae ATCC 15439饲喂5mg/L委内瑞拉烯A；(ii)为工程菌S.venezuelae ATCC 15439/pDR4-kasOp*-venC饲喂5mg/L委内瑞拉烯A。

图14为本发明实施例提供的委内瑞拉烯B的紫外可见光谱图。

图15为本发明实施例提供的委内瑞拉烯B的气相质谱图。

图16为本发明实施例提供的委内瑞拉烯B的高分辨质谱图。

图17为本发明实施例提供的委内瑞拉烯B的¹H-¹H COSY，HMBC和NOESY的关键相关信号。

图18为本发明实施例提供的委内瑞拉烯B在CD₃Cl中的¹HNMR图。

图19为本发明实施例提供的委内瑞拉烯B在CD₃Cl中的¹³C-DEPTQ图。

图20为本发明实施例提供的委内瑞拉烯B在CD₃Cl中的HSQC图。

图21为本发明实施例提供的委内瑞拉烯B在CD₃Cl中的¹H-¹H COSY图。

图22为本发明实施例提供的委内瑞拉烯B在CD₃Cl中的HMBC图。

图23为本发明实施例提供的委内瑞拉烯B在CD₃Cl中的NOSEY图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

本发明实施例中所采用的PCR扩增，质粒提取、转化等基础分子生物学实验技术，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照相关产商提供的说明书执行。

本发明实施例所用菌株S.venezuelaene ATCC 15439购自美国菌种保藏中心；Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞购自北京擎科。大肠杆菌工程菌Eco-P(Escherichia coli BL21(DE3)/pACYC-mavEmavS&pTrc-low)的构建方法见Microb CellFact 15,74(2016)；大肠杆菌Et12567/pUZ8002购自优宝生物公司。

本发明实施例所用一步克隆试剂盒购自南京诺唯赞公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Omega公司；链霉菌整合型载体pDR4-kasOp*购自Addgene；大肠杆菌表达载体pET28b购自Invitrogen；高保真DNA聚合酶购自Takara；限制性内切酶购自赛默飞；PCR引物合成和DNA测序由北京擎科完成。

本发明实施例所涉及的S.venezuelae ATCC 15439的生孢培养基为MS培养基，配方是：豆粉20g/L，甘露醇20g/L，琼脂粉20g/L；种子培养基为2×YT培养基，配方是：胰蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L；发酵培养基为SCM培养基，配方是：可溶性淀粉15g/L，大豆蛋白胨20g/L，CaCl₂ 0.1g/L，酵母提取物1.5g/L，3-吗啉丙磺酸10.5g/L，pH 7.2。

本发明实施例所涉及的肠杆菌的种子培养基为LB培养基，配方是：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；发酵培养基为TB培养基，配方是：胰蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油40g/L，K₂HPO₄ 9.4g/L，KH₂PO₄ 2.2g/L。

实施例1基因表达载体构建

以S.venezuelae ATCC 15439的基因组为模板，分别以引物VenA-F/VenA-R，VenD-F/VenD-R和pDR4VenC-F/pDR4VenC-R(表1)对二萜合酶的基因venA，香叶基香叶基焦磷酸合酶基因venD和细胞色素P450酶基因venC进行PCR扩增，反应体系如下：5×PrimeSTAR GXLBuffer 10μL，200μM dNTPs，4μL DMSO，上下游引物各0.3μM，DNA模板适量(10-100ng)，高保真聚合酶(PrimeSTAR GXL DNA聚合酶)2.5U，ddH₂O补足至50μL；反应条件为：98℃预变性5min，98℃变性30s，60℃退火15s，68℃延伸(1kb/min，根据目的片段长度设定时间)，反应35个循环，最后68℃延伸10min。基因venA，venD和venC的PCR产物经核酸纯化试剂盒纯化后，利用一步克隆试剂盒将venA和venD分别整合到NdeI酶切消化后的线性pET28b分别得到大肠杆菌中的蛋白表达质粒pET28b-venA和pET28b-venD；进一步，为了构建venA和venD的共表达载体，以pET28b-venA作为模板，利用引物28bVenA-F/28bVenA-R进行PCR得到线性化质粒。随后，以pET28b-venD作为模板，利用引物T7VenD-F/T7VenD-R进行PCR得到包含T7启动子和终止子序列和venD的DNA片段，并克隆到上述准备好的线性化pET28b-venA上得到包含2个T7启动子的venA和venD的共表达载体pET28b-venAD。

同样，以如上方法在基因venA，venD和venC的PCR产物经核酸纯化试剂盒纯化后，利用一步克隆试剂盒将venC整合到SpeI和KpnI双酶切线性化的pDR4-kasOp*得到表达载体pDR4-kasOp*-venC。

表1：实例中用到的引物序列

实施例2构建重组大肠杆菌，发酵生产委内瑞拉烯A

将pET28b-venAD转化到提前制备好的高产二甲基丙烯基焦磷酸和异戊烯焦磷酸的大肠杆菌工程菌Eco-P(Escherichia coli BL21(DE3)/pACYC-mavEmavS&pTrc-low)化学感受态中，得到自给自足生产委内瑞拉烯A(venezuelaene A)的大肠杆菌工程菌Eco-P/pET28b-venAD。

从LB固体平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，15g/L琼脂粉)上挑取Eco-P/pET28b-venAD接种到20mL含有50μg/mL卡那霉素,25μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中，于37℃,220rpm过夜培养。然后，种子液按照体积量1:100的比例转接到2L含50μg/mL卡那霉素,25μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄霉素的TB培养基(胰蛋白胨12g/L，酵母提取物24g/L，甘油40g/L，K₂HPO₄9.4g/L，KH₂PO₄ 2.2g/L)中于37℃，220rpm培养。当OD₆₀₀到达1.0-1.5，加入终浓度为0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于18℃，220rpm的条件下诱导蛋白表达并生物合成委内瑞拉烯A。

委内瑞拉烯A的分离纯化及结构鉴定

待重组大肠杆菌Eco-P/pET28b-venAD发酵3天后，加入等体积的乙酸乙酯萃取三次，利用旋转蒸发仪蒸干萃取液得到浸膏。然后，浸膏再用50mL正己烷萃取四次从而去除极性大的组分。最后，正己烷萃取液蒸干，并溶于乙腈用于反相C18色谱柱半制备获得委内瑞拉烯A。具体的色谱柱为Waters XBridge^TM C-18 column(10×250mm,5μm)，洗脱程序为：100％甲醇洗脱30min，流速为2.5mL/min。最终得到的委内瑞拉烯A经氮气吹干后为无色透明油状，比旋度 ＝-20°(c 0.165,CH₂Cl₂)，并有持久保持、令人愉悦的香味。进一步，为了完成委内瑞拉烯A的结构鉴定和解析，取10mg委内瑞拉烯A溶解于0.5mL色谱纯乙腈中，于4℃自然挥发，约一周后形成了针状晶体供X射线单晶衍射分析得到其三维结构(附图1)。基于新化合物委内瑞拉烯A(分子式：C₂₀H₃₂)的化学结构(附图2)，以及相应的紫外可见光谱(附图3)，气相质谱(附图4)，核磁共振谱图(附图5-12)分析，将其化学位移归属于表2。

表2：实施例中委内瑞拉烯A的

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)和¹³C NMR(151MHz,CDCl₃)化学位移归属

实施例3构建重组菌株S.venezuelae ATCC 15439/pDR4-kasOp*-venC，饲喂委内瑞拉烯A生物转化得到委内瑞拉烯B

从MS培养基(豆粉20g/L，甘露醇20g/L，琼脂粉20g/L)上收集培养5-7天的新鲜S.venezuelaene ATCC 15439野生型的孢子，重悬于5mL 2×YT培养液(胰蛋白胨16g/L，酵母提取物10g/L，NaCl 5g/L)。用等体积2×YT溶液洗涤3-5次后，6000rpm离心2min后，将孢子悬液浓缩至500μL。于50℃热激10min后，孢子悬液冷却至常温。分别取100μLS.venezuelaene ATCC 15439野生型的孢子悬液与100μL提前准备好的大肠杆菌Et12567/pUZ8002&pDR4-kasOp*-venC混合，分别均匀涂布于含50mM MgCl₂和50mM CaCl₂的MS平板上。于30℃培养16h后，每个MS平板用溶有25mg潮霉素和0.5mg萘啶酮酸的1mL无菌水覆盖，待干后，重新放置于30℃条件下培养。待3-5天菌落长出后，挑取单菌落到含25μg/mL萘啶酮酸和50μg/mL潮霉素的MS培养基。约3天产孢后，接种到4mL2×YT培养液中，28℃，220rpm培养2天后提取基因组供PCR验证基因型，得到正确的即为重组菌株S.venezuelae ATCC 15439/pDR4-kasOp*-venC。

从MS平板上挑取工程菌S.venezuelae ATCC 15439/pDR4-kasOp*-venC的单克隆接种到500mL 2×YT培养液中。30℃，220rpm培养2天后，按照体积量1:10的比例转接到5LSCM培养基(可溶性淀粉15g/L，大豆蛋白胨20g/L，CaCl₂ 0.1g/L，酵母提取物1.5g/L，3-吗啉丙磺酸10.5g/L,pH 7.2)中。30℃，220rpm培养12h后，以终浓度5mg/L饲喂委内瑞拉烯A，继续培养7天，从而实现委内瑞拉烯A到委内瑞拉烯B的生物转化，经GC检测转化率可达95％(附图13)。相比而言，对照组的野生株S.venezuelae ATCC 15439中委内瑞拉烯的生物合成基因簇在常规培养条件下是沉默的，因此无法实现饲喂的委内瑞拉烯A到委内瑞拉烯B的生物转化(附图13)。

委内瑞拉烯B的分离纯化及结构鉴定

将上述5L S.venezuelae ATCC 15439/pDR4-kasOp*-venC的发酵液加入等体积的乙酸乙酯萃取三次后得到的萃取液利用真空旋转蒸发仪蒸干。得到的浸膏再用50mL正己烷萃取四次去除极性大的组分后，萃取液蒸干溶于乙腈用于反相C18色谱柱半制备获得委内瑞拉烯B。具体的色谱柱为Waters XBridge^TM C-18 column(10×250mm,5μm)，洗脱程序为：100％甲醇洗脱30min，流速为1.5mL/min。最终得到委内瑞拉烯B经氮气吹干后为白色粉末，比旋度 ＝-113.1(c 0.065,CH₂Cl₂)并有类似委内瑞拉烯A的令人愉悦的香味。结合紫外可见光谱(附图14)，气相质谱(m/z＝286，附图15)及高分辨质谱([M+H]⁺:calc.287.2369；obs.287.2357，附图16)，核磁共振谱(附图17-23)分析，确定了新化合物委内瑞拉烯B的化学结构(附图2)，并将其化学位移归属于表3。

表3：实施例中委内瑞拉烯B的

¹H NMR(600MHz,CDCl₃)和¹³C NMR(151MHz,CDCl₃)化学位移归属

实施例4四环二萜类化合物委内瑞拉烯A(venezuelaene A)在制备香料中的应用

常温条件下，四环二萜类化合物委内瑞拉烯A(venezuelaene A)以浓度1mg/mL溶解于挥发性溶剂中，例如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，会展现出持久的淡淡的木香，类似于香紫苏醇。并且，当真空条件下通过旋转蒸发获得委内瑞拉烯A油状液体时，其会呈现出类似榴莲的浓郁气味。基于委内瑞拉烯A的芬芳特性，且通过体外测试无细胞毒性，预示其可以广泛应用到香精香料制备工业上，有望替代香紫苏醇等二萜香料。

实施例5四环二萜类化合物委内瑞拉烯B(venezuelaene B)在制备香料中的应用

常温条件下，四环二萜类化合物委内瑞拉烯B(venezuelaene B)以浓度1mg/mL溶解于挥发性溶剂中，例如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，会展现出持久的淡淡的木香，类似于香紫苏醇。并且，在真空条件下通过旋转蒸发获得委内瑞拉烯B的油状液体时，其会呈现出类似榴莲的浓郁气味。基于委内瑞拉烯B的芬芳特性，且通过体外测试无细胞毒性，预示其可以广泛应用到香精香料制备工业上，有望替代香紫苏醇等二萜香料。

序列表

<110> 山东大学，中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一类四环二萜类化合物及其制备方法与应用

<141> 2019-10-30

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1161

<212> DNA

<213> 委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）ATCC 15439

<221> 基因venA的核苷酸序列

<400> 1

atgcagcaac gcctccgccc gcttccgccg atctggagaa ccaaggtgat caccgacgtc 60

gacctcaccc gtcgcctcct gcccggtgac gggccgggag agttcttcct gccgccgctg 120

ccgcggctgc tgcccgcggg ctaccacccc gacgccgccc gcatcgagat cgcctccaac 180

ggctgggtgc ggcggatgct ggcggactgc ttcgactccg aggagtcgct gctgttcttc 240

ctgcgtcagc gtaacgggat ctacgggccg ctgacggtgc cgtacgccga ggcggacagg 300

gcccagaaca tcgccgactg gtaccagttc gtcacggtga tcgacagctt cgtctccgac 360

gaggcggcac tgggcgccga ccacgcggcg gccgccgaga ccttcgccgc cgtcgtcgcc 420

gacctgcgcg agggcggggc cggcggcccc gccgcgagcc tgtacggccg cgccgcccag 480

gacctgtggc ggcgtatcgc ggccgggatg agcgcacggc aggtcgatcg gctcgtcgcg 540

gccctcgagg cgttcctgcg cgggtgcgcg gaggagatcc gcagcaaact cgacaagcag 600

gtaccgcact tcgaggcgtg catgcgggtg cgggtcgaca gcttcgggtg cgagttcctg 660

gaactgctca ccgagtacgc ggccgaggtc gacatgagcc gggccgcgac agagggcctg 720

ttcgacgagg tccaccacca cggcatgcgg cagctgatcc tcgtcaacga cctgctctcg 780

tggcgcaagg agtacgccca gcgggacacc atgacgaccg tccgcgtgct gtgcgaggtc 840

gaagggcttg agctgcagga cgccgtcgac cggctgtgcg ccctcgtgga gcaccacgaa 900

cgcgcctaca tcacggcacg cgacgcggtg ctggccggcc cccacgggca ccgcgaggac 960

gtccgcgcct atctgtcggg gctcgaccat ctgatcggcg gaagccagga gttcgagtat 1020

ctgacgccgc gctacttcgg cgacggctcg gtgtgggacg gctcgacctc cggctggatc 1080

agtctcaccg cgtcggtggc ccgcttccgt gacgcacccg ctcccgcgcc gagcgcccga 1140

cccacccgac cgctggtttg a 1161

<210> 2

<211> 1437

<212> DNA

<213> 委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）ATCC 15439

<221> 基因venB的核苷酸序列

<400> 2

ttgaggagcg ccgtgaccac cgtctcgcca ccgccccgca cgatgtccta cgcgctcgcg 60

cccggggccc tgcccctgct cggccacgcc gtgccgctgg cccgccgacc gctggagttc 120

ctgaccgggt tgccccggca cggggacctg gtggaggtcc ggctggggcg ccgccccgcc 180

ctcatggtct gccaccccga gttgatcaag cgtgtactgc tggagccgcg gaccttcgac 240

aagggcgggc cgctgttcga gaaggccgag caactcgtcg gcagcgggct gttcgcggcg 300

acctgggagc cgcaccgcag gcagcggcgg atgatgcagc cgggcttcca caagtcgcgg 360

atgcccgggt acgtggcggt gatgcggcag gagatcgcgg cgctgctcga cggctgggcc 420

gacggccagg aacgcgacgt acgcgatgag atgcacacgg tgacgctccg catcgcctcg 480

cgcaccatgt tcaccaaccc gatgagcggg cgcgccgcgg ccgaggtgca ggagtgcatg 540

ccgatcatca accgcggcgt ctacaagcgg atggtcgcgc cgaccgcgct gctggagaag 600

ctgcccaccc gggagaaccg cgagttccag ctcgcgcacg agcggatgga gcaggtcgtc 660

gacgagacga tcgagcagta ccgcagtgcg ggcgtcgacc acggcgacct gatgtcgatc 720

ctgatcggcg cggtcgacga gggctccggg cagaacatgt ccgagacgga gatccacaag 780

caggtcatga cgctgctggc cggcggcatg gagacgacgg cgaacgcgat ctgctcggcc 840

ctgcacctga tcaccgagca ccccgaggtc gaacggcggc tgtgcgcgga gctcgacgag 900

gtgctggccg gcaggccgcc ggagttcgag gaccttcccc gcctgccgta tctgtaccgg 960

gtgctgtacg agaccctgcg gatccgtccg ccggtgtggc tgctgacccg gatgaccacg 1020

tgcgacaccg agctgggcgg ccaccgcatc ggccgggaca ccatcgtgct gctcagcccc 1080

tatctgctgc accacaaccc ggacctgttc gcccggcccg agacgttcga cccggaccgg 1140

tggctgccgg agcgcgtcga cgacatcacc gaggccgcca tgcagccctt catcatgggc 1200

aaccgcaagt gcatcggtga caagttcgcg ctgaacgagg cgatgatcgt catcgcgacg 1260

atcctgtcgg gctggtcgct tcggatgatc ccggacgcca agcgggtctc gctgcccgag 1320

gcgacgctcg gccccggccc gatgccgatg gtgctgcacc gccgcgccgc cgcgcatcac 1380

gccccggtgc cctcggcccg accgggcgaa tgcccctacc agggcgggcg ttcatga 1437

<210> 3

<211> 1398

<212> DNA

<213> 委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）ATCC 15439

<221> 基因venC的核苷酸序列

<400> 3

atgacctggg ccgctgcggg accggccgag gccccgcacg ggctgccggt cgtgggccat 60

gccgtgcagt tgtggcggcg cccgctgccc ttcctgcgtg agctgtccgg gcgcggtgac 120

ctcgtgacgc tgcgcctggg ccgccaccgc gcctatctgg cgtgcggcat cgacgcggtg 180

cgcaccgtgc tgcacgatcc gcggacgttc gacaagggcg gcccgctgtt cgagaaggcc 240

cggctgctgg tgggtgacgg tctggtcagt tcggacttcg ccacgcaccg caggcagcgc 300

ctgctgatgc agcccgcgtt cggcacctcg cggcttcccg gctacaccgg gctgatggcc 360

gagcagatcg acacggcgct ggaccggtgg cagcacggcc ggacactcga cgtgggccgg 420

gagatgcaca cgctggccct cgaggtcgcg gcacggacgt tgttcggtgc ccacctgggc 480

gagcgggccg tcaccgaggt cgtcgcgtgc atgccgctgg tcatgcgggg tgtctaccgg 540

cgcatgctcg tcccggccga ctgggtgcac cgcctgccgc tgcccgccaa ccgccgcttc 600

gaccgggccc gggccacgat gcaccgcgtc atcgccgaca ccgtccgctc ctaccgcgac 660

gccgggaagg accacggcga cgtcctgtcg atcctggtga gctcccgcga cgagcacggt 720

acgtcactga gcgacgccga gatccacgac caggtcatga cgctgctcat cggggcgacc 780

gagcccccgg gctccgcgct gacctgggtg ttccagctgc tgtcggagca tcccgaggcc 840

gagcgcgccc tgcgggccga ggccgacgac gtgctgcgcg gcaggccggc cggcgccctg 900

agcgcggcgg acctggcgcg cctggagcac acgcggcaca tcgtgctcga ggcgctgcgg 960

ctctacccgc cggcgtggct gctcagccgc gtcgccacca aggacaccga ccttatgggc 1020

catccggtgc ccaagggtgc cacggtgctg ttcagcccgt accaactcca ccatgaccag 1080

gacgtgttcc cgcatccgtc gcgcttcgac ccgggccgct ggcgctcccc ctcccccgcc 1140

gcccgcgccg cactgctgcc cttcggggcc ggcaaccgca agtgcatcgg cgacgaagtg 1200

gccctgacgg aactgtctct cgcggtcgcc gccgtggcgt cccggttcag gctgcgggcc 1260

gttcccggta cgacggcacg gcccctcgtc cgtgcttcgc tcggtgccga gcacgtggtg 1320

ctgagagtcg aggcacgtac ccccctcggc gcggccgccg gcggcgcgtc ggtcgggtcc 1380

cgggcggtgg cgtcatga 1398

<210> 4

<211> 1080

<212> DNA

<213> 委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）ATCC 15439

<221> 基因venD的核苷酸序列

<400> 4

atgacccagg cgacactgtc ggccgttctc gtggacgccc cgctgcgccc gcccgtcgag 60

ggcatgcggc ccaccgcggc gtacggtgtg ctggtcgggc ggctgggagc cgccaccgtg 120

cacgcggacc tgcgggcctg cctggagggc atcgacaccg tcgtccgcgc cgcgccgctg 180

gtcatcccgc cggccatggc cgacgtcttc tcgggtggca aacggctgcg tccgctgctg 240

gtcctggccg gcgcgcacgc cgccggcccg ccgtcggcga gcacgcgcgg ccgcgccgtg 300

agcggtgccc gtgccgtgga actgctgcat ctggcgagtc tcgtccacga cgacatcatg 360

gacgaggcgg tgacccggca cggggtcgcg accatcagcg cacgggccgg caacagccgc 420

gccctgctcg ccggcgacta cctcatcggc cacgcgcaca tcgccgcttc cggcctcggc 480

gccgaggcgg gaactctcct gggccacacc ctcgtgcggc tgtgcgaggg ccaggccgag 540

gaagcctcca cgctcttcga cgccgaccgc ggtgaagagt cgtacttcag ggcgatcggc 600

gggaagaccg gtgccctgat cgacgcggcg tgccgcacgg gcgcgctcgc cgcaggcctt 660

gacgccacca cgacccgggc cctgggacgc ttcggccacc atctcggcgt ggggttccaa 720

ctcctcgacg acatgcttga cctgacggca agtcatgcct ctgcgggcaa gccggtgggg 780

cacgacatcg ccaacggcgt ctacacctat cccacgctct gggcgctgcg ccgcgacccc 840

gggctgcggc gactccttga ggaactcgcc cggtgcgaag ggccccgcac cgggccggcc 900

ggcgaggcgg cccaccgggt ccgtgcctcg ggtgcgctca ccgcgacccg gcgggcgatc 960

gcccgtcggc gtgaacgctg cctgggaatc ctggacgagg cggtcgacgg catcggcccc 1020

gacggcgtcg gcctgctggc cgatctcgcc atcgccgtcc tgagccaccg cgacggatga 1080

一类四环二萜类化合物及其制备方法与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。